全 文 ：当归补血汤对组胺引起的血管内皮细胞单层通透性增高的作用
上海中医药大学中药研究所 ( 200032)　　胡之璧 　樊　懿　韩之芬* * 　吴大正　宋纯清
摘　要　从新生牛主动脉分离获得单个内皮细胞 ,培养于微孔滤膜上直至形成致密单层。 通过灌流 hanks液或含
5 g /L白蛋白的 hanks液后 ,测定经 10- 4mo l /L组胺溶液处理或经 10- 4 mo l /L组胺溶液加 10- 4 g /mL当归补血
汤处理的液体滤过系数 (Kf )、液体滤过流量 ( Jv )和蛋白质渗透压反射系数 (σ)。结果表明内皮单层经组胺处理后 ,
Kf 和 Jv降低 ,σ升高 ;而当归补血汤能够抑制因组胺造成的 Kf 和 Jv降低 ,以及 σ升高。说明组胺能够引起血管
内皮单层通透性的增加 ,而当归补血汤能够减轻组胺造成的内皮单层通透性的增加 ;其作用机制需进一步研究。
关键词　当归补血汤　组胺　内皮单层　通透性
Influence of Blood Replenishing Angelica Decoction on Enhanced
Endothelial Permeability Induced by Histamine
　　 Institute of Chinese Ma teria Medica , Shanghai Univ ersity of TCM ( Shanghai 200032)　 Hu Zhibi, Fan Yi, Han Zhifen,
Wu Dazheng and Song Chunqing
Abstract　　 Blood Replenishing Angelica Decoction [ Danggui Buxue Tang ( DGBX T ) ] is a w ell
know n TCM prescription composed of Radix Angelicae Sinensis and Radix Astragal i with the actions of
inv igo rating “ Qi” and enriching blood. It s action to curtail endothelial permeabi li ty induced by histamine
w as studied. Endo thelial cells isolated f rom the aor ta o f neonatal calf w ere cul tured on polycarbona te mi-
croporus fi lter membrane to develop a conf luent endo thelial monolayer. After purfused w ith either plain
Hank s balanced salt so lution o r that containing 5 g /L albumin, the monolayer w as t reated wi th 10- 4 mol /
L histamine for 30 min ei ther wi th or w ithout preincubation fo r 60 min w ith 10- 4 g /mL o f DGBX T. Fluid
fi lt ration coef ficient ( Kf ) , fi lt ra tion vo lume( Jv ) and o smo tic reflective coefficient (σ) of protein w ere then
measured. The finding s show ed that DGBX T could curtai l the low ering of Kf and Jv and eleva tion ofσ in-
duced by histamine, indicating that DGBX T could inhibi t the action of histamine on endothelial permeabi li-
ty , but i ts mechanism of action needs fur ther study.
Key words　　 Danggui Buxue Tang ( DGBX T) ( Blood Replenishing Angelica Decoction)　 histamine
　 endothelial monolayer　 permeability
　　当归补血汤是经典的补气生血代表方 ,由黄芪
和当归两味中药组成。 目前我国对该方的两味中药
进行了较为深入的化学成分和药理、药效的研究。认
为当归补血汤“补气生血”药效环节主要在于促进机
体免疫功能、改善血象 (血虚 )、刺激骨髓造血机能
等 [1～ 3 ]。上述机制还不能完全阐明当归补血汤“补气
生血”的内涵。长期血虚能引起机体免疫功能的低
下 ,使体内许多非感染性炎症介质如组胺、白三烯、
缓激肽、 5-羟色胺等释放 ,导致血管通透性和细胞通
透性的增加 ,进一步加重血虚的程度。当归补血汤潜
在的功能有可能通过抑制血虚时血管内皮炎症介质
的释放 ,改善血管内皮的通透性 ,维持机体的内环境
稳定。为此 ,本实验应用血管内皮细胞单层通透性测
量方法 ,观察当归补血汤对组胺造成的血管内皮细
胞单层通透性增高的作用。
1　材料与方法:
1. 1　材料和仪器:
新生小牛主动脉 (上海动物园 ) ; M199培养基
( Gibco) ;胰蛋白酶 ( Serva ) ; EDT A( Amresco ) ;胎牛
血清 (华美生物工程公司 ) ;青霉素 (苏州第二制药
厂 ) ;链霉素 (上海四药公司 ) ;白蛋白 ( Sigma ) ;考马
氏亮蓝 G-250( Amresco) ;混合纤维素微孔滤膜 (上
海医药工业研究院 ) ;针式滤器 ( Ann Arbo r Mich) ;
Uvikon 810分光光度计 (日本、岛津 ) ,实验中所用
的当归补血汤由我所中药化学研究室提供 ,按原方
剂量的 250倍浓缩提取 ,每毫升相当于生药 30 mg。
·756· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 10期
Address: Hu Zhibi, Ins titute of Chines e Materia Medica, Shangh ai Universi ty of TCM, Shanghai胡之璧　女 , 64岁 ,研究员、博士生导师 ,中国工程院院士 ,德国理学博士 ,中药研究所所长 ,国家有突出贡献的细胞生物学家。学术专长为生药学、植物化学和生物工程学。 已发表论文 30多篇 ,论著多部 , 8次获国家级、部级和市级科研成果奖。
* * 本校基础医学院机能综合实验室
1. 2　细胞的培养与接种
1. 2. 1　内皮细胞 ( endo thelia l cells, EC)分离与传
代 [4 ]:新生小牛经放血、处死后 ,取长约 10 cm的降
主动脉 ,快速置于 4℃无钙、镁的 hanks液 (D-HBS
液 )中。 3 h内用 D-HBS液洗净血液 ,剥离血管外结
缔组织 ,结扎动脉下端及翻出动脉内面 ,移入含
0. 25% 胰蛋白酶、 0. 025% EDTA的 D-HBS液中。
在 37℃ 下消化 10～ 15 min,用 M199液 (含 20%
胎牛血清、 100 U /mL青霉素、 100 U /mL链霉素 )
终止消化 ,通过离心机以 100 g离心力离心 10～ 15
min,弃上清液 ,获得 EC。换上新鲜的 M199液中进
行接种 ,接种密度为 5× 104 /mL,接种后置于 5%
CO2培养箱中培养。在接种后 6～ 8 h内吸去悬浮的
EC,加入新鲜的 M199培养液 ,每 2天换液一次。培
养 1周后 ,用 D-HBS液将细胞洗涤 2次并在含
0. 25% 胰蛋白酶、 0. 025% EDT A的 D-HBS液中
进行消化 ,以 1∶ 2传代率进行传代 ,选用第 2～ 3代
细胞进行实验。
1. 2. 2　微孔滤膜的处理和接种 [ 5 ]:将微孔滤膜 (混
合醋酸纤维滤膜 ,直径 25 mm、孔径 0. 45μm)浸入
50℃、 0. 5% 醋酸 20 min,用 25℃ 蒸馏水冲洗 2
遍 ,加入 0. 5 g /L明胶 ,在 50℃ 下孵育 60 min,取
出烘干 ,经高压蒸汽消毒后备用。处理后的滤膜置于
直径 30 mm的培养皿中 ,用 2% 明胶粘贴于内底
面 ,置于超净台上 ,室温下干燥 3～ 4 h。致密生长在
50 mL培养瓶内的 EC经 0. 25% 胰蛋白酶消化后 ,
接种在 2张滤膜上。接种密度约为 2× 105 /cm2 , 8～
10 d后在滤膜上形成致密 EC单层可用于实验。
1. 3　实验分组: 实验前 ,先将空白滤膜 (不含内皮 )
漂洗后均匀涂敷小牛血清 ,置入滤器中 ,测定其背景
的通透性。
对照组: 将接种在滤膜上的 EC单层置于正常
的 HBS液中孵育 30 min,置入滤器测定其正常通
透性。
组胺组: 将接种在滤膜上的 EC单层置于含
10- 4 g /mL组胺的 HBS液中孵育 30 min,置入滤器
测定通透性的变化。
当归补血汤组: 将接种在滤膜上的 EC单层置
于含 10- 4 g /mL当归补血汤的 HBS液中孵育 30
min后 ,加入 10- 4 g /mL组胺刺激 30 min,置入滤
器测定通透性的变化。
1. 4　 EC单层膜通透性测量 [ 6]:将处理过的含 EC
单层的滤膜装入针式滤器 ,上腔加 HBS液和 /或含
白蛋白 ( 5 g /L)的 HBS液灌注 ,维持液体的高度
( H)为 25 cm。灌注时先平衡 5min,而后收集 5～ 10
min液体 ,计量体积 (重量法 ,设 ρ= 1)和蛋白浓度
(考马氏亮蓝法 )。
渗透压反射系数 σ按以下公式计算:
σ= 1- C F /CP
σ根据蛋白浓度算出 ,CF与 CP 分别是上下腔收集
液中白蛋白的浓度。
滤过系数 K f按以下公式计算:
K f= Jv / (ΔP-σ· Δπ)
K f (μL /min· cm2· k Pa )根据灌注液体积算
出 ,Jv为通过内皮单层流量 (μL /min· cm2 ) ,ΔP为
灌注压 (设 ΔP= 2. 45 k Pa ) ,σ为渗透压反射系数 ,
Δπ为胶体渗透压差。胶体渗透压差根据 Von Hof f
定律进行计算: π ( kPa)= C ( mosm /L)· 2. 6( kPa·
L /mosm ) ,其中 C为蛋白毫渗量浓度。
2　结果
2. 1　 EC单层经 HBS液灌流所测的对照 Kf 值为
( 10. 40± 0. 91) μL /min· cm2· k Pa , Jv 值 为
( 25. 48± 2. 24)μL /min· cm2 (n= 5) (表 1)。 EC单
层经 100μg /m L组胺刺激 30 min后 ,灌流 HBS液
所测的 K f和 J v值明显升高 ,说明组胺能够明显增
加 EC单层对液体和小分子物质的通透性。当 EC
单层在含当归补血汤的 HBS液中孵育 30 min后 ,
加入 100μg /mL组胺刺激 30 min,与单纯应用组胺
的比较 , K f和 J v 值明显降低 ,差异明显 ( P <
0. 01)。说明当归补血汤对组胺造成的 EC单层对液
体和小分子物质的通透性的增加具有较强的抑制作
用。
表 1　当归补血汤对含组胺的 Hanks灌流液引起的
EC单层通透性增加的作用 ( x+ s)
组　别 n Kf
(μL /min· cm2· kPa)
Jv
(μL /min· cm2 )
对照组 5 10. 40± 0. 91 25. 48± 2. 24
组胺组 7 14. 87± 1. 76* 36. 44± 4. 32*
当归补血汤组 4 12. 23± 1. 48△ 29. 53± 2. 06△
　　与对照组比较: * P < 0. 01;　与组胺组比较: △ P < 0. 05
2. 2　 EC单层经 5 g /L白蛋白 Hanks灌流液灌流
所测的对照 K f值为 ( 4. 62± 0. 53μL /min· cm2·
k Pa) , Jv值为 ( 11. 16± 1. 11) μL/min· cm2 ,σ值为
0. 52± 0. 02 (n= 5) (表 2)。 EC单层经 100μg /mL
组胺刺激 30 min后 ,灌流 5 g /L白蛋白 Hanks灌
流液所测的 K f和 J v值明显升高 ,σ值明显降低。
说明组胺能够明显增加 EC单层对蛋白质和大分子
物质的通透性。 当 EC单层置于含当归补血汤的 5
g /L白蛋白 Hanks灌流液中孵育 30 min后 ,加入
·757·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 10期
组胺刺激 30 min,与单纯应用组胺的比较 , K f和 Jv
值明显降低和 σ值的明显升高 ,差异明显 ( P <
0. 01)。说明当归补血汤对组胺造成的 EC单层对蛋
白质和大分子物质的通透性的增加具有较强的抑制
作用。
3　讨论
表 2　当归补血汤对含组胺的 5 g /L白蛋白 Hanks灌流液引起的 EC单层通透性增加的作用 (x+ s)
组　别 n Kf
(μL /min· cm2· kPa)
Jv
(μL /min· cm2· kPa) σ
对照组 5 4. 62± 0. 53 11. 16± 1. 11 0. 52± 0. 02
组胺组 7 6. 27± 0. 82* 14. 89± 2. 18* 0. 26± 0. 04* *
当归补血汤组 4 4. 53± 0. 78△△ 11. 38± 1. 81△ 0. 38± 0. 03* △
　　　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01;　与组胺组比较: △ P < 0. 05　△△ P < 0. 01
　　在内皮细胞膜上介导的炎症介质受体有组胺、
缓激肽、血小板激活因子 ( PAF)和细胞因子等。当这
些受体被激活后 ,引起内皮细胞的收缩 ,导致细胞旁
路的开放或跨细胞穿透的膜孔径增宽 ,随之使血管
内皮通透性增加 [7 ]。其通透性增加机制涉及到细胞
外 [Ca2+ ]的内流和细胞内 [Ca2+ ]的释放 ;信号转导
系统的激活 ,包括 G蛋白和磷脂酶 C( PLC)信号、
蛋白激酶 ( PKC)和酪氨酸激酶 ( TK)的激活、以及肌
球蛋白轻链 ( M LC)的磷酸化和去磷酸化等 [ 8、 9]。近
年来 , M LC的磷酸化和去磷酸化的研究倍受重视。
细胞外 [Ca2+ ]的内流和细胞内 [ Ca2+ ]的释放以及
MLC的去磷酸化能够诱导肌动-肌球蛋白间相互作
用 ,中心张力增加 ,引起细胞骨架的变化和细胞间裂
隙形成 [10 ]。应用 [Ca2+ ]内流阻断剂和外源性 cAMP
能够抑制炎症介质所致的内皮通透性增加 [9 ]。
本实验采用内皮单层加压灌注装置 ,精确地定
量 Starling方程中的各个参数 K f、 Jv 和 σ。 在此 ,
K f和 J v值反映的是内皮单层对液体和小分子物
质的通透性 ,σ值反映的是内皮单层对大分子物质
的通透性。内皮细胞单层经含组胺的 hanks液和含
组胺的 5 g /L白蛋白 hanks液灌流后 ,对液体和小
分子物质的通透性以及对蛋白质和大分子物质的通
透性均明显增高。内皮单层经组胺刺激后 ,应用当归
补血汤能够逆转因组胺引起的内皮单层的通秀性增
加 ,说明当归补血汤对组胺造成的 EC单层通透性
增加具有改善作用。根据本实验的结果 ,还不能确定
当归补血汤改善内皮单层的通透性的作用机制 ,进
一步的工作将着重研究当归补血汤在抗炎症作用中
的细胞和分子机制 ,特别是对信号转导系统的影响。
参 考 文 献
1　周件贵 .时珍国药研究 , 1996, 7( 4): 250
2　康　永 ,杜晓峰 ,许　强 . 中成药 , 1997, 19( 12): 38
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6　 Cooper J A, Peter J D V, Fred L M , et al . J Appl, Physiol,
1987, 62: 1076
7　Walter T, Zydi Z, Les zek G, et al . Pf lugers Arch, 1995, 430: 145
8　 Ikeda K, Utoguchi N, Makimoto H, et al . Inf lammation , 1999,
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( 2000-01-31收稿 )
Studies on the Calcium Antagonist Action of Arctigenin
　　 Liaoning Colleg e o f TCM ( Shenyang 110032)　 Gao Yang , Kang Tingguo and Zhang Xiaoyu
Abstract　　 The calcium antagonist action o f arctigenin ( ACT) w as studied in o rder to v erify the ef-
fect of Fructus Arctii fo r th e reliev e of ex terio r syndrome. M uscular contraction of iso lated rat t rachea,
colon, pulmona ry a rtery and thoracic ao rta induced by KCl, that of guinea pig t rachea induced by CaCl2 ,
befo re and af ter the addition of ACT w ere assessed and thei r contraction-response curv es draw n and PD 2
calculated according to Scot t. The inhibi tion rate o f tw o-phase contraction o f guinea pig t rachea induced by
acety lcholine chloride ( Ach) in comparison wi th verapamil ( V ER) w as calculated. Results o f the study
show ed that ACT could non-compa titiv ely antagonize the muscular cont raction of the test specimens w ith
·758· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 10期
高　阳　女 , 1975年出生 , 1998年毕业于辽宁中医学院中药系 ,现为该系 98级药理硕士研究生。