全 文 ：·药剂与工艺·
酸性染料比色法测定骆驼蓬种子总生物碱的含量
沈阳药科大学天然药物化学教研室 ( 110015)　　赵　烽 　张萌佳* *　姚新生
摘　要　以溴酚蓝作为测试用酸性染料 ,在总生物碱与其形成稳定络合物时间范围内 ,利用比色法制定了骆驼蓬
种子中总生物碱的含量。 认为此方法快速简便、准确易行。
关键词　骆驼蓬　总生物碱　酸性染料比色法
Determination of Total Alkaloid in the Seed of Peganum harmala
by Bromophenol Blue Colorimetry
　　 Depa rtment o f Natural Products Ch emistry , Shenyang Pha rmaceutical Univ e rsity ( Sh enyang 110015)　 Zhao Feng ,
Zhang Meng jia and Yao Xinsh eng
Abstract　　 The content o f tota l alkaloid in the seed o f Peganum harmala L. was determined by
bromopheno l blue colo rimetry. It could be considered tha t this is a speci fic, quick and simple method fo r
the determina tion o f to tal alka loid in the seed of P. harmala.
Key words　　 Peganum harmala L.　 to tal alkaloid　bromopheno l blue co lorimetry
　　骆驼蓬 Peganum harmala L. 系蒺藜科骆驼蓬
属多年生草本植物 ,药用全草和种子 ,分布于地中海
沿岸及我国西北部新疆、内蒙古和甘肃等省区 ,多生
于沙漠、草滩、山坡等处 ,藏量丰富。其味辛苦、凉 ,有
毒 ,用于宣肺止咳 ,祛湿解毒 ,新疆民间用于治疗消
化道肿瘤 ,其种子已被收载于新疆地方标准。骆驼蓬
种子主要含有 harmine和 harma line等生物碱类成
分 [1 ] ,此外还有甾体、黄酮、蒽醌、多糖等其他化学成
分。自郑特首次报道了骆驼蓬中的生物碱对消化道
恶性肿瘤有疗效以来 ,最近 10多年国内相继报道采
用骆驼蓬种子治疗消化道肿瘤 ,疗效明显 [2, 3 ]。
结合民间临床用药经验 ,前期实验工作者经过
多年的体内、外抗肿瘤活性考察以及抗癌活性成分
研究证明:骆驼蓬种子总生物碱为抗肿瘤的有效部
位。鉴于以上原因 ,我们对骆驼蓬种子总生物碱的含
量测定方法进行了进一步详细的研究 ,建立了利用
酸性染料比色法测定总生物碱含量的方法。
1　仪器与试药
25型酸度计、 721分光光度计 ;分析纯氯仿、甲
醇 (沈阳化学试剂厂 )。
2　实验部分
2. 1　骆驼蓬种子总生物碱的提取:骆驼蓬种子购自
新疆 ,粉碎后采用溶剂法提取得到总生物碱 ,干燥、
精密称定后以甲醇溶解备用。
2. 2　酸性染料种类及测定波长的选择:按药典方法
配制溴甲酚绿 (变色范围 pH3. 6～ 5. 2黄→蓝 )、溴
酚蓝 (变色范围 pH2. 8～ 4. 6黄→蓝绿 )、溴麝香草
粉蓝 (变色范围 pH6. 0～ 7. 6黄→蓝 ) 3种酸性染料
溶液 ,以及 pH4. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
配制 harmine, harmaline对照品溶液 ( 0. 468, 0. 500
mg /mL)及样品溶液 ( 0. 490 mg /mL)。
在分液漏斗中加入磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液
5. 0 mL,然后分别加入 3种酸性染料溶液各 1. 0
mL,摇匀 ,加入 10 mL氯仿萃取 ,氯仿萃取液作为 3
种酸性染料的空白溶液 ,分别进行紫外扫描 ,随行氯
仿作空白 ,紫外扫描图谱如图 1所示。因溴麝香草酚
蓝空白溶液在 300～ 500 nm范围内的吸光值较大 ,
所以放弃不用。 溴酚蓝和溴甲酚绿空白溶液的吸光
值较小。
在分液漏斗中分别加入 harmine和 harmaline
两种对照品溶液各 30μL,挥干甲醇 ,然后加入磷酸
氢二钠 -柠檬酸缓冲溶液 5. 0 mL,再分别加入溴酚
蓝、溴甲酚绿两种酸性染料溶液各 1. 0 mL,摇匀 ,加
入 10 mL氯仿萃取 ,氯仿萃取液分别进行紫外扫
·660· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
Address: Zh ao Feng , Department of Natural Prod ucts Chemis t ry, Sh enyang Ph armaceu tical Univ ersi ty, Sh enyang赵　烽　女 ,现为沈阳药科大学博士生。 1995年 7月毕业于沈阳药科大学药学系。攻读该校硕士学位。 1997年 9月提前攻读该校博士学位 ,一直在姚新生院士的指导下从事天然产物活性成分的研究。 1998年 1月至 1999年 3月期间留学日本东京医科齿科大学进行合作项目研究。
* * 本校 60期中药系学生
描。随行氯仿作空白 ,紫外扫描图谱如图 2所示。因
harmine和 harmaline与这两种酸性染料形成络合
物的吸光系数有所差异 ,因此选择两种络合物的等
吸光波长作为测定波长 ,即选择在 432 nm处测定
与溴甲酚绿络合物的吸光值 ,在 406 nm处测定与
溴酚蓝络合物的吸光值。
图 1　 3种酸性染料的空白液紫外图
图 2　对照品与溴甲酚绿、溴酚蓝络合物紫外图
2. 3　络合物稳定性考查:分别吸取 harmine对照品
溶液、 ha rmaline对照品溶液以及样品溶液各 40
μL,加入磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲溶液 10. 0 mL,再
分别加入溴酚蓝、溴甲酚绿两种酸性染料溶液各
2. 0 m L,摇匀 ,加入 20 mL氯仿萃取 ,分别在不同时
间测定吸光值。重复 3次 ,取平均值。两种标准品溶
液以及样品溶液与溴酚蓝络合物的稳定性考查结果
如表 1所示 (测定波长为 406 nm)。两种对照品溶液
以及样品溶液与溴甲酚绿络合物的稳定性考查结果
如表 2所示 (测定波长为 432 nm )。由吸光值可以看
出 ,两种对照品溶液以及样品溶液与溴甲酚绿形成
的络合物基本上不太稳定 ,而与溴酚蓝形成的络合
物在 90 min～ 120 min范围内比较稳定 ,故选择溴
酚蓝作为测试用酸性染料 ,测定时间为 90 min, 30
min内完成。
2. 4　最佳测试条件的选择:利用均匀设计实验优选
表 1　两种对照品与溴酚蓝络合物稳定性考查结果
min 0 20 40 60 90 120 150 180 210
harmin e 0. 080 0. 090 0. 102 0. 118 0. 097 0. 100 0. 129 0. 119 0. 075
harmalin e 0. 155 0. 170 0. 196 0. 188 0. 178 0. 176 0. 220 0. 190 0. 187
样　品 0. 111 0. 116 0. 101 0. 096 0. 124 0. 120 0. 156 0. 140 0. 109
表 2　两种对照品与溴甲酚绿络合物稳定性考查结果
min 0 20 40 60 90 120 150 180 210
harmin e 0. 111 0. 115 0. 136 0. 135 0. 145 0. 128 0. 150 0. 132 0. 178
harmalin e 0. 155 0. 173 0. 150 0. 158 0. 166 0. 195 0. 195 0. 189 0. 215
样　品 0. 133 0. 112 0. 130 0. 115 0. 109 0. 116 0. 131 0. 115 0. 146
法 ,按以下实验方案 ,考查了水相 pH值、缓冲溶液
用量、酸性染料用量、氯仿用量对实验结果的影响。
均匀设计实验如表 3所示 (测定波长为 406 nm)。将
表 3　均匀设计实验表
实验号 pH值 缓冲溶液用量 ( m L)
溴酚蓝用量
(m L)
氯仿用量
( m L)
测得吸光值
1 1　 3. 4 2　 3. 0 3　 0. 8 6　 12. 0 0. 404
2 2　 3. 6 4　 5. 0 6　 1. 4 5　 11. 0 0. 520
3 3　 3. 8 6　 7. 0 2　 0. 6 4　 10. 0 0. 425
4 4　 4. 0 1　 2. 0 5　 1. 2 3　 9. 0 0. 239
5 5　 4. 2 3　 4. 0 1　 0. 4 2　 8. 0 0. 301
6 6　 4. 4 5　 6. 0 4　 1. 0 1　 7. 0 0. 280
7 7　 4. 6 7　 8. 0 7　 1. 6 7　 13. 0 0. 297
数据输入计算机均匀设计多元处理系统 ,进行逐步
线性回归 ,得到多元线性方程: Y = 1. 482 6 -
0. 243 5X 1- 0. 031 3X 2。对此方程进行 F检验 ,结
果表明此线性方程具有显著性差异 ,方程结果表明:
影响吸光值的主要因素是缓冲溶液的 pH以及缓冲
溶液的用量。最佳条件:缓冲溶液 pH值为 3. 44;缓
冲溶液用量为 2. 2 mL;溴酚蓝酸性染料用量为 0. 4
mL;氯仿用量为 7. 0 mL。
2. 5　线性关系考查: 精密称取 ha rmine对照品
4. 89 mg ,置于 10 mL容量瓶中 ,加入甲醇至刻度 ,
摇匀 ,分别精密吸取此对照品溶液 40, 60, 80, 100和
·661·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
120μL置于分液漏斗中 ,挥干甲醇 ,然后按照 2. 4
中最佳实验条件操作 ,即分别加入 pH值为 3. 44的
磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲溶液 2. 2 m L,再加入 0. 4
m L溴酚蓝酸性染料溶液 ,摇匀 ,加入 7. 0 m L氯仿
溶液萃取 ,在 90 min时终止反应 ,将氯仿层放出 ,在
406 nm处测定吸光值 ,以对照品用量为横坐标 ,以
吸光值为纵坐标 ,进行线性回归 ,得到以下线性方
程: Y= 0. 118 4+ 8. 98× 10- 3X , r= 0. 999 4。此结果
表明当标准品用量在 19. 56～ 58. 68μg范围内 ,吸
光值与对照品用量呈现良好的线性关系。
2. 6　样品含量测定:精密称取待测样品 3份 ,每份
5 mg ,置于 10 mL容量瓶中 ,加入甲醇定容 ,作为样
品溶液 ,分别吸取 50μL置于分液漏斗中 ,挥干甲
醇 ,然后分别按照 2. 4中最佳实验条件操作 ,在 406
nm处测定吸光值 ,并依据 2. 5中线性方程计算生
物碱的含量。结果见表 4,骆驼蓬种子所含总生物碱
约 5% 。
表 4　样品含量测定结果
样品浓度
( mg /m L)
加入样品量
(μg)
平均吸
光值
含量
(% )
折合生药含量
(% )
0. 534 26. 70 0. 304 77. 4 5. 1
0. 520 26. 00 0. 280 69. 2 4. 5
0. 485 24. 25 0. 278 73. 5 4. 8
2. 7　加样回收率实验: 精密称取 harmine对照品
4. 89 mg ,置于 10 mL容量瓶中 ,加入甲醇至刻度 ,
摇匀 ,作为对照品溶液。精密吸取样品溶液 ( 0. 534
mg /mL) 3份 ,每份 50μL,置于分液漏斗中 ,分别加
入对照品溶液 30, 40, 50μL,挥干甲醇 ,然后按照
2. 4中最佳实验条件操作 ,在 406 nm处测定吸光
值 ,并计算加样回收率 ,结果为 91. 9% (n= 3)。
3　讨论
关于骆驼蓬种子总生物碱的含量测定 ,有双波
长薄层扫描法、紫外分光光度法、以及非水滴定法等
多种方法 ,但是均不十分理想。非水滴定法测定总碱
含量所需标准品量过多 ,且样品溶解于醋酸后颜色
太深 ,致使结晶紫终点变化不明显 ;双波长薄层扫描
法由于不同薄层板间差异较大 ,所以重现性欠佳。我
们对酸性染料比色法进行了比较详细的研究 ,确定
了最佳测试条件 ,建立了利用酸性染料比色法测定
骆驼蓬种子总生物碱含量的方法。
参 考 文 献
1　江苏新医学院编 . 中药大辞典 . 下册 . 上海:上海人民出版社 ,
1977: 1757
2　李春杰 ,刘德玺 ,马　特 ,等 . 新疆医学院学报 , 1987, 10( 1): 27
3　杨小平 ,潘启超 ,李春杰 ,等 . 癌症 , 1991, 10( 6): 463
( 1999-12-30收稿 )
大叶钩藤中表儿茶素含量的测定△
上海中医药大学中药研究所 ( 200032)　　杨　君 　宋纯清　陈　明　王海燕　胡之璧
摘　要　目的: 充分利用中药钩藤的植物资源 ,测定并比较大叶钩藤 Uncaria macrophylla Wall.的叶和钩茎中的表
儿茶素含量。方法: 利用 RP-HPLC测定。结果:钩藤钩茎中含表儿茶素 0. 38% ,叶中含 0. 82%。结论:大叶钩藤中
含有较多的表儿茶素 ,叶中含量大于钩茎中含量。
关键词　大叶钩藤　表儿茶素　 RP-HPLC
Determination of Epicatechin Content inUncaria macrophylla by HPLC
　　 Institute o f Chinese Ma teria Medica , Shanghai Univ ersity of TCM ( Shanghai 200032)　 Yang Jun, Song Chunqing ,
Chen Ming , Wang Haiyan and Hu Zhibi
Abstract　　 Epicatechin content in Uncaria macrophyl la Wall. w as determined by RP-HPLC. As a
resul t, the epicatechin contents w ere 0. 38% in the hook and stem , and 0. 82% in the leaf. Thus i t seemed
to be mo re wo rthw hi le to produce epica techin f rom the leaf ra ther than from the hook and stem.
Key words　　Uncaria macrophylla Wall.　 epica techin　 RP-HPLC
·662· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
Address: Yang Jun, Insti tute of Chines e Materia M edica, Shanghai University of TCM, Sh anghai杨　君　 1988年毕业于吉林大学物理化学专业 ,获硕士学位 ; 1988～ 1998年在沈阳药科大学任教 ,副教授 ; 1998年在沈阳药科大学天然药物化学专业获博士学位 ;现在上海中医药大学做博士后。 先后从事天然药物化学、微生物学及物理化学方面的研究工作 ,参加多项国家和辽宁省课题研究 ,已发表 10多篇论文。△“九· 五”国家重点科技攻关资助项目 ( No. 969030203)