全 文 ：· 综述与专论 ·
R i质粒转化植物用 于
生产天然活性成分的研究进展 (I )
北京 医科 大学药学院 (0 10 08 ) 3常振战 ’ 果德安 郑俊华
摘 要 R i质粒转化植物 产生的发根生 长迅速 , 能合成与 原植物 相同或相 似的次 生代谢物 , 在生
产植物天然活性成分方 面具有广阔的应用前景 。 作者对 iR 质粒的分类及转化植物 的机制 , 发根农
杆菌感染植物 的方法及 发根的产生与鉴定 , 发根培养物 的特点等方面作 了较详细的综述 。
关键词 R i 质粒 转化 发根 ( h a i r y r o o t ) 次生代谢物
70 年代末 80 年代初兴起 的植物基因工
程技术与农杆菌的研究密切相关 。 农杆菌质
粒介导的基因转移系统主要是通过致病农杆
菌 (包括根癌农杆菌 A g or bac t er iu m ut m 代af -
ic en : 和发根农杆菌 A . hr ioz g e ne : ) 进行植物
基因组的直接操作 , 即转化 。发根农杆菌是一
种革兰 氏阴性菌 ,通过把含 R i 质粒 ( r o ot 一 i n -
d u e i n g p l a s m id ) 中的转移 D N A ( T r a n s f e r r e d
D N A
,
T
一
D N A ) 转 移并 整 合到 植 物基 因组
中 ,从而引起植物在形态和代谢上的变化 。 在
形态方面 , R i 质粒诱导快速生 长的 、 非 向地
性 、 高度分支 的发根的形成 ; 在代谢方 面 , iR
质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次
生代谢物且具有遗传稳定性 。 这些次生代谢
物作为药物或药物赋形剂具有较高的经济价
值 。 美国 、 日本 、 德国 、 韩国 、 加拿大等国竞相
开展这方面的研究 。人参皂昔 、 黄连素已通过
发根培养法得以工业化生产 。
1 R i 质粒转化植物诱导发根
1
.
I iR 质粒的分类及转化植物的机制 : 在
自然状态下 , 发根农杆菌可作为毛根病 的病
原菌在某些植物伤 口处诱生发根 。 这一事实
最初 由在苹果树毛根病研究 中得以证实 〔” 。
发根农杆菌宿主范围因菌株不同而异 。 一般
局限于双 子叶植物 , 也有一些裸 子植物诱导
出了发根 。 T e m p e 用发根农杆菌 1 5 8 3 4 菌株
从玉米幼苗上诱导出了发根 , 实现 了发根农
杆菌感染单子叶植物零的突破 〔 2〕 。 目前 已经
诱导出发根的植物多数集中在茄科 、 菊科 、 十
字花科 、 旋花科 、 伞形科 、 豆科 、 石竹科 、 寥科
植物 , 主要是草本植物 , 而木本植物较少有成
功报道 。
发根农 杆菌能从植 物伤 口 处诱导 出发
根 , 原 因在于 含有 R i 质粒 -— 发根诱 导质粒 。 R i 质粒是发根农杆菌染色体外的一个大
质粒 , 带有冠瘦碱 (o p i n e) 合成酶 基 因 , 该基
因在真核的植物细胞 中表达能产生特异氨基
酸衍生物即冠瘦碱 。根据合成冠瘦碱的差异 ,
R i 质粒大体 可划分 为 : A g r o p i n e 一 yt eP (农杆
碱 型 ) 、 M a n n o p i n e 一 t y p e (甘 露 碱 型 ) 、 C u e u -
m o p i n e
一
t y p e ( 黄 瓜 碱 型 ) 和 M ik im o p i n e -
yt eP
。 不同类型 iR 质 粒的致根特性也有 差
异 ,含农杆碱型 R i 质粒的农杆菌通常 比含其
它 3 种类型的农杆菌 的宿主范围大得多 。 iR
质粒通过 T 一 D N A 和 V i r 区 (致病 区 )来转化
植 物 。 V ir 区 位 于 R i 质 粒复 制 起 点 与 T -
D N A 区之间 。 V i r 区基因并不发生转移 ,但
它对 T 一 D N A 的转移十分重要 。 V ir 区 的 7个
A d d r e s s
:
C h a n g Z h e n z h a n
,
C o l l e g e o f P h a r m a e y
,
B e i j in g U n i v e r s i t y o f M e d i e a l S e i e n e e s
,
eB i ji
n g
常振战 男 , 1 9 6 5 年生 。 19 9 4 年 ~ 19 9 7 年在北京 医科大 学攻读博士学位 , 留本 校生化及分子 生物学系任讲师 , 从事药
用植物组织培养 、 遗传转化 、 分 子克隆及 次生代谢物生物合成途 径研究 。 发 表 “ 天山大黄发根培养物 中葱酿化合物的产生 ” ,
“ 掌 叶大黄毛状根培养及培养物 中葱醒类成分分析 ” 等论 文 。
《中草药 》 1 9 9 8 年第 2 9 卷第 1 0 期 。 7 0 5 .
操纵子 V ir A ~G, 除 V i r A 外 , 均处于沉默
状态 〔 3〕 ,植物伤 口产生 的低分子酚类化合物
( 乙 酞丁香酮 、 经基 乙 酞丁香 酮等 )能 以 V ir
A 的表达产物为媒介激活其它 V i r 基因联合
群 , 从而使 T 一 D N A 转移并完成 对植 物的转
化 。 这些酚类化合物可以用来提高发根农杆
菌感染某些植物 的转化率 〔们 , 从裸子植物花
旗松中分离的松柏 素 c( o n i f er i n ) 也可提高某
些裸子植物的转化率 〔 5二。
发根农杆菌转化植物时 , 把 自身 R i 质粒
的 T 一 D N A 上的基 因转移并整合人植物基 因
组 ,这些基因表达后即产生发根 。 也可 以对 R i
质粒进行遗传操作 , 构建载体 , 把外源基因通
过中间载体或二元载体导人发根农杆菌 , 然后
感染 植 物外 植 体 , 外 源基 因 及 R i 质粒 T -
D N A 部分基因便在诱导出的发根或再生植株
中得到表达 。 目前 , 通过插人抗生素抗性基因
或报告基 因高效筛选转化细胞系的载体也已
开发出来 。发根农杆菌已成为把外源基因插入
植物基因组的强有力的工具 。 同时 , 质粒 DN A
的随机插人有可能诱导宿主植物基因组发生
突变 , 已有报道 , 质粒 D N A 的插人改变了母
体植物对特殊生物合成途径的控制 〔 6〕 。
在 转化细胞 中 , T 一D N A 的插人长度 与
发根农杆 菌的类 型有关 。 R i 质粒 农杆碱型
T L
一
D N A 或黄 瓜碱 型 T 一D N A 插 人长度 相
当稳定 〔7〕 ,而农杆碱型 T R 一D N A 或甘露碱型
一
D N A 插人长度则很不稳定 〔 , , “ 」。 例外的是 ,
T L
一
D N A 在转 化烟草 中总 比在 其它转化植
物中短 〔7 · 9〕 。 另一方面 ,转化细胞基因组中插
人 T 一 D N A 的数 目也 与发根 农 杆菌类型 有
关 , 许多 菌株 的转 化 细胞 基 因组 中有多 个
D N A 插入 。 它们在大多数情况下相互独立 ,
也有连在一起的情况 出现 〔9 〕 。 多个 D N A 插
人一个转化细胞基因组 中的原 因可能有 : 两
个或多个发根农杆菌侵染并整合进同一个植
物细胞 ; 或是单个发根农杆菌的两个或多个
T
一
D N A 整合进一个植物细胞 。 后者是插人
T
一
D N A 数 目变化的主要原因 〔` 。〕 。
iR 质粒转化细胞再生 的植株具 有叶皱
。
7 0 6
。
缩 、 叶缘卷曲 、 节 间缩短 、 顶端优势较弱等特
征 〔8 , , ` 〕 。 但某些发根的再生植株表型完全正
常 〔“ , ` 2 〕 。 对发根再 生植株有性 后代 T 一D N A
插人 的遗传分析表明 : 分离类型只与母体植
物的 1 个克隆组成一致 。 虽然此类分析工作
尚少 ` “ , ` 3 〕 , 但结果一致证 明 : 1 条发根起源于
1 个细胞 。 发根这一特性可用于筛选 高产发
根细胞系 。
1
.
2 发根农 杆菌感染植 物 的方 法 : 一般认
为 ,农杆菌的转化过程类似于细菌接合作用 ,
农杆菌的单链 D N A 与特殊的膜蛋 白结合后
被传人机械损伤的植物细胞 中〔`幻 。 发根农杆
菌 感染 植 物 使 用 最多 的是 叶 圆 片法 l( ea f
d i s e )
,最初由 H o r s e h 等转化植物时使用 〔` 5〕 。
原生质体 一农杆菌共培养法 、 整株感染法则使
用较少 。
1
.
3 R i 质粒转化根的产生与鉴定 : 植物在
感染发根农杆菌后 ,病症发生及其形态 与植
物基 因组 、 生理状态 、 感染方式 、 接种后外植
体的环境条件均有直接关系 。 发根农杆菌宿
主范围以外 的植物 自然不能被转化 。 H e m -
s at d 用发根农杆菌感染葡萄时只出现冠瘦瘤
而不出现发根 。 曾用发根农杆菌感染葫芦巴
子叶 , 产生了大量的瘤状物 , 有的子叶在瘤表
面形成很短的根状突起却不能继续伸长为典
型发根 。完整植株能合成抗菌物质 , 一般不易
转化 。 镰田博等认为 ,感染整株旺盛发育的药
用植物一般不会产生发根 ; 实验表明 ,干燥条
件下一般不出现发根 , 在高湿度条件下 出现
典型 发根 。 有的植物即使有 T 一 D N A 插入 ,也
有可能不表现出病症 (产生发根 ) 〔`印 。
R i 质粒 T 一 D N A 带 有合成 生长激 素 的
基 因和冠 瘦碱合成酶基 因 ,转化的植物细胞
可 以产生冠瘦碱并能在不含植物生长激素的
培养基上生长 。 可 以根据冠瘦碱的有无和激
素 自主生长特性筛选转化根 , 使转化细 胞带
有 合适 的选 择标 记 , 如新 霉素磷 酸转 移 酶
( N P T
一
l ) 基 因 、 氯霉素 乙酞转 移酶 ( C A T )
基 因等抗生素抗性基因可 以有效选择转化细
胞 渭一葡 萄糖昔 酸酶 ( G U S ) 基 因 、 荧 光素酶
基因等报告基 因的应用 , 能直接检测外源基
因的表达 , 对于鉴别转化子十分重要 。经过上
述方法的筛选 、 鉴别 ,在抗性克隆及其再生植
株中 ,仍会存在一定 比例的假阳性 , 需进一步
作点杂交 、 S o u t h e r n b l o t t i n g 杂交分析 , 才能
最终确定外源基因是否整合到受体细胞染色
体组 中 。
2 发根培养物的特点
2
.
1 生长迅速 : 发根本质上是一种恶性增殖
的激素自主型的器官 , 生长速度很快 ,可用于
大量培养 。 lF or es 等培养的天仙子发根在 1
个培养周期鲜重增加 2 5 0 倍 。 液体培养金
荞麦发根 , 在 25 d 中 , 发根增殖 1 8 61 倍 , 而
作对照的细胞培养物只增殖 26 . 7倍 〔` 7 , 。
2
.
2 合成 能力 高且稳 定 : H a : in n 等实验 表
明 , 在研究过的大多数植物中 ,次生代谢物的
积累与植物生长都大致呈正相关 。 另一方面 ,
发根是细胞分化而来 的根组织 , 具有遗传稳
定性 ,不仅染色体数 目和亲本一致 ,而且合成
能力 、 合成模型及生长速度也很稳定 。
2
.
3 生物转化功能 : 发根培养物可用于生物
转化 〔` “ , ` ’ 〕 ,川 口 基一郎用人参发根转化洋地
黄毒 昔 产 生 了 强 心 昔 。 M u r a n a k a 〔2 0〕 用 含
aP
r A t
一
G U S 融合 基 因的烟 草 发根 、 颠 茄 发
根 、 拟南芥发 根分别 转化 4一甲基伞形 酮渭 -
D
一葡糖昔酸 , 均产生了 4一甲基伞形酮 。
.2 4 向 培 养 基 中 释 放 代 谢 物 : 有 些 植
物 〔20, ’ 1〕的发根把一 部分次 生代谢物释 放到
培养基中 。 黄花烟草 N i c o ti a n a ur s ti c a 发根
培养物在 16 d 生长期内 ,质量提高 35 倍 , 向
培养 基 中分 泌 的尼 古 丁 高 达 10 m g / m L 。
P ar r 等用烟草属其 它植 物也得 到了相似的
结果 。 发根的这一特性有利于分离提取次生
代谢物 。
2
.
5 繁 殖能力强 : 发根具 有高度 的繁殖潜
能 , 可以制成人工种子长期保存 〔2j 。 U oz u m i
等研究表明 ,带有顶端分生组织或分支的辣
根 A mr o ar ic a ur st i ca n a 发根切 段 能再生 出
整个植株 。 他们用海藻酸钠凝胶包裹发根切
段制成 了人工种子 。 R eP u nt e 等用辣根发根
起源的细胞团制成的人工种子 , 25 ` C 贮藏 60
d 后仍保持再生根的能力 。
参 考 文 献
l 何玉科 . 西北 植物 学报 , 1 9 9 0 ; 1 0 ( l ) : 6 1
2 T a n a k a N
, e t a l
.
A n n P h y t o p a t h o l s o e i J P
n , 1 9 9 4 ; 6 0
( 1 )
: 4 5
3 J
o u a n in L
.
P l a s m id
, 1 9 8 4 ; 1 2
: 9 1
4 S h e ik o l e s l a m S R
, ` t a l . P l a n t M o l B i o l
, 1 9 8 7 ; 8 : 2 9 1
5 M o r r i s J W
, e t a l
.
P N A S
,
1 9 90 ; 8 9
:
3 6 1 4
6 P e z z u t o J M
, e t a l
.
iB o t e e h n o lo g y a n d P h a r m a e y
.
N e w
Y o r k L o n d o n
:
C h a p m a n a n d H a l l
, 1 9 9 3 : 2 9 0
7 B i r o t A M
, e t a l
.
P l a n t P h y s i o l B i o e h e m
, 1 9 8 7 ; 2 5
: 3 2 3
8 D a v id C
, e t a l
.
P l a n t C e l l R e P
, 1 9 8 8 ; 7
: 8 8
9 J
o u a n in L
, e t a l
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 8 7 ; 2 0 6
: 3 8 7
10 D e P i e k e r A
, e t a l
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 8 5 ; 2 0 1
: 4 7 7
1 1 T a y l o r B H
, e t a l
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 8 5 ; 20 1
: 55 4
1 2 P e t i l A
, e t a l
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 8 6 ; 2 0 2
:
2 8 8
1 3 M e k n ig h t T D
,
et a l
.
P l a n t M o l B i o l
,
1 98 7 ; 8
: 4 3 9
14 S t a e h e l S E
, e t a l
.
N a t u r e
,
1 9 8 6 ; 3 2 2
:
7 0 6
1 5 H o r s e h R B
,
et a l
.
S e i e n e e
,
1 9 8 5 ; 2 2 7
:
1 2 2 9
1 6 K a m a d a
,
H
.
e t a l
.
P l a n t C e ll R e p
,
1 9 8 6 ; 5
:
2 3 9
1 7 张荫麟 ,等 . 中草药 , 1 9 9 0 ; 2 1 ( 1 2 ) : 2 3
1 8 M u r a n a k a T
, e t a l
.
A p p M i e r o b i o l Bi o t e e h n o l
, 1 9 9 4 ; 4 0
( 6 )
:
8 4 1
1 9 F l o r e
s
H E
, e t a l
.
P l a n t P h y
s
B i o e h e m
, 1 99 4 ; ( 4 )
:
5 1 1
2 0 M u r a n a k a T
, e t a l
.
B i o s e i B i o t e e h B i o e h e m
,
1 9 9 3 ; 5 7
( 8 )
:
1 3 9 8
2 1 H u Z B
, e t a l
.
P h y t o e h e m i s t r y
,
1 9 93 ; 3 2 ( 3 )
: 6 9 9
2 2 U o z u m i N
, e t a l
·
J F
e r m e n t B i o e n g
,
1 9 9 2 ; 74 ( 1 )
:
2 1
( 1 9 9 8
一
0 4
一
1 3 收稿 )
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《中草药 》 19 9 8 年第 29 卷第 10 期 · 7 0 7 ·