全 文 ：·药理实验与临床观察·
海嘧啶对 H22小鼠完整细胞膜脂流动性及人胃腺癌
细胞内 DNA含量影响的研究
季宇彬 ,张秀娟 ,孔　琪 ,高世勇 ,杨宝峰⒇
(哈尔滨商业大学药物研究所 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　研究海嘧啶对 H22荷瘤小鼠红细胞膜的影响以及对人胃腺癌细胞 DN A合成的影响。 方法　采用荧
光分光光度法及激光扫描共聚焦显微镜进行研究。 结果　海嘧啶可使荷瘤小鼠红细胞微粘度下降 ,膜脂流动性升
高 ,体外实验对胃腺癌细胞内 DN A荧光强度降低 , DNA合成减少。 结论　海嘧啶可改善荷瘤机体的血液循环 ,提
高红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力 ,同时通过影响肿瘤细胞内 DNA的合成发挥抗肿瘤作用。
关键词: 海嘧啶 ;抗肿瘤作用机制 ;膜脂流动性 ;肿瘤细胞 DNA
中图分类号: R979. 1; R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0713 03
Effect of Haimidin on lipid fluidity in erythrocyte membrane and DNA content in
normal and H22 tumor bearing mice
JI Yu-bin, ZHAN G Xiu-juan, KONG Qi, GAO Shi-yong , YANG Bao-feng
　　 ( Institute of Ma teria Medica, Harbin Comercia l Univ er sity , Harbin Heilong jiang 150076, China)
Abstract: Object　 To study the effect of Haimidin( HMD) on ery th ro cy te membrane of H22 ascites tu-
mo r bearing mice and DN A synthesis in human gast ric tumo r cell.Methods　 By f luorescence spect ropho-
tometry and laser scanning confocal micro scopy. Results　 HMD can low er ery th ro cy te microv iscosi ty and
elev ate membrane lipid f luidi ty o f H22 asci te tumo r bearing mice. It also reduced DN A fluo rescent intensi ty
and DN A content of gast ric tumor cells in v itro. Conclusion　 HMD can improve blo od ci rculation o f tumo r
bearing mice, enhance immune adherence of ery throcyte on tumo r cells and displa ys i t s anti tumo r activi ty
by interfer ring DN A synthesis of tumor cells.
Key words: Haimidin ( HMD) ; anti tumo r mechanism; membrane lipid fluidi ty; DN A of tumo r cell
　　 5-Fu ( Fluo rouraci l)抗肿瘤疗效及作用机制已
经证实 ,但作为常规化疗药物存在着诸多副作用 ,尤
其是长期用药引起的骨髓抑制使患者难以长期使
用 [1 ]。而某些中药既具有抗肿瘤作用又能提高机体
的耐受性 ,达到事半功倍的效果。海嘧啶就是基于这
样的指导思想 ,由 5-Fu与海洋中的药用植物海藻、
昆布及植物药黄芪、苦参等组成的新型复方抗癌药
物 ,其抗肿瘤作用已得到肯定 [2 ]。本研究通过海嘧啶
对机体免疫细胞——红细胞的影响及对肿瘤细胞内
DNA的影响 ,进一步揭示其抗肿瘤的作用机制。
1　实验材料
1. 1　动物:昆明种小鼠 ,体重 ( 20± 2) g,雌雄兼用 ,
购自哈尔滨医科大学实验动物中心。 H22荷瘤小鼠:
购自哈尔滨医科大学附属第三医院动物研究所。
1. 2　药品: 海嘧啶:由哈尔滨商业大学药物研究所
研制 ,批号 960517; 5-Fu: 上海制药十二厂 ,批号
961207; DPH: Sigma产品 ,溶解在四氢呋喃中配成
2× 10- 3 mo l /L,保存在棕色瓶中 ,实验前用等渗
PBS缓冲液稀释成 2× 10- 6 mo l /L;肝素钠:上海化
学试剂公司 ,批号 F990320;胎牛血清: Hyclone产
品 ; PI: Sigma产品 ,以生理盐水配成 100μg /mL,避
光放置 ; RNase A: Sigma产品 ,用 PBS配成 2. 5
mg /mL, 80℃～ 100℃加热 15 min,冷至室温后分
装 , - 20℃保存。人胃腺癌细胞:购自哈尔滨医科大
学公共卫生学院 ; RPM I1640培养液: Gibco产品。
1. 3　仪器: 激光扫描共聚焦显微镜 ( Insight Plus-
·713·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2001-01-11基金项目:国家科委生命中心博士基金资助 (项目号: 96-901-06-10) ;中国优秀博士后基金资助 (中博基 [ 1999 ] 17号 ) ;黑龙江省杰出青年基金资助 ( J9906) ;黑龙江省自然科学基金项目资助 (项目号: D9801)作者简介:季宇彬 ,男 , 44岁 ,博士 ,教授 ,硕士、博士研究生导师。 多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究 , 1999年进入哈尔滨医科大学博士后工作流动站工作。
* 哈尔滨医科大学博士后导师
IQ美国 Meridian公司 ) , RF-540荧光分光光度计
(日本岛津 ) , Scp85A低温高速离心机 (日本日立 ) ,
超净工作台 (苏州净化设备厂 ) ,二氧化碳培养箱 (日
本三洋 )。
2　方法
2. 1　 H22小鼠完整红细胞膜脂流动性的测定:无菌
条件下取 H22腹水癌细胞 3 mL,以 0. 9%生理盐水
作 1∶ 3稀释。取已随机分组的小鼠 ,每只腹腔接种
0. 2 mL。于停药次日处死 ,取全血 , 0. 1%肝素抗凝 ,
荧光偏振度的测定见文献 [3 ] ,η= 2p / ( 0. 46- p) [4 ] ,
LFU= 0. 5- p /p
2 [5 ]。
2. 2　人胃腺癌细胞 DNA的测定: 细胞常规复苏、
传代 ,用台盼蓝染色记细胞数量 ,用培养液将其调整
为 2× 105 cfu /mL,分装于各培养瓶中 ,细胞贴壁后 ,
分别换上含各样品浓度的培养液 (阴性对照组用
10% 1640培养液 ,阳性对照组 5-Fu,浓度为 50μg /
m L)。分别于给药后 12, 24, 36, 48 h收集细胞。将不
同浓度的样品和生理盐水 (空白对照 ) 40μL加至 40
m L细胞悬液中 , 5% CO2、 37℃培养箱中温育 48 h
后 ,用 0. 125%胰蛋白酶消化、清洗。 70%冷乙醇固
定 1. 5 h,加入 200μL PBS和 250μL RNaseA, 37
℃共同保温 10 min。加荧光染料 PI 750μL,室温 ,避
光染色 30 min,用 PBS制成细胞悬液 ,在激光扫描
共聚焦显微镜下观察细胞形态 ,并记录细胞荧光强
度 ,以细胞的荧光强度反映 DNA的含量。激发波长
488 nm, 40倍物镜下观察 [6 ]。
2. 3　数据处理: 数据经统计分析后 ,以 x± s表示 ,
组间用 t检验。
3　实验结果
3. 1　海嘧啶对 H22小鼠完整红细胞膜脂流动性的
影响:见表 1。
　　由实验结果看出: 与正常组相比 , H22小鼠完整
红细胞的荧光偏振度增加 ,微粘度加大 ,膜脂流动性
下降 ,经过药物治疗后 ,荧光偏振度普遍下降 ,微粘
度也有不同程度的降低 ,说明膜脂流动性提高 ,其中
海嘧啶中剂量作用效果最好 ,与生理盐水组比较差
异极显著 ( P < 0. 001)。
3. 2　海嘧啶对人胃腺癌细胞 DNA的影响:见表 2。
表 1　海嘧啶对 H22小鼠完整红细胞膜脂流动性的影响
组别 剂量 ( mg /kg ) 荧光强度 微粘度 (η) 膜脂流动性
正常对照 - 　　　 0. 200 6± 0. 072 8 1. 755 7± 0. 961 6 　　 7. 447 8± 2. 327 3
生理盐水 - 0. 243 0± 0. 030 1 2. 137 8± 0. 618 6 4. 355 9± 1. 405 1
5-Fu 25 0. 227 5± 0. 018 2 1. 976 0± 0. 673 8 5. 260 6± 1. 547 2
海嘧啶 100 0. 233 1± 0. 021 1 2. 081 9± 0. 177 2 4. 915 3± 1. 536 0
50 0. 172 2± 0. 056 7* * 1. 277 5± 0. 416 4 11. 037 0± 3. 448 9* * *
25 0. 211 1± 0. 022 3* 1. 817 6± 0. 210 6 6. 477 6± 2. 089 5* *
　　　　与生理盐水组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
表 2　海嘧啶作用 12, 24, 36, 48 h后对人胃癌细胞 DNA含量的影响
组别 细胞数 剂量 作用不同时间 ( h )荧光强度
(n ) ( mg /kg ) 12 24 36 48
生理盐水 30 - 978. 61± 143. 82 　　 892. 69± 138. 63 　　 672. 69± 98. 82 　　 301. 65± 85. 23
5-Fu 30 50 881. 95± 264. 84 678. 43± 112. 15* * 457. 85± 83. 64* * 286. 60± 112. 11
海嘧啶 30 200 897. 70± 172. 54 613. 80± 107. 58* * 431. 19± 194. 05* * 320. 69± 73. 29
30 100 882. 05± 242. 18 641. 33± 139. 43* * 396. 20± 189. 81* * 248. 38± 88. 27*
30 50 939. 42± 165. 89 847. 64± 150. 69 659. 75± 89. 82 315. 99± 81. 11
　　　　与生理盐水组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　用激光扫描共聚焦显微镜可见: 12 h时生理盐
水组细胞为较完整的圆形 ,细胞核形状规则、完整 ,
DN A荧光较强。同一时间段内不同给药组细胞与生
理盐水组相比差异不显著 ,无统计学意义。 24, 36 h
后 ,生理盐水组细胞虽然是圆形 ,但荧光强度略有下
降 ,给药组细胞变化较大 ,细胞核形状不规则 , DN A
分布不均匀 ,荧光强度明显降低 ,与生理盐水组相比
差异显著 (P < 0. 01)。而同一时间段内 ,又以高剂量、
中剂量作用效果最好。 给药 48 h后 ,生理盐水组细
胞形态及荧光强度都有明显变化 ,推测与细胞本身
的生理特性有关 ,给药组与生理盐水组相比 ,只有中
剂量组有差异 (P < 0. 05) ,提示海嘧啶对肿瘤细胞的
作用并不是随着给药时间的延长而增加的。
4　讨论
　　膜的流动性是细胞膜的重要力学特性 ,红细胞
的所有正常生理功能都与细胞膜结构的完整性及膜
脂双层的流动性有关。红细胞膜的流动性对通透性、
变形性、脆性、物质运输、酶的活性都有影响 ,与血清
·714· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
特别是血清脂蛋白成分直接相关 [4 ]。因此 ,研究海嘧
啶对红细胞膜流动性的影响可以从细胞水平和分子
水平探讨其作用机制。众所周知 ,细胞恶性增殖的分
子基础之一即跨膜信号传递链索的异常 ,肿瘤细胞
的恶性转化与再分化可能分别与跨膜信号传递链索
的损伤和修复有关 ,改变或扩增其中的某些分子 ,就
可能引起信号传递链索的失常和分子程序的紊乱 ,
造成细胞的转化和生长失控 ,引起恶性肿瘤。修复和
改变其中的某些分子就可能使损伤了的跨膜信号传
递链索得到修复 ,使恶性肿瘤细胞再分化而促使癌
细胞逆转 ,以上程序涉及到多种蛋白质 ,特别是膜蛋
白和膜脂类。细胞癌变与癌变逆转都与膜流动有
关 [7 ]。本研究证明海嘧啶能降低荷瘤小鼠红细胞膜
的微粘度 ,使膜流动性升高 ,有助于集体红细胞免疫
功能的调整 ,有助于使损伤的跨膜信号传递链索恢
复正常 ,提高对肿瘤细胞的杀伤能力。
DNA分子位于细胞中的染色体、线粒体中 ,是
一种由简单重复单位构成的线形序列所决定的高分
子聚合物 ,几乎存在于所有细胞遗传 ,信息储存在
DNA分子中 ,然后以 DNA为模板合成 RNA,继而
以 RNA为模板完成蛋白质多肽链的合成。在细胞增
殖过程中可将其周期划分为 G1、 S、 G2和 M期 ,肿瘤
细胞周期与正常细胞周期的速率和时间都是相似
的 ,即周期的长短主要由 G1期的长短来决定。因此 ,
理想的药物应该是杀死癌细胞而正常细胞免受其
害。 如绝大多数抗肿瘤药物可以通过直接损伤
DNA、抑制 DNA聚合酶、抑制有丝分裂器 ,抑制拓
扑酶等方式作用于肿瘤细胞 [8 ]。本研究结果表明: 海
嘧啶降低肿瘤细胞内 DNA含量从而发挥其抗肿瘤
作用。 随着给药时间的变化 ,海嘧啶以高、中剂量作
用 24, 36 h效果较好。随着给药时间的延长 ,其作用
并不显著 ,由此可以说明 ,海嘧啶对肿瘤细胞的影响
与其生长周期有关 ,而肿瘤细胞的周期动力学特点
是细胞群主体分布于 DNA合成活跃的 S期 ,我们的
研究结果又发现肿瘤细胞内 DNA含量明显降低 ,因
此 ,可以推测海嘧啶为一周期特异性药 ,其主要特点
是通过影响肿瘤细胞内 DNA的合成而发挥作用 ,但
是海嘧啶是通过何种途径影响到 DNA的生物合成
还有待于进一步研究。
参考文献:
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外医学 -肿瘤学分册 , 2000, 27( 5): 266-268.
1-甲基-4-苯基吡啶离子诱发大鼠小脑颗粒细胞凋亡
蒲小平 ,李晓蓉 ,李慧农 ,李长龄⒇
(北京医科大学药学院 药理室 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　建立 1-甲基 -4-苯基吡啶离子 ( 1-me thy1-4-phenyl py ridinium ion, M PP+ )诱导的大鼠小脑颗粒细胞
凋亡模型。方法　 M PP+ 处理大鼠小脑颗粒细胞 ,分别用甲基绿 -派诺宁染色 , DN A凝胶电泳 ,流式细胞术进行检
测。 结果　浓度为 50μmo l /L M PP+ 使小脑颗粒细胞发生凋亡。 结论　以 M PP+ 为诱导剂建立的大鼠小脑颗粒细
胞凋亡模型 ,可用于研究和帕金森病 ( PD)有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗 PD药物。
关键词: 1-甲基 -4-苯基吡啶离子 ( M PP+ ) ;小脑颗粒细胞 ;凋亡
中图分类号: R285. 51　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0715 04
Induction of rat cerebellar granular neuron apoptosis
by 1-methyl-4-phenyl pyridinium cation
PU Xiao-ping , L I Xiao-rong , L I Hui-nong , L I Chang-ling
·715·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-02-12基金项目:国家重点基础研究发展规划项目课题 , No. G1998051124作者简介:蒲小平 ( 1956-) ,女 ,甘肃人 ,副研究员 ,博士 , 1995年获日本北海道大学药学博士学位 ,现在北京大学药学院分子与细胞药理学系工作。 研究方向:神经细胞凋亡蛋白酶 Caspase-3为靶的药物研究。