全 文 ：·药理实验与临床观察·
海嘧啶对 SGC-7901人胃癌细胞凋亡的影响
季宇彬 ,高世勇 ,孔　琪 ,张秀娟 ,杨宝峰* ⒇
(哈尔滨商业大学 制药工程系 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　揭示海嘧啶的抗肿瘤作用机制。 方法　采用流式细胞仪测定海嘧啶对人胃癌细胞凋亡及细胞周期
的影响 ;采用激光扫描共聚焦技术观察海嘧啶对人胃癌细胞内 [ Ca2+ ]i的影响及 [Ca2+ ]i变化时 Ca2+ 的来源。 结果
海嘧啶可诱导肿瘤细胞凋亡 ,可升高肿瘤细胞内 [Ca2+ ]i的浓度 , [Ca2+ ]i升高时 Ca2+ 来源于细胞外钙内流和细胞
内钙释放。 结论　海嘧啶的抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞凋亡 ,通过开放细胞膜钙通道和引起细胞内钙释放两条途
径升高肿瘤细胞内 [ Ca2+ ]i ,启动细胞凋亡机制 ,从而诱导肿瘤细胞凋亡。
关键词: 海嘧啶 ;人胃癌细胞 ;细胞凋亡 ; Ca2+
中图分类号: R286. 91; R979. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0901 04
Effect of sea pyrimidine on apoptosis of human gastric cancer cell SGC-7901
JI Yu-bin, GAO Shi-yong, KONG Qi, ZHANG Xiu-juan, YAN G Bao-feng
　　 ( Depa rtment o f Pharmaceutica l Engineering , Harbin Commercial Univ er sity , Harbin Heilong jiang 150076, China)
Abstract: Object　 To uncover the anti tumo r mechanism of sea pyrimidine ( SP) , a compound Chi-
nese-Western medicinal preparation containing 5-fluo rouraci l, ex t racts of Astragalus membranaceus
( Fisch. ) Bunge, Sophora f lavescens Ait. and certain sea w eeds. Methods　 Effect o f SP on SGC-7901 gas-
tric cancer cell cycle and apoptosis w ere determined by FCM and the source of Ca
2+
during int racellula r
[ Ca
2+
]i change, observ ed by laser scanning confocal micro scopy. Results　 SP can induce apoptosis of
SGC-7901 tumo r cell, and elev ate it s [ Ca
2+
]i lev el. The source o f Ca
2+
o rigina ted f rom ex tra-cellula r
[Ca
2+ ]i and intracellular Ca
2+
release. Conclusion　 The anti tumor mechanism o f SP is i ts action to induce
apopto sis of tumor cell through opening o f ca lcium channel and release of int racellular calcium to ini tiate
cellula r deg radation resulting in tumor cell apopto sis.
Key words: sea pyrimidine ( sp) ; human gast ric cancer cell; apoptosis; Ca2+
　　海嘧啶是一种中西药复方抗癌制剂 ,由抗癌药
5-Fu ( 5-f luo rouracil, 5-Fu)和中药海藻、昆布、黄
芪、苦参提取的有效成分组方而成的中西药复方抗
癌制剂。近年来 ,随着分子生物学的发展 ,其重要意
义受到广泛重视 ,特别是与肿瘤的关系已成为当前
研究的热点。 新的观点认为肿瘤的发生不仅是分裂
失控导致的细胞过度增生所致 ,同时也可能是细胞
凋亡通路受阻 ,使本该死亡的细胞继续存在而产生
肿瘤。
研究已证实海嘧啶抗肿瘤疗效确切 [ 1, 2] ,为进一
步揭示海嘧啶抗肿瘤的作用机制 ,本研究观察海嘧
啶对人胃癌细胞凋亡及细胞内 [Ca2+ ]i的影响 ,试图
从分子水平阐明海嘧啶抗肿瘤作用机制。
1　材料
1. 1　癌细胞株: SGC-7901人胃癌细胞株 ,由哈尔
滨医科大学公共卫生学院提供。
1. 2　主要化学试剂:海嘧啶由哈尔滨商业大学药物
研究所提供 ,批号: 960517; 5-Fu上海制药十二厂 ,
批号: 960217; Fluo-3 /AM荧光探针 ,美国 Molecu-
lar probe公司 ; RPM I1640培养基 , Gibco产品 ;维
拉帕米 ,江苏恒瑞制药厂 ,批号: 980506; 56℃灭活
小牛血清 ,天津市生化制药厂。
1. 3　主要实验仪器: FACSC ablibur流式细胞仪
(美国 D-D公司 ) , CO2恒温培养箱 (日本三洋公
司 ) ,激光扫描共聚焦显微镜 ( Insugh t Plus-IQ型 ,
美国 Meridian公司 ) ,恒温水浴箱 (厦门医疗电子仪
·901·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2000-04-11基金项目:国家科委生命中心博士基金资助 (项目号: 96-901-06-10) ;中国优秀博士后基金资助 (中博号 [ 1999 ] 17号 ) ;黑龙江省杰出青年基金资助 ( J9906) ;黑龙江省自然科学基金项目资助 (项目号: D9801)作者简介:季宇彬 ,男 ,博士 ,教授 ,硕士、博士研究生导师 , 44岁。 多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究 , 1999年进入哈尔滨医科大学博士后工作流动站工作。
* 哈尔滨医科大学博士后导师
器厂 ) ,超净工作台 (苏州净化设备厂 )。
2　实验方法
2. 1　海嘧啶对胃癌细胞凋亡的影响
2. 1. 1　细胞培养:人胃癌细胞系 SGC-7901常规细
胞复苏后 ,培养于质量分数为 0. 1的小牛血清 RP-
M I1640培养液中 ,置于 CO2培养箱 ( 37℃ ,体积分
数为 0. 05的 CO2 ,相对湿度 95% )培养。 2～ 3 d传
代 1次。
2. 1. 2　分组与给药: 将含有人胃癌细胞 SGC-7901
培养瓶分为 5组 ,每组 10瓶。各组培养瓶中分别加
入海嘧啶、 5-Fu和培养液 ,使海嘧啶 3个剂量组的
终浓度为 50, 100和 200μg /mL; 5-Fu的终浓度为
100μg /mL;其余一组加入相同体积的培养液。然后
放入 CO2培养箱孵育 24 h。
2. 1. 3　流式细胞仪检测细胞凋亡 [3 ]: 1体积细胞悬
液 (约 106细胞 )加 9体积 70% 乙醇 ,于 - 20℃ 固
定细胞 12 h (可保存 2～ 3周 )。离心 ,用 PBS液洗
涤除尽乙醇 ,离心后的细胞重悬于 1 mL PI染液 ,
室温染色 30 min。 用激光 ( 488 nm )或蓝光 ( BG12
滤光镜 )激发后检测红色荧光 , FCM。
2. 2　海嘧啶对胃癌细胞内 [ Ca2+ ]i的影响
2. 2. 1　细胞培养:同 2. 1. 1。
2. 2. 2　分组与给药:用台盼蓝染色记录细胞数量 ,
用培养液将其调整为 2× 105个 /毫升 ,分装于各培
养瓶中。实验共分为 6组 , 4个时间段。 6组分别为
A, B, C1 , C2 , C3 , D组 ,其中 A, B分别为阴性对照组
和阳性对照组 , C1 , C2 , C3分别为海嘧啶高、中、低 3
个剂量组 , D为海嘧啶中剂量加维拉帕米组。 4个时
间段分别为 12, 24, 36和 48 h。细胞培养贴壁后 ,分
别换上含各药品的不同浓度的培养液 ,使各药品终
浓度分别为: B组 50μg /mL, C1组 200μg /mL, C2组
100μg /mL, C3组 50μg /mL, D组为 100μg /mL海
嘧啶和 20μg /mL维拉帕米 , A组则用含 10% 小牛
血清的 RPM I1640完全培养液。 给药分别培养 12,
24, 36, 48 h后 ,收集细胞。
2. 2. 3　细胞内游离 Ca2+ 浓度的测定:胃癌细胞系
SGC-7901加药后分别于不同时间收集细胞 ,消化
后 ,用质量分数为 0. 1的 RPM I1640洗两次 ,用质
量分数为 0. 25的台盼蓝染色 ,计数活细胞为 95%
以上 ,细胞悬液 37℃ 预温 5 min后 ,用 PBS及无
钙台氏液清洗 2～ 3次。加入 100μL Fluo-3 /AM染
液 , 37℃放置 45 min。用适量无钙台氏液制成细胞
悬液 ,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内 Ca2+
的变化 ,并记录细胞的荧光强度 ,以细胞的荧光强度
反映 Ca2+ 的浓度。 实验条件:激发波长 488 nm , 40
倍物镜下观察。
2. 3　数据处理: 数据统计分析进行组间 t检验 ,结
果均以 x±s表示。
3　实验结果
3. 1　海嘧啶对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响: 见
表 1, 2。
表 1　海嘧啶对人胃癌细胞周期的影响
组别 剂量
(μg /mL) 例数
G0 /G1
(% )
G2 /M
(% )
S
(% )
对照组 - 10 22. 20± 5. 06 　 4. 09±1. 27 73. 56± 12. 10
5-Fu 50 10 44. 81± 10. 25 　 0. 03±0. 01 55. 13± 7. 28* *
海嘧啶 50 10 22. 63± 3. 34 11. 01±3. 56 63. 38± 7. 31*
100 10 26. 70± 7. 99 19. 33±4. 67 52. 83± 10. 03* *
200 10 12. 65± 2. 43 31. 36±7. 06 54. 27± 8. 33* *
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
表 2　海嘧啶对人胃癌细胞凋亡的影响
组别 剂量 (μg /m L) 例数 APO(% )
对照组 - 10 0. 15± 0. 04
5-Fu 50 10 0. 17± 0. 06
海嘧啶 50 10 1. 16± 0. 23* *
100 10 1. 14± 0. 20* *
200 10 1. 72± 0. 41* *
　　与对照组比较: * * P < 0. 01
海嘧啶对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的研究结果
表明:海嘧啶具有一定程度上的诱发细胞凋亡的作
用 ,与对照组比较差异显著 ( P < 0. 01) , 5-Fu则基
本没有诱发细胞凋亡的作用。海嘧啶可使 S期细胞
数目明显减少 ,其结果是促进细胞分化为 G0-G1和
G2-M 期 ,但随剂量的加大 ,肿瘤细胞主要停留于
G2-M期。
3. 2　海嘧啶对肿瘤细胞内 [Ca2+ ]i的影响
3. 2. 1　人胃癌细胞给海嘧啶 12, 24, 36和 48 h后
细胞内 [Ca2+ ]i的变化:见表 3。
实验结果表明:海嘧啶可显著升高肿瘤细胞内
游离钙离子的浓度 ( P < 0. 001) ,且具有剂量依赖
性。 维拉帕米组 ( D组 )钙离子浓度处于阴性对照组
和海嘧啶中剂量组之间 ,且与二者相比均具有统计
学差异 ( P < 0. 01)。
3. 2. 2　人胃癌细胞给海嘧啶不同时间后 [Ca2+ ]i的
变化:见表 4。
实验结果表明:海嘧啶作用于肿瘤细胞不同时
间后 ,均可使肿瘤细胞内游离钙离子浓度升高 ,但相
比较而言 ,海嘧啶作用初期 ( 12 h )肿瘤细胞内游离
钙离子浓度升高的幅度最大。
4　讨论
　　细胞凋亡作为机体的一种主动过程 ,与细胞病
·902· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
表 3　人胃癌细胞给海嘧啶 12, 24, 36和 48 h后细胞内 [Ca2+ ]i的变化
组别 浓度
(μg /mL)
细胞数
(n ) 12 h
[Ca2+ ] i( FI)
24 h 36 h 48 h
A - 20 320. 26± 147. 99 323. 50± 141. 35 339. 97± 150. 19 328. 45± 135. 15
B 50 22 386. 00± 163. 85* * 382. 67± 135. 02* * 399. 83± 159. 52* * 380. 42± 151. 46* *
C1 200 25 1 367. 56± 133. 98* * * 824. 63± 155. 65* * * 833. 84± 133. 10* * * 1119. 55± 193. 94* * *
C2 100 28 916. 78± 151. 46* * * 672. 65± 165. 16* * * 684. 31± 148. 45* * * 787. 00± 178. 19* * *
C3 50 26 724. 26± 151. 33* * * 532. 46± 146. 76* * * 519. 00± 170. 92* * * 547. 29± 142. 25* * *
D 100+ 20 24 776. 36± 144. 10△ 579. 16± 147. 20△ 583. 67± 144. 80△ 693. 38± 168. 15△
　　　　与 A组比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001;　与 C2及 A组比较: △ P < 0. 01
表 4　给药不同时间后 [Ca2+ ]i的变化
给药时间 ( h) 细胞数 (n ) [Ca2+ ]i( FI)
12 28 916. 78± 151. 46
24 23 672. 65± 165. 16
36 26 684. 31± 148. 41
48 28 787. 00± 178. 19
理性死亡 (坏死 )有着本质区别 ,如果说 ,坏死是细胞
在损伤等病理状况下的死亡 ,那么 ,细胞凋亡就是在
生理状况下细胞自我选择和控制积极主动的“自杀”
过程 ,尽管凋亡亦参与一些病理进程的发展 ,但其对
正常机制功能的恢复和维持 ,无疑具有重要意义。肿
瘤的发生不仅是因为细胞增殖与分化异常 ,还要考
虑细胞凋亡机制的失常所导致的癌变、发展、演进、
转移及带瘤宿主的死亡。肿瘤发病学中的细胞凋亡
机制可能有: 诱导凋亡基因的失活突变或抑制凋亡
基因的过程表达 ;化学致癌剂、病毒通过影响凋亡机
制进而致癌 ;前癌细胞凋亡机制不全 ;机体免疫应答
诱导肿瘤细胞凋亡的功能不全 ;宿主细胞粘附因子、
生长因子等抑制肿瘤细胞凋亡 ;肿瘤细胞通过对生
存信号的依赖性降低及竞争力增强等逃避凋亡 ,促
进肿瘤转移与恶化。
细胞凋亡与肿瘤发病的关系为抗癌药物的研究
提供了新的药理学机制和新靶点。作为抗肿瘤药若
能大量地诱发癌细胞的凋亡 ,激活其自发的程序性
死亡过程 ,就可避免因大量细胞坏死而释放胞内物
质引起的各种副作用 ,减轻化疗对正常组织的损伤 ,
延长患者的生存期。海嘧啶对人胃癌细胞凋亡的影
响实验结果表明:海嘧啶对人胃癌细胞的凋亡有一
定的促进作用 ,但是加大剂量后 ,并不能进一步促进
凋亡 ,这可能是大剂量药物引起坏死细胞增多的缘
故。阳性对照药 5-Fu则基本不能诱发细胞凋亡 ,这
与文献报道 5-Fu可使细胞凋亡的耐受性增强的结
果相吻合 [4 ]。因此 ,在海嘧啶组方中可诱发细胞凋亡
的有效成分可能是多糖成分 ,海藻多糖有直接抑制
和杀伤癌细胞的细胞毒性 ,而在低浓度的细胞毒药
物的刺激下可发生细胞凋亡 ;黄芪多糖可增强小鼠
NK细胞的细胞毒活性 ,而 NK细胞引起的靶细胞
死亡是凋亡。
肿瘤细胞的周期动力学特点是细胞群主体分布
于 DN A合成活跃的 S期 ,而分化细胞群主体分布
于 DN A合成的静止的 G1 /G0期 [ 3]。抗肿瘤药物可
使细胞周期动力学发生明显变化。海嘧啶也对 S180
小鼠肿瘤细胞的细胞周期产生了明显的影响 ,而且 ,
不同剂量的海嘧啶对肿瘤细胞周期有不同的影响 ,
小剂量 ( 50μg /m L)和中剂量 ( 100μg /mL) 海嘧
啶可使细胞阻断在 G1 /G0期 , S期细胞较对照组有
明显下降 ,海嘧啶大剂量则使细胞停止于 G2和 M
期 ,可见 G2和 M期细胞明显增多 ,揭示海嘧啶不同
剂量对抑制癌细胞的机制有所不同 ,海嘧啶对细胞
凋亡的诱导存在着多种途径。
海嘧啶能通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到抗肿瘤
的作用。 Ca2+ 是细胞凋亡传导系统中的一个重要组
成部分 ,为了进一步确定海嘧啶诱导细胞凋亡而抗
肿瘤的作用机制 ,我们采用激光扫描共聚焦技术观
察了海嘧啶对肿瘤细胞内 Ca2+浓度的影响。钙在体
内以两种形式存在: 结合状态和离子状态 ( Ca2+ ) ,
而只有 Ca2+ 才具有生理活性 ,所谓钙离子又分为细
胞外 Ca2+和细胞内 Ca2+两种。研究表明:细胞外液
的 Ca2+浓度约为 10- 3 mol /L ,细胞内 Ca2+ 浓度为
10- 7 mol /L,经常保持在一定的水平上 ,细胞内
Ca
2+ 仅为细胞外的 1 /10 000。但正是在这种细胞内
Ca
2+ 变化的参与下 ,调节众多的生理和代谢过程 ,特
别是在细胞信号传递过程中的作用 ,日趋受到重视。
Ca2+ 目前被认为是一种比较重要的第二信使 ,同时
也参与或协调其他第二信使的代谢和对细胞功能的
调节。
在细胞信号转导系统中 ,内源或外源信号经过
细胞膜、胞浆传入细胞核 ,引起基因表达的变化。 信
号跨越细胞膜传入胞浆常经过 3条途径: 酪氨酸蛋
白激酶介导 , G蛋白介导和离子通道介导 [ 5]。而胞浆
内信号传导过程中主要包括 3个信使系统 [6 ]: 腺苷
酸环化酶系统 ,肌醇脂质系统和钙-钙调蛋白系统。
而由这三个信使系统衍化出 5个相应的传导途径均
·903·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
可诱导细胞凋亡 ,这 5个途径是 ( 1)胞内 Ca2+ 信号
系统 ; ( 2) cAMP /PK A信号系统 ; ( 3) DG /PKC信
号系统 ; ( 4) 酪氨酸蛋白系统 ; ( 5)神经酰氨途径。
在这些信使系统中主要的信号分子包括 cAMP、
IP3、 PKC、 Ca2+ 等 ,而 Ca2+ 在信号传导中起重要作
用 ,是各条信号传导通路的枢纽 [5 ]。细胞内含量甚微
的 Ca2+对细胞凋亡起着重要作用。因此我们选择
Ca
2+ 作为研究肿瘤细胞凋亡信号传导机制的突
破点。
本研究应用 Fluo-3 /AM 为 Ca2+ 的荧光指示
剂 ,采用激光扫描共聚焦技术测定 SGC-7901人胃
癌细胞给药不同时间长度细胞内 [Ca2+ ]i的动态变
化 ,因此分为 12, 24, 36和 48 h 4个时间段 ,同时各
时间段又分为对照组及不同剂量给药组 ,以观察海
嘧啶影响细胞内 [ Ca2+ ]i的剂量依赖性。实验结果表
明有:各时间段给药组 Ca2+ 浓度均显著高于阴性对
照组 ( P < 0. 001) ,且海嘧啶高、中、低 3个剂量组
升高 Ca2+浓度的强度具剂量依赖性。而从不同给药
时间长度 Ca2+ 浓度变化值来看 ,给药组 Ca2+ 浓度
12 h最高 ,其他时间段则有所降低 ,但均显著高于
阴性对照组。这与文献报道 Ca2+ 升高对细胞凋亡早
期细胞凋亡的启动有关相一致。阳性对照组 5-Fu
也具有升高胃癌细胞内 Ca2+浓度的作用 ,与文献报
道一致 [7 ] ,但其强度不及海嘧啶。
Cohen等 [8 ]用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡 ,
发现 [Ca2+ ]i持续升高。进一步研究发现引起 DNA
片段化的内源性核酸内切酶是 Ca2+ 、 Mg2+ 依赖性
的 ,且胞浆浓度升高时 ,此酶活性明显增强。同样用
V p16诱导乳腺癌细胞凋亡以及用肿瘤坏死因子诱
导乳腺癌细胞凋亡时 ,也发现 [ Ca2+ ]i升高 ,激活
Ca
2+依赖性的核酸内切酶引起 DNA片段化和细胞
凋亡 [9 ]。海嘧啶可诱导肿瘤细胞凋亡 ,同时本实验研
究表明海嘧啶可以引起胃癌细胞内 [Ca2+ ]i的升高 ,
与其他肿瘤细胞凋亡时 [Ca2+ ]i变化一致 ,说明 Ca2+
在胃癌细胞凋亡过程中激活了 Ca2+ 依赖性的核酸
内切酶 ,使细胞凋亡。
海嘧啶可通过升高肿瘤细胞内 [ Ca2+ ]i而达到
诱导肿瘤细胞凋亡的目的。 细胞内 [Ca2+ ]i升高时 ,
Ca
2+ 有两方面的来源: 一是细胞外 Ca2+ 内流 ,主要
是通过钙通道开放引起 Ca2+ 内流 ;二是细胞内钙库
Ca
2+ 的释放 ,细胞内 Ca2+ 主要贮存于内质网 /肌浆
网中 ,主要受 IP3调节。为了观察海嘧啶引起胃癌细
胞内 [ Ca2+ ]i升高时 Ca2+的来源 ,我们设计了维拉帕
米组:在给药时 ,加入中剂量的海嘧啶和维拉帕米的
混合物 ,维拉帕米是细胞膜钙通道阻滞剂。由此本组
将可能产生三种可能的实验结果: ( 1) 如果 Ca2+ 只
来源于细胞外钙内流 ,则此时维拉帕米组 [Ca2+ ]i的
值应与阴性对照组相当 ; ( 2) Ca2+只来源于内钙释
放 ,则维拉帕米组 [Ca2+ ]i值应与海嘧啶中剂量组值
相当 ; ( 3) Ca2+ 既来源于外钙内流又来源于内钙释
放 ,则维拉帕米组 [Ca2+ ]i的值应处于阴性对照组与
中剂量组之间且与二者均具有显著性差异。 本实验
结果表明维拉帕米组 [Ca2+ ]i高于阴性对照组而低
于中剂量组且统计学差异显著 ( P < 0. 001) ,由此提
示: 海嘧啶升高细胞内 [Ca2+ ]i诱导细胞凋亡过程
中 , [Ca2+ ]i升高源于细胞外 Ca2+的进入和细胞内钙
库 Ca2+ 的释放 ,即海嘧啶通过引起细胞膜钙通道开
放和结合膜表面受体从而引起 IP3产生进而引起细
胞内钙库 Ca2+ 释放两条途径达到升高胞浆 Ca2+ 浓
度的作用。
海嘧啶通过开放细胞膜钙通道和引起细胞内钙
库释放升高肿瘤细胞内 [Ca2+ ]i浓度 ,从而启动细胞
凋亡机制 ,诱导肿瘤细胞凋亡 ,发挥抗肿瘤作用。
参考文献:
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