全 文 ：·药材·
南方红豆杉芽愈伤组织的诱导和培养
苏应娟 1 ,王　艇 1 ,杨礼香 2 ,李雪雁 1 ,范国宽 1 ,柯亚永 1 ,朱建明 1 ,吴惠勤 3 ,葛发欢 4
( 1. 中山大学生命科学学院 ,广东 广州　 510275;　 2. 华中师范大学生命科学学院 ,湖北 武汉　 430072;　 3. 广
东省测试分析研究所 ,广东 广州　 510070;　 4. 广州市医药工业研究所 ,广东 广州　 510240)
摘　要: 目的　为研究南方红豆杉芽愈伤组织诱导条件、最适培养基组成成分和紫杉醇含量的积累。方法　以南方
红豆杉芽为外植体 ,在 M S培养基上 ,试验不同种类、不同浓度的激素及其组合对其愈伤组织诱导的影响。 结果　
芽诱导的最适培养基是 MS添加 2, 4-D 2. 0 mg /L和 N AA 0. 5 mg /L;对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇含量的积
累则以 B5添加 2, 4-D 0. 5 mg /L、 N AA 1. 0 mg /L和 K T 0. 5 mg /L为最佳。结论　本研究为植物组织细胞培养生
产紫杉醇提供实验依据。
关键词: 南方红豆杉 ;愈伤组织 ;激素 ;紫杉醇
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 07 0637 03
Induction and culture on callus of Taxus chinens is var. mairei bud
SU Ying-juan1 , W ANG Ting1 , YAN G Li-x iang2 , L I Xue-yan1 , FAN Guo-kuan1 ,
KE Ya-yong1 , ZHU Jian-ming1 , WU Hui-qin3 , GE Fa-huan4
　　 ( 1. Schoo l o f Life Sciences, Zhong shan Univ ersity, Gaung zhou Guangdong 510275, China; 2. College o f Life Sciences,
Central China No rmal Univ er sity , Wuhan Hubei 430072, China; 3. Guangdong Institute o f Analysis, Guang zhou Guangdong
510070, China; 4. Guang zhou Institute o f Pharmaceutical Industry , Guang zhou Guangdong 510240, China )
Abstract: Object　 To study the induction conditions, optimal medium consti tution and accumulation
o f pacli tax el content fo r callus g row th. Methods　 Bud of Taxus chinensis var. mairei ( Lemee et Lé v l. )
Cheng et L. K. Fu was selected as the explant. The inf luence of dif ferent ho rmones at di fferent concentra-
tions o r in combination w ith di fferent composition w ere studied fo r fo rmation ca llus of T . chinensis var.
mariei bud on M S medium. Results　 The best medium was M S with addition o f 2, 4-D ( 2. 0 mg /L ) and
N A A ( 0. 5 mg /L ) for bud induction, w hile B5 medium with the addi tion o f 2, 4-D ( 0. 5 mg /L ) , N AA
( 1. 0 mg /L) and K T ( 0. 5 mg /L) gave optimal cell g row th and pacli taxel content. Conclusion　 This study
provided some reference fo r the production o f pacli tax el by cell cul t rue.
Key words: Taxus chinensis va r. mairei ( Lemee et Lé v l. ) Cheng et L. K. Fu; callus; ho rmones; pa-
cli tax el
　　紫杉醇 ( paclitaxel )是从红豆杉属植物中提取
的一种萜类化合物 ,对白血病、转移性乳腺癌、卵巢
癌、恶性黑色素瘤、脑癌、颈癌和肺癌均有疗效 ,是当
今公认的有效的抗癌活性成分之一 [1 ]。 目前紫杉醇
的价格非常昂贵 ,主要从红豆杉类植物的树皮中提
取 ,但其原植物中的含量仅为干重的 0. 005%～
0. 07% 。由于红豆杉类植物多属珍稀物种 ,生长又十
分缓慢 ,而全球每年需要紫杉醇 200～ 300 kg,因而
造成紫杉醇生产的原料供应极度匮乏 ,需要进一步
寻找新的植物资源和新技术生产紫杉醇 [2 ]。 植物组
织细胞培养生产紫杉醇已成为目前的研究热
点 [3～ 8 ]。
有关南方红豆杉 Taxus chinensis ( Pi lger ) Re-
hd. v ar. mairei ( Lemee lé v l. ) cheng et L. K. Fu愈
伤组织诱导的外植体的研究有较多报道 ,主要集中
在 1～ 2年生的枝条、叶、幼嫩茎段 [9～ 12 ]。本文以南方
红豆杉的芽为外植体研究其诱导和培养条件及紫杉
醇的含量变化 ,并与幼嫩茎段的诱导条件相比较。
1　材料与方法
1. 1　材料:南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei
·637·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2001年第 32卷第 7期
收稿日期: 2000-07-31基金项目:国家自然科学基金 ( 39500013, 39700117)和广东省自然科学基金 ( 950099, 970176)资助项目 ,广州市科委重点科技攻关项目作者简介:苏应娟 ,女 ,副教授 ,硕士生导师。 1988年毕业于湖北中医学院中药系 ,获学士学位。 1992年毕业于中国科学院武汉植物研究所 ,获理学硕士学位。 1995年毕业于中山大学生物系 ,获理学博士学位。目前主要从事药用植物的研究与开发 ,在国内外期刊上发表论文 40余篇。
采自广东省连州市高山镇。 于春、夏、秋季取当年生
的嫩茎和芽。
1. 2　方法
1. 2. 1　取芽和茎段 (带叶柄 ) ,洗衣粉清洗干净 ,清
水冲洗约 2 h, 70%乙醇浸泡 3 s,放入 0. 2%升汞溶
液中轻摇 12 min,无菌水冲洗 5～ 6次。叶片尖端减
去 1 /2后 ,将茎切成 1～ 1. 5 cm插入培养基中。芽则
去除少部外鳞接入培养基。 25℃黑暗培养 ,观察各
种培养基中外植体产生愈伤组织的时间及愈伤组织
的长势 , 20 d后统计各培养基中出现的愈伤组织块
数 ,计算愈伤组织的诱导率 (诱导率= 愈伤组织的块
数 /接种的芽或茎段的个数 )。
1. 2. 2　紫杉醇提取: 愈伤组织培养物在 40℃干燥
至恒重 ,研碎后 ,精确称重 , 150 mL氯仿 80℃索氏
提取 4 h。回收氯仿 ,用甲醇定容至 10 mL,滤膜 (孔
径 0. 45μm)过滤备用。
标准品:紫杉醇对照品购自 Sigma公司 (图 1)。
仪器: HP1100高效液相色谱系统 ,浙大智能 N2000
工作站 ,紫外检测器 ( 225 nm) ,色谱柱为 kr 100型 ,
RP-C18 ( 4. 5× 250 mm)柱
试剂:甲醇为色谱纯品 ,水为二次蒸馏水。
色谱条件: 采用 C18柱 ,流动相为甲醇 -水 ( 60∶ 40) ,
流速 1 mL /min,检测波长 225 nm ,每次进样 20μL。
采用面积外标法 ,计算出各样品紫杉醇的含量
(图 2)。
图 1　紫杉醇标样色谱图
图 2　愈伤组织中紫杉醇的色谱图
2　结果与讨论
2. 1　激素对愈伤组织诱导的影响:见表 1。
表 1　南方红豆杉愈伤组织的诱导
培养基 激素的种类和浓度 ( mg / L)
出愈时间 ( d) 诱导率 (% )
茎段 芽 茎段 芽
M S1 2, 4-D 2. 0 10 7 　88 　 97. 6
M S2 2, 4-D 2. 0+ N AA 0. 5 9 5 97 100
M S3 2, 4-D 2. 0+ N AA 0. 5+ K T 0. 2 12 7 82. 7 43
M S4 2, 4-D 2. 0+ N AA 0. 5+ K T 0. 5 25 - 74 0
M S5 N AA 3. 0 9 8 93. 3 100
M S6 N AA 3. 0+ 2, 4-D 0. 5 9 9 92 100
M S7 N AA 3. 0+ 2, 4-D 0. 5+ K T 0. 2 12 - 81 0
M S8 N AA 3. 0+ 2, 4-D 0. 5+ K T 0. 5 27 - 77 0
　　在 MS培养基上 ,试验不同种类、不同浓度的激
素及其组合对南方红豆杉外植体愈伤组织诱导的影
响。结果表明 ,芽的污染率很低 ,几乎为零 ;而茎段虽
然是春季刚抽出来的 ,但其污染率仍为 25%左右。
从表 1中可见 ,不同的激素种类和浓度对愈伤组织
的诱导有较大差别。 茎段诱导的最适培养基为 MS
和 2, 4-D的组合与 M S和 NAA的组合对茎段愈伤
组织的诱导时间和诱导率的效应相似 ,均可在两周
内产生愈伤组织。茎段愈伤组织的产生先是茎两端
膨大 ,叶柄处产生愈伤组织 ,然后整个茎膨大 ,叶片
也愈伤组织化 ,最后整个外植体可以全部转为愈伤
组织 ,与其它报道一致 [ 5～ 7]。 KT延迟了茎段愈伤组
织的产生 ,且降低了诱导率 ,但低浓度的 K T对愈伤
组织的质地有改善作用。 KT对芽愈伤组织的诱导
有很大影响 ,在 MS4、 MS7、 MS8 3种 KT组合中 ,
芽无法产生愈伤组织 ,约 4周后 ,芽渐渐变成褐色而
死亡。在 MS3中虽有愈伤组织产生 ,但很快褐化 ,生
长极为缓慢。芽诱导的最适培养基为 MS2。茎段和
芽相比 ,芽产生愈伤组织的时间早 ,诱导率高 ,愈伤
组织生长速度快。这可能是由于芽的组织分化程度
低 ,细胞分裂旺盛的原因。芽和茎段对 KT的反应不
同 ,可能是两者内源激素水平不同所致。
2. 2　愈伤组织增殖和驯化:虽然在 MS培养基上南
方红豆杉的诱导率较高 ,但愈伤组织的生长却较差。
所以以 B5培养基为基础 ,研究激素的种类和浓度对
芽愈伤组织的生长率和紫杉醇含量的影响。 鉴于不
同的激素配比对南方红豆杉愈伤组织的生长有影
响 ,本实验在 B5培养基中附加不同配比的激素 ,以
选取较适合芽和茎段愈伤组织生长的培养条件。 将
疏松、浅绿色或白色的愈伤组织接种于含有不同激
素种类和浓度的培养基中继代培养 ,观察激素对愈
伤组织增殖的效果 (图 3)。 芽来源的愈伤组织可以
直接转入增殖培养基中进一步扩大培养。茎段来源
的愈伤组织则保留在外植体上继代培养 2～ 3次 ,让
其充分愈伤组织化后 ,再挑选色浅的进行增殖。从表
·638· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2001年第 32卷第 7期
2中可以看出 ,愈伤组织在不同激素作用下生长和
紫杉醇积累差别较大 ,其中以 B5 ( 5)积累紫杉醇的
量为最佳。在 B5 ( 5)上多次继代培养后 ,可形成较为
均一、稳定的无性系。 生长过程中 ,愈伤组织颜色逐
渐加深 ,由浅黄到棕黄至深棕色 ,其中以 B5 ( 1)分泌
褐色物较早、较多。
表 2　南方红豆杉芽的愈伤组织培养
培养基 激素的种类和浓度
( mg /L)
生长率
( g /L)
紫杉醇含量
(% )
B5 ( 1) 2, 4-D 2. 0+ N AA 0. 5 9. 27 　　 0. 004 1
B5 ( 2) 2, 4-D 2. 0+ N AA 0. 5+ KT 0. 2 7. 83 0. 008 4
B5 ( 3) N AA 3. 0+ 2, 4-D 0. 5+ KT 0. 2 8. 16 0. 007 0
B5 ( 4) 2, 4-D 0. 5+ N AA 1. 5+ KT 0. 2 7. 52 0. 009 8
B5 ( 5) 2, 4-D 0. 5+ N AA 1. 0+ KT 0. 5 7. 74 0. 013 0
B5 ( 6) N AA 0. 5+ K T 1. 0 6. 81 0. 015 0
图 3　南方红豆杉芽的愈伤组织
2. 3　愈伤组织的生长周期:南方红豆杉芽的愈伤组
织的生长周期为 32 d左右 ,延滞期较长 ,约 16 d,第
16～ 28天为指数生长期和对数生长期 ,此后进入稳
定期 ,大约第 32天后 ,愈伤组织开始衰老。其生长曲
线与红豆杉属其他植物愈伤组织的生长曲线基本相
似 (图 4)。
图 4　南方红豆杉芽愈伤组织的生长周期及
紫杉醇含量变化
参考文献:
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　　 (上接第 636页 )
细胞继发性增多 ,血液粘绸度增加 ,血管内皮细胞损
伤 ,特别是在急性期 ,因严重感染、酸中毒、免疫复合
物沉积致使血管内皮损伤更重、胶原组织暴露激活
凝血系统 ,终致血液粘滞性及凝固性增加 ,成为血栓
形成的基础 [1 ]。中医认为慢性肺心病主要是血瘀所
致 ,用活血化瘀药能降低血粘度 ,改善微循环 ,纠正
缺氧 ,促进代谢 ,降低毛细血管通透性 ,减轻肺水肿 ,
降低循环压力 ,达到改善心功能的目的 [2 ]。丹参具有
抑制血小板聚集 ,解除小血管痉挛 ,增加肾脏微循环
灌注 ,防治弥漫血管内凝血的作用。可促进代谢产物
排泄 ,干扰脂质过氧化物代谢和清除过多氧自由基 ,
丹参能降低肺动脉高压 ,降低右心负荷 ,增加每搏心
输出量 ,改善右心功能 ,此外尚有抗炎作用 [3 ]。复方
丹参滴丸副作用小 ,疗效确切 ,但由于观察例数较
少 ,且时间不长 ,对肺心病的长期疗效与实用价值尚
待更多的实践加以验证。
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