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南方红豆杉组织培养研究△
1
. 愈伤组织诱导和培养条件优化
芳良赵倪新疆石河子大学 医学院 (83 2 0 0 0 )
新疆武警兵指 五支队卫生 队 耿 征 “ 刘谦光 ` ’
摘 要 介绍了南方红豆 杉植物愈伤组 织诱导 和继代培养条件 ,在 M S 一培养基上 , 附加不 同种类
和浓度配 比的激素 , 在光照条件下对植物愈伤组 织的诱导率和 生长量等进行 了比较 , 其中当 2 , 4 一 D
1
·
Z m g /L 十 6 一B A 2 . s m g / L + N A A 3 m g /L 或 4 m g / L 时 ,愈伤组织诱导率和生长量最高 , 结果表
明 , 不同激素组合对愈伤组织诱导率 、 生长量和发生的性状有明显 的影响 。 为南方红 豆杉植物细胞
悬浮培养建立了基础 , 为解决红豆杉的资源贫乏提供 了新途 径 。
关扭词 南方红豆杉 组 织培养 愈伤组织
紫杉 醇 ( at x ol ) 是从 红豆 杉 属 ( T 口 x us
L
.
) 植物中分离出的一个具有独特抗肿瘤活
性的二菇类化合物 〔 ,〕 , 现已应用于临床治疗卵
巢癌和乳腺癌 , 虽然紫杉醇的全合成 已获成
功 〔2 , , 但成本 比天然提取药更高 , 就 目前临床
供药而言 , 主要依靠从红豆杉树皮中提取 , 已
使红豆杉植物濒临灭绝的危险 。 组织培养生产
紫杉醇成为解决红豆杉资源短缺的有效途径
之一 。 有关红豆杉组织和细胞培养的文献较
多 , 涉及红豆杉的种属也较多 , 但南方红豆杉
的研究报道鲜见 。 综述文献在这方面的研究 ,
主要采 用 B S 培养基进行避光培养 ( 暗培养 ) 。
我们发现 , 在适宜的条件下 , M S 培养基上 的
愈伤组织在光照下诱导率和生长量均优于 B S
培养基 。 我们就 M S 和 B S 培养基 ,光培养与暗
培养 、 激素种类和浓度配比 、 不同糖类等几方
面进行了对比实验 , 用高效液相色谱对其中的
紫杉醇进行了定性定量分析 〔3 〕 , 并分离获得纯
品 。 现将组织培养的初步结果报道如下 。
1 材料和方法
选择 1一 2 年生具 有绿皮处于 阴暗位置
的南方红豆杉嫩枝作为供试材料 , 采 自陕西
师范大学生物园引种体 , 供试材料采下后 ,按
常规消毒灭菌 ,在无菌条件下截成长 0 . 5 。 m
左右小段 。
诱导培养基 以 M S 为基本培养基 , 附加
固定浓度的 2 , 4一 D l , Z m g / L , 6一B A ( 6一节氨
基 嚓吟 ) 2 . 8 m g / L 后 , 再 附加 不 同浓度 的
G A 3 (赤霉素 ) , I A A (叫噪 乙酸 ) , C A (酪蛋 白
水解物 ) , N A A (禁乙 酸 ) ; 在 6一 B A 浓度不变
时 ,改变 2 , 4一 D 浓度 , 其浓度组合见表 1 。 糖类
选 用 蔗糖 、 葡萄糖 、 果糖 2 % , 再 附 加 琼 脂
0
.
8%
,
p H 调至 5 . 4 , 高压灭菌 。 在温度 ( 2 3士
2 ) C 下 ,光强 1 0 0 0 ~ 1 2 0 0 l x ,每 日光照 1 2 h
培养 。
2 结果
2
.
1 激素对 愈伤 组 织 、 诱 导 率 的影 响 : 在
M S 培养基 上 , 附加不 同种类 和浓度配 比的
激素 ,培养 6 d 个别腋芽出现愈伤组织 , 少部
分嫩枝开始膨大 , 3 周左右大部分外植体发
A d d r e s s
:
Z h a o F a n g M e d i e a l C o lle g e o f S h ih e z i U n i v e r s i t y
,
S h ih e z i
赵 芳 毕业 于陕 西师范大学化学系 , 硕士 。 现任 新孤石河子大学 医学院药学 系副教授 , 主要从事分析化学的教学工作和药物分析 的科研 工作 。 曾参与 了南方红豆杉组 织培养和有机物的化学发光的研究 工作 , 并在 《分析化学 》上发表论文数篇 。现主要从事天然药 物的研究开发 。
“ 陕西师范大学化 学系△陕西省 自然科学基金 重点 资助项 目
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 3 期 . 2 1 3 .
生愈伤组织 。 试验结 果见表 1。
2
.
2激素对愈伤组织生长量的影响 :外植体
的愈伤化程度一般通过愈伤组织生长量来说
明 。 愈伤组织生长量 的计量方法有 :通 常采用
称 量 鲜 、 千重 来 表 示 , 还 有 细 胞 数 目表 示
法 以〕 , 愈伤指数表示法 〔 5〕 。 本文采用愈伤指数
来表示愈伤组织相对生长量 , 以 此说 明外植
体 的愈伤化程度 , 此表示法不破坏愈伤组织
继续生长 。 愈伤指数概念为 :
愈伤指数 - 艺(愈伤化级数 X 该级块数 )各级块数 总和 X 最高级数
1 级 : A 镇 1/ 4 2 级 : 1/ 4 < A镇 1/ 2 3 级 : 1/
2 < A 镇 3 / 4 4 级 : A 一 1 其 中 A 一愈伤面
积 /外植体表面积
根据上述概念计 算 , 对 4 种物质在 M S
培养基上 , 愈伤组织培养 60 d 的愈伤指数见
图 1 。 于 M S 培养基 上 , 附加下列浓度 的激
素 : 2 , 4一 D l · 2 m g / L + 6一 B A Z· 8 m g / L +
N A A 3 m g / L 或 4 m g / L ,愈伤指数最高 。 表
明愈伤组织在这两种组合 条件下生长旺 盛 ,
相对生长量大 ,愈伤化程度高 。
愈伤化级数定义为 : O级 : 无愈伤组织
表 1 激素对愈伤组织发生的影响
M S+ 附加物 (m g / L )
+ 蔗糖
外植体数 成愈数 诱导率
(块 ) (% )
谊电 C ( . . / L》
l
一
G A 3 ( 1~ 5 m g / L ) 2
一
I A A ( 1 ~ 5 m g / L )
3一 C A ( l ~ 4 m g / L ) 4
一
N A A ( 1~ 5 m g / L )
图 1 南方红豆杉愈伤指数图
2
.
3 培养基与光照条件对愈伤组织诱导和
生长的影 响 : 选择最佳激素配比组合 , 附加于
M S 和 B : 培养基上 ,不 同光强 。 愈伤组织诱
导培养 6 O d 收获 。 试验结果见表 2 。
2
.
4 糖类对愈伤组织诱导和生长的影响 : 在
M S 培养基最佳激 素组合 条件下 , 添加不 同
的糖 ,愈伤组织诱导培养 60 d 收获 。 试验结
果见表 3 。
0叨816叭从”73094叻95895朋10%049“48605朽助2102”“91切508阳3”7
些60时570“1059
126857“6004”91朋2肠5918
0+ 6
一
BA 2 8
5+ 6
一
BA 2
.
8
10+ 6
一
BA 2
.
8
15+ 6
~
BA 2
.
8
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ G A3 1
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ G As 2
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ G A3 3
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ G As 4
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ G As 5
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ IAA 1
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ IAA 2
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ IAA 3
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ IAA 4
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ IAA 5
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ CA 1
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ CA 2
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ CA 3
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ CA 4
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ N AA 1
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8十N AA Z . O
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ N AA 3
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ N AA 4
.
0
1
.
2+ 6
一
BA 2
.
8+ N AA 5
.
0
卯-4D佣化帅-和必
表中为接种 2 0 d 统计 的结果
表 2 培养基光线对愈伤组 织诱导生长状况 比较
培养基 光 培养 暗培养 诱导率 ( % ) 褐变发生率 (% ) 干鲜 比 (写 )
M S
B 5
淡黄色 ~ 黄 绿色 ~ 褐色
暗 白色 ~ 褐 色~ 深褐色
白色 ~ 淡褐 色~ 深褐色
白色 ~ 淡褐 色~ 深褐色 :: ;: 背
表 中诱导 率为接种 20 d 统计结果
表 3 糖对愈伤组织诱导和生长状况 比较
(个 ) (个 )
蔗糖
果糖
葡萄糖
6 6
5 4
7 5
(当2
I U 0
状况 状况
:;
1 2 4
.
5
8 0
3 6
.
5
(倍 )
1 2 4
.
7
::
黄绿 色~ 褐色
白色~ 褐色
淡黄色 ~ 褐色
白色 ~ 棕红
深黄一浅黄
白色 ~ 棕色
60103
3 讨论
3
.
1 愈伤组织发生性状和继代培养 : 诱导愈
一
2 1 4
-
伤组织因培养基 中所附加生长调节剂的种类
和浓度不 同时其发生性状也不同 。 愈伤组织
常常在腋芽或叶基部首先发生 。但是 , 当腋芽
或叶基部脱离嫩枝诱导时 ,却很难发生愈伤
组织 。 嫩枝愈伤组织首先出现在切 口 处 , 由两
端向中间愈伤化 。 部分接触培养基处愈伤组
织分泌有棕色物质 , 使其附近的愈伤组织及
培养基呈棕红色 ,随着培养时间的延长 ,愈伤
组织呈现淡褐色颗粒状 , 逐渐呈褐色光滑状
态 ,停止生长 ,必须及时转移继代培养 。 在转
移过程中 , 愈伤组织若脱离外植体 , 颜色逐渐
变暗褐乃至深褐色 。 本实验继代 5 次 , 生长速
度 随继代次数的增加 , 先呈上升趋势 ,后逐渐
下降 。
3
.
2 褐变程度的影 响 : 红豆杉属植物愈伤组
织在生长过程中 , 常伴 随有一些不利于生长
的酚类物质 , 酚类渗出物的积 累导致愈伤组
织褐化 ,增殖缓慢 。南方红豆杉愈伤组织也有
褐变现象 ,激素种类不同 ,褐变程度不同 。 培
养基 中附加 G A : 和 C A 激素 , 愈伤组织褐变
程度 比附加 I A A 和 N A A 严重 , 通过频繁继
代转移培养不能根除这一现象 。 我们 曾在培
养基上附加活性碳和抗坏血酸等 , 也未能彻
底解决这一 问题 。
3
.
3 综上所述 , 培养 基中含 2 , 4 一D 对愈伤
组织 的诱导极 为有利 , 2 , 4 一D 和 N A A 的组
合对愈伤组织的正常生长也是必须的 。 G A 。 、
I A A
、
C A 对愈伤组织 的诱导 或生长存在着
不同程度 的抑制作用 。 通过培养 基 、 有光无
光 、 糖的对 比条件试验 ,发现南方红豆杉愈伤
组织诱导和生长适于光照条件下的 M S 培养
基 ,组织培养 的生理碳源选用蔗糖 比较好 。
参 考 文 献
1 W a n i M C
, e t a l
.
J A m C h
e m s o e
, 1 9 7 1
, 93 ( 9 )
:
23 2 5
2 俞培忠 , 等 . 中国药学杂志 , 1 9 9 6 , 3 1 ( 7 ) : 3 90
3 赵 芳 ,等 . 分析化学 , 1 9 9 7 , 2 5 ( 8 ) : 9 4 1
4 中国科学 院上海 植物生理研 究所细胞 室 . 植物组织 和
细胞培养 . 上海 : 科 学技 术出版社 , 1 9 78 : 6
5 李湘 串 ,等 . 中草药 , 1 9 9 2 , 2 3 ( 1 2 ) : 6 4 4
( 1 9 9 8
一
0 7
一
1 3 收稿 )
S t u d i e s o n t h e T is s u e C u l t u r e o f M a i r e Y e w (了口 x u s c h i n e n s i s v a r . m a ier i )
1
.
C a l l u s I n d u c e m e n t a n d O P t i m i z a t i o n o f t h e C u l t u r i n g M e t h o d s
Zh
a o F a n g
,
N I I
矛
ia n g
,
G
e n g Z h e n g
, e t a l
.
( M
e
d i
e a
l C
o
l le g e o f S h ih e z i U n iv e r s i t y
,
S h ih
e z i 8 3 2 0 0 0 )
A b s t r a e t S t
u
d
l e s o n t王s s u e e u l t u r e o f 了溉了 u s c h i n e 二 5 15 v a r . 胡 a ier i ( l矛 e m e e e t L e v l . ) C h e n g I J . K . F u
w
a s e a r r ie d
o u t
.
R
e s u
l t
s i n d i
e a t e d t h a t t h e r a t e o f e a l l u s in d u e e m e n t a n d y ie l d o f P a e li t a x e l i n m e d i u m M S
p l
u s 一, 2 m g / I J Z , 4 一 D , 2 · 8 m g / I J 6一 B A a n d 3 . 0 m g / I一 o r 4 . 0 m g / L N A A w e r e h ig h e r t h a n o t h e r s . T h e
e x p e r im e n t s w e r e e o n d u e t e d u n d e r l ig h t d u r i n g a 6 0
一
d a y g r o w t h p
e r io d
, a t t e nr p e r a t u r e in t h e r a n g e o f 2 3 士 2
C
.
T h e r e s u l t p r o v i d e s t h e p o s s i b i li t y o f e e ll e u l t u r e o f T a x u s e h i n ` n s i s v a r
. 明 a i r e i ( L e nr e e e t L e v l . ) C h e n g
L
.
K
.
F u a n d
a
l
s o n e w a l t
e r n a t i v e w
a y f
o r t h
e p r o d
u e t io n o f p
a e li t a x e l
.
K
e y w o r d s
P a v e s a
T a 艾 u s c h i n e n s i s v a r . m a i er i ( I J e m e e e t I J e v l . ) C h e n g L . K . F u e a l l u s in d u e e m e n t
《国外医药 · 植物药分册 》 19 9 9 年征订启事
《国外医药 · 植物 药分册 》杂 志是 由国家药 品监督 管理局 主管 , 中草药信 息 中心站和 天津药物研 究院主
办 , 国 内外公开 发行 的医药科技专业期刊 。
本 刊以 综述 、 编译 、 文摘 、 信息 、 题录等形 式 向读者提供植物 药有效成分 的分离提 取 、 结构 鉴定 ; 生产工艺
和质 量控制 ; 生化药理 活性与 临床研究 ; 组织培养与生物技 术工程 ;各 国民间药物 的开 发与植物药 专利 ;市场
贸易与各 国的药政管理 。 此外 , 与植物相关 的保健食 品 、 化妆 品 、兽药 、农药 、 饲 料 、调 料等亦属本 刊的报道范
围 。 信 息来源涉及十 几个 国家出版发行 的一百多种期 刊 , 每年 向读者 提供约 5 0 万 字新 、特 、快信息 。
本刊为双 月刊 , 全年 6 期 ;每期定价 9 . 50 元 , 全年 60 元 (包括包装费与邮资 ) 。 自办发行 , 随时可以订阅 。
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《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 3 期 . 2 1 5 ·