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中药材鳖甲的位点特异性 PCR鉴定研究
刘忠权 ,王义权 ,周开亚⒇
(南京师范大学遗传资源研究所 ,江苏 南京　 210097)
摘　要: 目的　本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲 DNA分子鉴定方法。 方法　根据中华鳖和鳖甲混淆品原动
物的 12S rRN A基因片段的序列数据库 ,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点 ,设计 1对能特异性鉴别
中华鳖的引物 ,然后利用鳖甲中残存的 DNA,通过 PC R扩增 ,即可准确鉴别鳖甲。结果　用这对引物对不同来源的
10块鳖甲进行鉴定结果表明 ,其中有 3块为伪品 ,结果与 DN A序列分析鉴定一致。 还测定了斑鼋和鳖甲一伪品
12S rRNA基因片段序列。 结论　该引物配置药材鉴定试剂盒可在鳖甲类药材鉴定使用。
关键词: 鳖甲 ;位点特异性引物 ;鉴别 PCR,
中图分类号: R282. 740. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0736 03
Authentication of TCM Carapax Trionycis by allele-specific
diagnostic polymeras chain reaction
L IU Zhong-quan, W ANG Yi-quan, ZHOU Kai-ya
　　 ( Institute of Genetic Resour ces, Nanjing No rma l Univ ersity, Nang jing Jiangsu 210097, China)
Abstract: Object　 To develop a convenient and practical method fo r the identification of Carapax
Trionycis . Methods　 Based on the sequence va ria tions of 12S rRN A gene between Pelodiscus sinensis and
o ther sof t shell turt les, a pai r of allele-speci fic primers w as designed to distinguish P. sinensis f rom other
species of Trionychidae. DN A were ex t racted and anplified and Carapax Trionycis could be identi fied accu-
ra tely by po lymerase chain reaction ( PCR) using the primers. Results　 Ten samples o f turt le shell f rom
di fferent sources w ere indenti fied by the allele-speci fic PCR with the primers. The result indicated that
three samples w ere substitutes of Carapax Trionycis , consilient w ith the result f rom DNA sequence analy-
sis. The mitochondrial 12S rRN A gene fragment o f P. maculatus and a faked imi tation had also been se-
quenced. Conclusion　 The primers could be used as key components in Carapax Trionycis identification
kit.
Key words: Carapax Trionycis; allele-specific primer; diagnostic polymerase chain reaction ( PCR)
　　早在《神农本草经》就有鳖甲可入药记载 ,李时
珍在《本草纲目》中又增添了鳖甲的药用总结。 1995
年版中国药典规定中药鳖甲为鳖科动物鳖 Trionyx
sinensis Wiegmann的背甲 [1 ] ( Trionyx sinensis现为
Pelodiscus sinensis[ 2] )。具有滋阴潜阳 ,软坚散结 ,退
热除蒸之功效。但药材原动物来源较复杂 ,据报道伪
混品有山瑞鳖 Pelea steindachneri ( Siebenrock)和
缘板鳖 Lissemys punctata ( Bonnaterre)以及鼋 Pe-
lochelys bibroni ( Ow en)的背甲 [3, 4 ] ,由于药材进口 ,
鳖甲的商品药材来源可能还要复杂一些。 鳖甲传统
鉴定主要依据药材性状 ,粉末特征及组织结构等形
态学特征 [3 ]。 由于传统鉴定方法与鉴定者的经验有
关 ,受主观影响程度较大。为寻找新的鉴定方法 ,王
亚明等首次从药材鳖甲中抽提出 DNA并扩增约
500bp的线粒体 Cy t b基因片段 [ 5] ;吴平等从中华鳖
和山瑞鳖原动物组织材料中提取 DNA, 扩增约 110
bp的线粒体 12S rRN A基因片段并测序 ,结果表
明 ,中华鳖与其它 2种鳖科动物的这段 DNA序列
有明显差异 [6 ] ,从而达到鉴定鳖甲原动物的目的。然
而 DNA测序成本高 ,技术复杂 ,实际应用有困难。
本文根据已有的中华鳖和鳖甲混淆品原动物山
瑞鳖、缘板鳖的 12S rRN A基因片段的序列数据库 ,
以及测定的斑鼋该段序列 ,经对位排列 ,找出中华鳖
与其它鳖有明显区别的位点 ,设计 1对能特异性鉴
·736· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-11-10基金项目:国家自然科学基金 ( No. 39870913)、江苏教委科学基金 ( 98K JB360010)和江苏省“ 333工程”人才培养基金资助作者简介:刘忠权 ( 1963-) ,男 ,江苏兴化市人 ,副教授 ,博士生。分别在《 Plan ta M edica》、《药学学报》、《中草药》等刊物上发表论文 10多篇。现从事动物分子生物学和中药材分子鉴定等研究工作。
定中华鳖的引物 ,然后利用鳖甲中残存的 DNA, 通
过 PCR扩增 ,即可准确鉴别鳖甲。
1　材料与方法
1. 1　实验材料:共 4个属 4种鳖科动物。 中华鳖和
山瑞鳖为新鲜冻存标本 ,由吴平博士鉴定 ,存放在南
京师范大学遗传资源研究所。斑鼋 Pelochelys macu-
latus ( Heude)为干燥标本蹼趾皮下少许肌肉 ,由苏
州铁道师范学院生物系提供 ,详见表 1。鳖甲共 10
块 , 4块 ( JP1-JP4)由江苏省药品检验所提供 ; 6块
( JP5-JP10)收集于南京某些饭店。
表 1　 4种鳖科原动物样品
种　　名 代码 数量 来源
中华鳖 Pelodiscus sinensis [2] Pi 4 江苏南京 ,广西南宁
山瑞鳖 Palea steindachneri Pt 2 广西南宁
斑鼋 Pelochel ys maculatus Pm 1 苏州跌道师范学院生物系
缘板鳖 Lissemys punctata Lp Genbank
1. 2　总 DNA的提取:肌肉和鳖甲 DNA的提取 ,采
用 SDS /蛋白酶裂解 ,酚氯仿抽提 ,详见文献的龟类
肌肉和龟甲的 DNA的提取 [ 7, 12]。
1. 3　 PCR扩增和测序: PCR反应条件同文献 [7 ]。序
列采取本实验室的 ABI 310基因分析仪测定。
BigDye DN A测序试剂盒购自 PE Applied Biosy s-
tems, 按试剂盒手册操作。
1. 4　序列分析和引物设计: 用 Clusta lW程序对
DNA序列进行对位排列 ,用分子进化遗传分析软件
MEGA分析各物种间 DNA序列差异。根据中华鳖
与其它鳖间的序列差异位点 ,设计能特异性扩增中
华鳖的专一性位点特异性引物 IT-L02和 IT-H02
(序列正在申请专利 ) ,能扩增约 170 bp的基因片
段。用于序列测定和阳性对照的引物为扩增线粒体
12S rRN A基因片段的通用引物 L1091和 H1478。
1. 5　 PCR产物检测: PCR产物经 EB染色的琼脂
糖凝胶电泳后 ,在图像分析系统 DGS-7600 (美国
UV P, Inc. )上紫外扫描检测。
2　结果
2. 1　序列分析: 用通用引物 L1091和 H1478对斑
鼋样品 DNA扩增、测序 ,所得序列已送至 GenBank
数据库中 ,登录号为 AF321281,另外还测定了由江
苏省药品检验所提供的鳖甲伪品 ( JP2)序列。中华
鳖和山瑞鳖的序列来自文献 [8 ] ,缘板鳖的序列来自
GenBank(登录号 U81337)。根据对位排列结果 ,共
有 405 bp, 161个变异位点。 种与种之间的序列差
异为 6. 92% ～ 32. 63% 。 JP2与中华鳖 ( Pi )之间的序
列差异为 9. 4% ;与山瑞鳖 ( Pt )间为 8. 62% ;与斑鼋
( Pm )间为 32. 3% ;与缘板鳖 ( Lp)间为 16. 38% (表
2)。
表 2　 5种鳖科动物的 12S rRNA基因序列转换 /颠换数
(上三角 )和序列差异百分比 (下三角 ) (% )
OT U 1 2 3 4 5
　 1 Pi 19 /8 64 /55 29 /22 23 /13
　 2 Pt 　 6. 92 67 /57 35 /16 22 /11
3 Pm 31. 48 　 32. 63 58 /49 64 /56
4 Lp 14. 41 14. 41 31. 10 34 /24
5 JP2 9. 40 8. 62 32. 35 16. 38
2. 2　 PCR鉴定
A-引物 L1091和 H1478,
退火温度 55℃时的阳性对
照。 B-引物 I T-L02和 IT-
H02,退火温度 55℃。 N-阴
性对照。 M-Mark er, DL-
2000。 图中代码同表 1
图 1　鳖甲原动物鉴别
PCR产物的琼脂
糖凝胶电泳
2. 2. 1　原动物的位点特异
性 PCR鉴别:在进行原动物
鉴别时 ,退火温度为 55℃ ,
DN A 模 板 用 通 用 引 物
L1091 和 H1478 同 时 对
DNA模板进行阳性对照扩
增 ,三种鳖都能扩增约 400
bp的 DNA片段 (图 1-A)。
用鉴别引物扩增时 ,只有中
华鳖 ( Pi )能扩增约 170 bp的
DNA片段 ,而山瑞鳖 ( Pt )和
斑鼋 ( Pm )无扩增产物 (图
1-B)。
2. 2. 2　鳖甲药材的位点特
异性 PCR鉴别:当退火温度为 55℃ ,用通用引物同
时对模板进行阳性对照扩增时 ,所有 10个鳖甲样品
都有明显扩增产物 (图 2)。 在同样的退火温度条件
下 ,用鉴别引物对鳖甲进行扩增时 , 1, 5～ 10号都有
明显的扩增产物 ,而 2～ 4号无扩增产物 (图 2)。
C-引物 L1091和 H1478,退火温度 55℃时的阳性对照。D-引
物 IT-L02和 IT-H02,退火温度 55℃。 P-阳性对照。 N-阴性
对照。 M -Marker, DL-2000。 图中代码同表 1。
图 3　鳖甲的鉴别 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
3　讨论
位点特异性鉴别引物对 10块鳖甲的 PCR鉴定
结果表明 ,由江苏省药品检验所提供的 4块鳖甲检
品 ,其中 3块为伪品。这与测序结果是一致的 [6 ]。另
外又对其中一块鳖甲伪品 ( JP2)进一步测序和排序
分析 ,并经 GenBank的 BLAS T分析 ,结果表明 ,该
鳖甲即不是中华鳖和山瑞鳖 ,也不是斑鼋和缘斑鳖 ,
·737·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
提示鳖甲伪品还有其他来源。至于其原动物是哪一
种鳖 ,还需进一步研究。而收集的 6块鳖甲皆为正
品 ,由于野生鼋及斑鼋几乎绝灭 ,山瑞鳖数量亦不
多 [9 ] ,因此这几种鳖掺伪的可能性不大。药材鳖甲伪
品可能为一些从东南亚进口的鳖类。
在位点特异性鉴别引物设计时 ,我们选择了鳖
科 4个属的 4种代表动物以及 JP2进行序列分析 ,
基本上包括了鳖甲常见伪品的原动物种类。又经过
10件鳖甲样品鉴别试验 ,鉴别引物 IT-L02和 I T-
H02能够特异性的鉴别出全部中华鳖样品。该鉴别
引物的理论 Tm 值 , IT-L02为 72℃ , IT-H02为
68℃。有了这对鳖甲鉴别引物后 ,当鳖甲样品需要鉴
定时 ,只要从中抽提出 DNA,鉴别引物进行 PCR扩
增 ,经琼脂糖凝胶检测 ,即可鉴别出真伪。
运用位点特异性引物鉴定中药材已在蛇类、龟
甲等药材中取得成功 [10～ 12 ]。本研究设计的位点特异
性鉴别引物可以配制成鉴定试剂盒 ,从而便于药检
部门用该分子标记技术鉴定鳖甲。
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红树莓植株再生系统的建立
肖娅萍 ,王 之 ,张志勤 ,刘全宏⒇
(陕西师范大学生命科学学院 ,陕西 西安　 710062)
摘　要: 目的　建立红树莓的再生系统 ,短期内获得大量优质种苗。 方法　利用红树莓的茎尖和茎段作为外植体 ,
采用正交实验设计筛选培养基。结果　筛选出了红树莓愈伤组织、不定芽及不定根的最佳诱导培养基 ,在实验室建
立了程序简单、重复性好的再生系统 ,实现了红树莓组培苗的快速繁殖。 结论　用 M S培养基作为基本培养基 ,附
加 BA 0. 2 mg / L+ N AA 1. 0～ 1. 5 mg /L适用于愈伤组织的诱导 ;附加 BA 1 mg /L+ NAA 0. 1～ 0. 2 mg /L+ GA3
6～ 8 mg / L+ C H 300 mg / L适于芽的诱导 ;附加 BA 1 mg / L+ N AA 0. 1 mg /L+ GA3 2 mg /L适于芽的繁殖 ;附加
IB A 0. 1 mg / L+ NAA 0. 5 mg /L适于根的诱导。
关键词: 红树莓 ;组织培养 ;植株再生系统 ;快速繁殖
中图分类号: R282. 13　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0738 04
Establishment of plantlet regeneration system of Rubus idaeus
XIAO Ya-ping , W ANG Zhe-zhi, ZHANG Zhi-qin, L IU Quan-hong
　　 ( Co lleg e o f Life Science, Shanxi Normal Univ er sity , Xi′an Shanxi 710062, China)
Abstract: Object　 To establish a plantlet reg eneration system of Rubus idaeus L. for the purpo se to
obtain a la rg e number of high quali ty seedling in a sho rt time. Methods　 Stem apex and pa rt of the stem
w ere used a s the explant and the optimal cul ture media and conditions w ere selected by o rthogona l design.
Results　 An optimum culture medium fo r the induction of callus, adventi tious bud and roo t was obtained
which can be ca rried out in the labo rato ry w ith comparativ e ease and good repea tabili ty. Conclusion　 A
basic medium + BA 0. 2 mg /L+ N A A 1. 0～ 1. 5 mg /L w as most sui table fo r the induction of callus; a
·738· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2001-02-08作者简介:肖娅萍 ( 1956-) ,女 , 1981年 2月毕业于陕西师范大学生物系 ,副教授。主要从事植物学及植物组织培养方面的教学与科研工作。近年来先后承担国家自然科学基金 3项 ,省部级研究基金 1项。曾分别获得陕西省教委二等奖 2项 ,省政府三等奖 2项 ,发表学术论文 20余篇。