全 文 ：从高温高压蒸煮过的中华鳖甲和骨骼中提取及扩增DNA△
南京师范大学遗传资源研究所( 210097) 刘中权 王义权* * 周开亚
摘 要 为验证经高温加工过的鳖甲是否可以用 DNA 分子标记鉴定,选取经高温高压蒸煮过的中华鳖鳖甲和骨
进行 DNA 提取, 并用通用引物 L1091 和 H1478扩增。结果表明经高温高压蒸煮过的鳖甲也可以提得较高质量的
DNA,与从肌肉和药材鳖甲中提取的 DNA 比较没有明显差异, 并可用作模板进行 PCR 扩增, 得到约 400 bp 基因
片段; 同时还讨论了 DNA 提取和扩增过程中应注意的问题, 为分子遗传标记技术广泛应用于同类药材的鉴定积累
了基础资料。
关键词 中华鳖甲和骨骼 DNA 提取 PCR扩增
Extraction and Amplification of DNA from Autoclaved
Chinese Soft-Shelled Turtle ( Trionyx sinensis) Shell and Bone
Institute o f Genetic Resour ces, Nanjing Normal U niver sity ( Nanjing 210097) L iu Zhongquan, Wang Yiquan and Zhou
Kaiya
Abstract In order to ascertain w hether autoclaved T rionyx sinensis Wiegmann could be
authent icated by DNA molecular technolog y, DNA from boiled, steamed, and autoclav ed shells and bones
of the tur tle w ere ex t racted and the template DNA amplif ied by univ er sal pr imer s L-1091 and H-1478. T he
results show ed that there w ere no differences betw een the DNA obtained from the auto claved material in
compar ison w ith tho se obtained from the boiled, steamed or t radit ionally pr ocessed crude drug. A 400 bp
DNA fragment w as amplif ied successful ly f rom both boiled bone and muscles of crude dr ug under standar d
PCR condit ions using the univer sal pr imer s. T he issue of DNA ex tract ion and amplif icat ion w ere also
discussed.
Key words Chinese sof t-shel led turt le ( Tr ionyx sinensis Wiegmann ) shell and bone DNA
extract ion PCR amplif icat ion
中华鳖 T rionyx sinensis Wiegmann 鳖甲是常
用中药材。王亚明等从保存 10年的药材龟甲和鳖甲
中提得 DNA,并用扩增线粒体 DNA Cy t b 基因片
段的通用引物进行 PCR扩增[ 1] ,但未说明药材鳖甲
是否经高温蒸煮过。而实际收购的药材中, 有许多鳖
甲经过高温蒸煮。对于这些鳖甲能否用于提取
DNA ,所提得的 DNA结构是否被破坏,最终能否用
于 PCR 扩增,也就是说 DNA 分子标记鉴定是否适
用于经高温蒸煮过的鳖甲? 对于其它经高温蒸煮加
工过的药材, 如用 DNA 分子标记鉴定也存在着类
似问题。为此本文选取高温高压蒸煮过的中华鳖甲
和骨骼进行实验研究。
1 材料和方法
1. 1 实验材料: 经砂锅用水煮过的中华鳖甲2 块和
骨骼 2 件; 蒸过的中华鳖甲 5 块(分别蒸 0. 5, 1, 2
h) ,高压灭菌锅蒸过( 126. 8 ℃, 0. 148 M Pa)的鳖甲
2块(分别蒸 0. 5, 1 h) ,洗净烘干备用。- 20 ℃保存
的原动物标本 1 只, 药材鳖甲 1 只, 用于对照。
1. 2 试剂: 蛋白酶 K, dNTPs, Taq 聚合酶为
Promega 公司产品, SDS 为 Serv a 产品, DNA 为
Marker 和引物为 T akar a 公司合成产品, 其它试剂
均为国产分析纯。
1. 3 DNA 的提取: 取原动物肌肉约 0. 1 g 于 1. 5
mL 离心管中, 加入裂解液( T ris-HCl 0. 01 mol/ L
pH 8. 0, EDTA 0. 01 mol/ L , NaCl 0. 01 mo l/ L ) 0. 4
mL,另加入 SDS 和蛋白酶 K 至终浓度分别为 1%
和 0. 8 g / mL, 55℃水浴保温 8 h,然后用等体积饱
和酚、等体积酚-氯仿、氯仿、氯仿-异戊醇( 24∶1)各
抽提 1 次, 乙醇沉淀 DNA ,室温下干燥, 加 TE 缓冲
液 100 L 溶解 DNA 沉淀。鳖甲的 DNA 抽取过程
除饱和酚抽提 2 次外,余同文献 [ 1]。
1. 4 PCR扩增: 所用引物为 L1091( 5′-AAAAAG
·343·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2000 年第 31卷第 5期
Address : Liu Zongquan, Ins t itu te of Genetic Resources. Nanjing Normal U nivers ity, Nanjing刘忠权 硕士,讲师,研究方向为动物分子生物学,现从事中药材分子鉴定研究,在《药学学报》等刊物上发表论文 10余篇。
* * 联系人, T el : ( 025) 3729111-3328, Fax: ( 025) 3738174, E-m ail : yqw@ pine. njnu. edu . cn
△国家自然科学基金( No. 39870913)、江苏省教委科学基金( 98KJB360010)和江苏省“333工程”人才培养基金资助
CTT CAAACTGGGAT TAGAT ACCCCACTAT -
3′) , H1478( 5′-TGACT GCAGAGGGTGACGGGC
GGT GT GT-3′) , L、H 分别为轻链和重链,数字与人
mtDNA 序列对应。该引物用于扩增第三区和部分
第二区的约 400 bp的线粒体 12S rRNA 基因片段。
PCR 扩增总体积为 30 L 反应液中含 10 mmol / L
Tr is-HCl, pH 8. 3, 50 mmol/ L KCl, 1. 5 mmol / L
M gCl2 , 0. 1%T riton X-100, T aq 酶 1. 5 U, 4 种
dNT P 各 150 mo l/ L , 两个引物各 10 pmol/ L ,
DNA 模板约 100 ng。
反应在 PE2400或PTC200型 PC 仪上进行。循
环参数为 95 ℃预变性 4 m in, 然后进行 95 ℃变性
40 s, 55 ℃复性 40 s, 72 ℃延伸 60 s共 30 个循环,
最后 7 m in 延伸补齐。
1. 5 DNA的检测:取 DNA 的提取液或扩增产物 5
L 在 1. 0%加入 EB 的琼脂糖凝胶上电泳, 在
UVP-Whiter/ U lt raviolet T ransillum inator 上紫外
扫描检测,并自动成相。
2 结果和讨论
从高温高压蒸煮过的鳖甲或骨骼中可以提取到
DNA。从图1可见, 煮过的鳖甲( 3, 4号)和骨骼( 5, 6
号 )、电饭煲蒸过的鳖甲( 7～11 号)与冰冻肌肉( 1
号)和药材鳖甲( 2 号)所提的 DNA 相比较, 没有明
显差异,大多数在 1 000 bp以上。高压锅蒸过的鳖
甲 ( 12, 13) , DNA 片段略有降解, 大多在 2 000 bp
以下。从经电饭煲和高压锅蒸时间长短不同( 0. 5, 1,
2 h)的鳖甲中,得到 DNA没有明显的区别。空白对
照中没有DNA,说明提取过程无 DNA污染。
1-肌肉 2-药材鳖甲 3, 4-煮过的鳖甲 5, 6-煮过的骨
骼 7 和 8, 9 和 10, 11-分别用电饭煲蒸 0. 5, 1, 2 h
12, 13-分别用高压灭菌锅蒸 0. 5, 1 h N-阴性对照
M -Mar ker, DL2000
图 1 从鳖甲和骨骼中提得的 DNA琼脂糖凝胶电泳图
用上述提得的 DNA 模板进行 PCR 扩增,所有
鳖甲和骨骼样品均能扩增出约 400 bp 的 DNA 片
段,而空白对照无扩增产物, 可见提取过程和 PCR
扩增过程中都无外源 DNA 的污染。图 2为 PCR增
产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
(样品编号同图 1)
图 2 RCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
中药材 DNA 分子标记鉴定, 一般要求药材
DNA 提取和扩增过程中必须严防外源 DNA 的污
染。本实验用去污剂洗涤和紫外线照射样品, 彻底去
除样品表面外源 DNA,所有实验过程都在超净台上
进行。捣碎鳖甲的铜臼每用一次,用洗涤剂和超纯水
清洗后, 倒入酒精烧烤灭菌,以确保实验的准确性。
在 DNA 提取和扩增过程中均设立了空白对照。
鳖甲和骨骼中含有大量的 Ca2+ 和其它矿物离
子, DNA 提取时, 它们的存在不利于裂解液的消化
作用,在随后的 PCR 反应中也有抑制作用, 因此必
须将 Ca2+去除。一般肌肉或血液的 DNA 提取裂解
液中 EDT A 浓度为 10 mmol / L ,本研究中除裂解液
中的 EDTA 的浓度提高为 100 mmol/ L 外,还在裂
解液消化之前,用 0. 5 mol/ L EDT A 脱钙 72 h, 并
在中间换两次新鲜EDTA 溶液,达到去除Ca2+的目
的。然后再用蛋白酶K 和SDS 消解已软化的鳖甲或
骨骼粉末, 用苯酚氯仿抽提, 一次抽提往往不够彻
底,可以采取两次或多次抽提的办法解决,以提高模
板 DNA 的纯度,便于随后的扩增。
王亚明等从药材龟板和鳖甲中提取的 DNA 模
板, 用常规方法进行 PCR 扩增时, 得不到 DNA 扩
增产物, 再次用苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀、透析模板
DNA, 甚至用 DNA 纯化试剂盒纯化模板 DNA 后,
也未能扩增出目的 DNA 片段,认为 DNA 提取液中
含有某种抑制 PCR 反应的抑制剂, 通过加入 BSA
(小牛血清白蛋白)和过量的 Taq 酶,便可得到目的
DNA 片段, 有无 BSA 并不影响扩增结果。可见
DNA 提取中杂质去除的是否彻底是影响 PCR反应
的关键。此外 PCR反应中加入 DNA 模板量的多少
对扩增也有一定影响,特别是从动物的甲和骨骼中
所提的 DNA, 模板量过多复性时会与引物竞争, 从
而大大地抑制引物结合到 DNA 链上, 同时也增加
了其它抑制因素;模板量过少,减少了引物与 DNA
链结合的机会, 也影响扩增反应的结果。因此在初次
扩增时可选择不同浓度梯度的模板量, 从中选择最
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适的浓度。
近年来, 分子遗传标记技术逐渐应用于中药材
的鉴定[ 2～8]。这一技术的应用,首先必须能够从药材
中抽提出DNA。在中药材加工过程中,许多药材经
过高温蒸煮、炮制、煎制等过程, 能否从这些药材中
提得DNA,是分子遗传标记技术能否广泛用于中药
材真伪鉴定的关键。本研究表明,经高温高压蒸煮过
的鳖甲或骨骼中仍含有大量的 DNA, 用一般的
DNA 提取方法,即能从少量的鳖甲样品中提得足够
的 DNA, 用扩增线粒体 12S rRNA 基因片段,通过
用引物进行 PCR扩增, 能获得稳定的阳性产物。从
而给我们一个重要的启示, 即经过高温、高压蒸煮过
的中药材也可以获得用于 PCR扩增的微量 DNA,
本实验的结果为分子遗传标记技术广泛应用于中药
材的真伪鉴定提供了基础资料。
参 考 文 献
1 王亚明,等 . 药学学报, 1996, 31( 6) : 472
2 吴 平,等 . 药学学报, 1998, 33( 4) : 304
3 王义权,等 . 药学学报, 1997, 32( 5) : 384
4 Hash imoto A, et al . Natu ral M edicines , 1998, 52( 1) : 38
5 Fushimi H, et al. Phytomedicine, 1996, 3: 387
6 吴 平,等 . 中国药科大学学报, 1998, 29( 1) : 28
7 王建云,等 . 中国药科大学学报, 1996, 27( 8) : 471
8 王义权,等 . 药学学报, 1998, 33( 12) : 941
( 1999-04-02收稿)
HPLC法测定汉丹肝乐胶囊中芍药苷的含量△
贵阳制药厂( 550004) 冯艳明 叶丽梅
贵阳医学院 杨继红
摘 要 采用 HPLC 法测定汉丹肝乐胶囊中芍药苷的含量。色谱柱 C18柱,流动相甲醇-水( 28∶72) ,检测波长 230
nm,流速 1 mL / min,柱温室温, 灵敏度 0. 04 AUFS。结果芍药苷在 0. 049～0. 868 g 范围线性良好, r= 0. 999 9,平
均回收率为 99. 3% ( n= 5) , R SD= 2. 09%。
关键词 汉丹肝乐胶囊 芍药苷 HPLC 法
汉丹肝乐胶囊系由汉防己、丹参、赤芍、黄芪、银
杏叶等 5味中药制成的复方制剂,具有活血化瘀、舒
肝理气的功能,用于治疗各种病因所致的肝纤维化
及肝硬化。为了更好地控制质量, 我们采用 HPLC
法对君药之一的赤芍主要成分芍药苷进行含量测
定。经方法学考察,认为本法简便、准确、无干扰,可
用于本品质量控制。
1 仪器、试剂与药品
IC-9A 高效液相色谱仪(日本岛津) , SPD-6AV
检测器, C-R6A 积分仪; GQ 250 超声波清洗器 (上
海超声仪器厂) ; 751紫外分光光度计(日本岛津)。
芍药苷对照品 (中国药品生物制品检定所
0736-9608, HPLC 归一化法测得含量为 97. 06%) ;
汉丹肝乐胶囊及其缺赤芍空白样品(自制) ; 试剂均
为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件: YWG-C18柱( 4. 6 mm×250 mm ,粒
径 10 m) ,流动相甲醇-水( 28∶72) , 检测波长 230
nm , 柱温室 温, 流速 1 mL/ m in, 灵 敏度 0. 04
AU FS, 进样量10 L。此条件下,样品中芍药苷与其
他组分峰达到基线分离, 理论塔板数按芍药苷峰计
算为 4 619, 芍药苷保留时间为 14. 44 min, 空白试
验表明无干扰。
2. 2 实验条件选择: 检测波长:据文献值[ 1] ,并对
芍药苷的 50%乙醇溶液进行紫外波长扫描,结果表
明芍药苷在 230 nm 处呈最大吸收, 以此为检测波
长, 经 HPLC 试验,图谱分离效果好。 流动相: 据
文献值[ 2, 3] ,大都采用甲醇-水系统,我们采用不同比
例的甲醇-水进行试验,结果表明选用甲醇-水( 28∶
72)为流动相,分离效果好。 提取溶剂与方法:曾采
用水和 50%乙醇为溶剂,分别以浸润后提取与直接
提取、回流法与超声波振动法进行对比试验, 结果差
异不明显, 以 50%乙醇超声波振荡提取法较为简
便,效果好。提取时间: 将供试品用 50%乙醇进行
·345·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2000 年第 31卷第 5期
Address : Feng Yanming , Guiyang Ph rmaceu tical Factory, Gu iyang冯艳明 女,工程师。1982年毕业于华西医科大学化学制药专业,学士学位。从事制药工程工艺设计、生产技术管理及天然药物开发研制。曾在《中国中药杂志》、《中成药》等杂志上刊登论文数篇。
△贵州省“九·五”攻关项目,黔科合计字( 1996) 1028号