全 文 ：茶多酚对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
欧阳平 ,彭文烈 ,赖文岩 ,徐安龙
(中山大学生命科学学院 ,广东 广州　 510275)
摘　要: 目的　探讨茶多酚对离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。 方法　体外培养大鼠主动脉血管平
滑肌细胞 ,应用不同剂量的茶多酚作用 24 h后 ,采用 M TS /PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。 应用流式细
胞术测定细胞周期。结果　与对照组相比 ,茶多酚对血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用 (P < 0. 001)。流式
细胞术检测结果表明 ,茶多酚可以使血管平滑肌细胞大部分处于 G0 /G1期 ,与对照组相比有明显差异 (P < 0. 05) ,
并且可以诱导其凋亡。 结论　茶多酚可明显抑制离体大鼠血管平滑肌细胞的增殖。
关键词: 茶多酚 ;平滑肌 ;血管 ;细胞增殖
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1102 03
Effects of tea polyphenols on rat vascular smooth muscle cells proliferation
OUYANG Ping , PEN G Wen-lie, LAI Wen-yan, XU An-long
( Colleg e of Life Science, Sun Yat-sen Univ ersity, Guang zhou 510275, China)
Abstract: Object　 The purpose o f this study was to determine the effects of tea polyphenols on rat
va scular smooth muscle cells ( V SMCs) pro liferation. Methods　 Rat aortic V SMCs w ere cultured and
treated w ith tea po lyphenols for 24 h. Cell pro li feration was quanti fied by colo rmetric assay and defini ted
by M TS /PES. Cell cycle analy sis was perfo rmed by f low cy tometry. Results　 Compared wi th the control
g roup, V SMCs g row th was signi ficant ly inhibited by tea polyphenols (P < 0. 001) . Cel l number in G0 /G1
pha se of tea po lypheno ls ( 1 mg /mL) g roup w as higher than those o f the control g roup ( P < 0. 05) by flow
cy tometry analysis. Apoptosis w as observ ed in tea polyphenols g roups by f low cytometry. Conclusion　
The tea polypheno ls can ma rkedly inhibi t the rat V SMCs prolifera tion.
Key words: tea polyphenols; smooth muscle; vascular; cell pro li feration
　　血管平滑肌细胞 ( V SMC) 增殖和表型改变是
动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄的主要病理基
础 [ 1]。茶多酚 ( tea polyphenols, T P)是从天然植物
茶叶中分离提纯出来的多酚类化合物的复合体。近年
来研究表明 ,茶多酚具有多种药理效应 ,如抗氧化、调
血脂、防止血栓形成和抗衰老、抑制已形成肿瘤的大
小、数目及其转移 [2, 3 ]等作用。但茶多酚能否抑制血管
平滑肌细胞增殖及其作用机制目前尚不清楚。本研究
观察了绿茶茶多酚对离体大鼠血管平滑肌细胞增殖
和细胞周期的影响 ,为治疗以血管平滑肌细胞增殖为
主的心血管疾病筛选新的天然药物先导物。
1　材料与方法
1. 1　材料: DMEM 培养基购自 Gibco公司、胎牛
血清 ( FBS) , 0. 25% 胰酶均购自 Hyclone公司。一
次性细胞培养瓶、 96孔板购自 Corning公司。 HEP-
ES、碘化丙啶 ( Propidium lodide, PI)均购自 Sig-
ma公司 ,茶多酚复合物系从广西桂平西山绿茶中
经本实验室采用特殊工艺提取制备 ,为浅褐色粉末 ,
多酚类化合物含量> 95% 。
1. 2　血管平滑肌细胞的原代培养:参考王道生贴块
法 [4 ]进行。选用 6周龄雄性 SD大鼠 (第一军医大
学实验动物中心提供 ) ,断头处死 ,取胸主动脉中膜
以贴块法培养于含 10% 胎牛血清的 DM EM培养
基中 ,置于 37℃、 5% CO2孵箱中培养 ,一周后可见
细胞从组织块边缘爬出 , 2～ 3周出现致密细胞层 ,
此时即可传代 ,传代细胞呈典型的“峰与谷”样生长 ,
细胞经抗 α-actin抗体鉴定为平滑肌细胞。实验所用
的血管平滑肌细胞均为第 3～ 6代传代细胞。
1. 3　实验所用的 TP用含 0. 5% FBS的 PBS重新
配制 ,用 0. 22μm的滤膜过滤 ,而后用含 5% FBS
·1102· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-04-26基金项目:广州市科技攻关项目资助 ( JB00000448165)作者简介:欧阳平 ( 1965-) ,男 ,医学博士 , 1987年毕业于广州第一军医大学 ,现为第一军医大学附属南方医院心血管内科主治医师、讲师 , 2000年中山大学生命科学学院博士后。 Tel: ( 020) 61647640
* 通讯作者:徐安龙　 Tel: ( 020) 84113655; E-mail: l s36@ zsu. edu. cn
的 DMEM培养液稀释至所需的终浓度。
1. 4　细胞增殖评价: SD大鼠血管平滑肌细胞用
0. 25% 胰酶消化 ,然后在 96孔板中以 5 000个细
胞 /孔的密度铺板。 8 h后 ,换成无血清、含谷氨酸的
DMEM培养基 ,无血清条件维持 48 h以获得同步
的细胞生长停止 ,然后 ,换成含 5% FBS的 DMEM
培养基及相应的实验试剂 ,每组实验重复 6次 ,每
一组每次为 6个孔 ,对照组为含 5% FBS的
DMEM培养基 , 24 h 后细胞的增殖率通过应用
CellTi ter 96 Assay M TS /PES试剂盒 ( Promega
Co. U. S. A, Cat 5421)确定。具体方法是 MT S /
PES 20μL加入相应的孔中 , 96孔板在 5% CO2 ,
37℃ 孵箱中孵育 90 min,然后在 Bio-Rad 550型
Micropla te reader以 490 nm测吸光度 ,每孔重复 3
次 ,细胞的增殖率用吸光度来表达。
1. 5　流式细胞仪对血管平滑肌细胞周期的检测:
4℃ , 1 000 r /min离心 5 min,收获细胞 ; PBS洗两
次 , 4℃ , 1 000 r /min离心 5 min,弃上清 ,用含 2%
FBS 的 PBS 制备 单细胞 悬液 , 使细 胞数为
1× 106 /mL;吸取 1 mL细胞到 15 mL离心管中 ,加
3 mL冰无水乙醇;在 4℃固定细胞 24 h。 PBS洗细
胞两次 ,加入 1 mL的 PI染色液至离心管 ,加入 50
μg /mL的 RNase A原液 , 4℃ 孵育 3 h ,然后在流
式细胞仪 Eli te (美国 Coul ter公司 )上进行检测 ,采
用 MU T ICYCLE软件 ( Phoenix公司 )分析结果。
1. 6　统计学分析:资料以 x± s表示 ,应用 SPSS软
件包 ,采用 ANOVA和 Student-Newman-Keuls检
验分析。
2　结果
　　 SD大鼠血管平滑肌细胞生长静止后 ,以不同
浓度的 T P与 5 000个细胞 /孔的离体大鼠血管平
滑肌细胞共同孵育 24 h,观察 TP对大鼠血管平滑
肌细胞增殖的影响。反映各组细胞增殖的吸光度结
果及统计分析见表 1,结果表明 , T P能有效地抑制
大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ( P < 0. 001) ,但抑制作
用不呈药物浓度依赖性 ( P> 0. 05)。流式细胞术测
定的结果显示 1 mg /mL的 T P可以使 V SMC大部
分处于 G0 /G1期 ,与对照组相比有明显差异 ( P <
0. 05) ,结果见表 2;同时 , 1 mg /mL和 100μg /mL
的 TP分别可诱导部分细胞发生凋亡 ,流式细胞术
检测显示 DNA直方图出现 DNA降解的亚 G1期凋
亡峰 ( AP) ,而对照组则没有显示 AP峰 ,结果见
图 1。
3　讨论
表 1　 TP对大鼠血管平滑肌
细胞增殖的影响 ( x± s, n= 6)
组　别 浓度 (μg /m L) 细胞增殖率 (λ)
对照 - 　　　　 0. 935± 0. 178
T P 1 000 0. 575± 0. 197* * *
900 0. 594± 0. 125* * *
800 0. 629± 0. 156* * *
700 0. 672± 0. 052* * *
600 0. 687± 0. 146* * *
500 0. 627± 0. 077* * *
400 0. 681± 0. 132* * *
300 0. 544± 0. 087* * *
200 0. 697± 0. 141* * *
100 0. 599± 0. 098* * *
　　与对照组相比: * * * P < 0. 001
表 2　 TP对大鼠血管平滑肌
细胞周期的影响 ( x± s, n= 6)
组　别 浓度
(μg /m L)
24 h
G0 /G1 S G2 /M
对照 - 　 79. 0± 3. 8 　 5. 3± 1. 6 　 15. 7± 1. 7
T P 1 000 86. 1± 4. 3* 3. 6± 1. 3 10. 3± 0. 8
100 81. 7± 2. 6* 9. 5± 0. 6 8. 8± 1. 5
　　与对照组相比: * P < 0. 05
A-对照组　 B-T P 1 000μg /m L　 C-T P 100μg /m L
图 1　 TP诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡的效应
　　研究表明 , TP对金属离子、生物碱和生物大分
子 ,如碳氢化合物、蛋白质和核酸有高度的亲和力 ,
这是 T P多种作用的结构基础 [ 5]。国内谢冰芬等用
流式细胞术发现 TP可使鼻咽癌 CN E2细胞停滞于
G1期 ,并诱导其凋亡 [6 ]。另有学者发现 TP可诱导人
肺癌细胞 PC-9停滞于 G2 /M 期 [ 7] ,诱导 Molt 4B
淋巴细胞性白血病细胞的凋亡 [ 8]。但目前 TP对血
管平滑肌细胞的增殖作用的影响尚不清楚。 我们的
初步研究结果表明 ,绿茶茶多酚在体外能够抑制大
鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,流式细胞术检测结果显
示 TP能够使血管平滑肌细胞停滞于 G1期 ,并且能
够诱导其凋亡。说明 TP不仅对肿瘤细胞有作用 ,而
且对良性生长的血管平滑肌细胞也有抑制增殖的作
用 ,此作用系通过使细胞停滞于 G1期 ,并且诱导其
·1103·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
凋亡来实现的。
最近 ,有报道 TP能够强烈抑制细胞端粒酶的
活性 ,引起肿瘤细胞端粒的缩短、染色体的改变和抑
制与细胞寿命相关的 β-半乳糖苷酶的表达 ,从而使
得肿瘤细胞产生凋亡 [9 ]。因此 , TP可能亦通过此效
应诱导血管平滑肌细胞产生凋亡。
综上所述 ,研究结果表明 ,绿茶茶多酚能够明显
抑制离体大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,使得血管平
滑肌细胞停滞于 G1期 ,并且能够诱导其凋亡 ,可望
开发成为一种治疗以血管平滑肌细胞增殖为主的心
血管疾病如血管成形术后再狭窄的药物。
参考文献:
[1 ]　 Lusis A J. Atherosclerosi s [ J]. Natu re, 2000, 407: 233-241.
[2 ]　何　皎 .茶多酚的药理学研究概况 [ J ]. 数理医药学杂志 , 1999,
12( 4): 372-374.
[ 3]　 Sazuka M, Mirakami S, Isemura M . Inhibi tory ef fects of g re-
en infusion on in vit ro invasion and in viv o metas tasis of mouse
lung carcinoma cells [ J ]. Cancer Let t, 1995, 98( 1): 27-31.
[4 ]　徐叔云 .药理实验方法学 [M ]. 北京:人民卫生出版社 , 1991.
[ 5]　 Yang C S, Wang Z Y. Tea and cancer [ J] . J Natl Cancer Inst ,
1993, 859( 8): 1038-1049.
[ 6 ]　郝东磊 ,谢冰芬 ,刘宗潮 . 茶多酚对人鼻咽癌 CNE2细胞周期
影响的流式细胞术的检测 [ J ]. 国外医学 -药学分册 , 1998, 25
( 5): 64-66.
[7 ]　 Okabe S, Sugan uma M, Hayashi M , et al . M ech anisms of gr-
w oth inhibi tion of h uman lung cancer cell line, PC-9, by tea
polyph enols [ J] . Jpn J Caner Res , 1997, 88( 7): 639-643.
[8 ]　 Achiw a Y, Hibasami H, Katsuzaki H. Inhibi tory ef fects of
persimmon ( Diospyros kaki ) ext ract and related polyph enol
com pounds on grow th of h uman lymphoid leukemia cells [ J].
Biosci Biotechnol Bioch em, 1997, 61( 7): 1099-1101.
[9 ]　 Imad Naasani, Hiroyudi Seimiya. Telomerasae inhibi ti on, te-
lom ere sh ortening and senscence of cancer cell s by tea cate-
chins [ J ] . Bioch emical and Bioph ysical Research Comm unica-
tions, 1998, 249( 2): 391-396.
沙苑子提取物对小鼠四氯化碳肝损伤的保护作用
刘春宇1 ,顾振纶1 ,韩　蓉1 ,朱路佳 1 ,周文轩 2 ,郭次议 2
( 1. 苏州大学医学院 药学系、苏州中药研究所 ,江苏 苏州　 215007; 2. 香港保健协会 ,香港　 )
摘　要:目的　探讨沙苑子醇提物石油醚部位 ( LACE) 和水溶液部位 ( W ACE)对小鼠 CCl4肝损伤的保护作用。
方法　采用 CCl4小鼠急性肝损伤模型 ,测定血清谷丙转氨酶 ( ALT )、谷草转氨酶 ( AST ) 活性、肝组织 MDA含
量 ,并观察肝组织病理变化。结果　 0. 1% CCl4 0. 1 m L /10 g可使小鼠血清 ALT , AS T活性和肝组织 M DA含量明
显升高 (P < 0. 001)。 沙苑子醇提物 LAC E和 W ACE (相当于生药 5, 15 g /kg ) 均可使肝损伤小鼠的 ALT和
M DA显著降低 (P < 0. 001) , W ACE并能显著降低 AST活性 ;病理镜检结果显示 WACE能显著减轻肝细胞炎症
反应和碎屑样坏死 (P < 0. 01)。 结论　沙苑子提取物有显著的抗肝损伤作用 ,以 W ACE部位更明显 ,其作用机制
可能与抗脂质过氧化有关。
关键词: 沙苑子 ;四氯化碳 ;肝损伤 ;抗氧化作用
中图分类号: R286. 55　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1104 03
Protective effect of extract in seed of Astragalus complanatus on acute
hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice
LIU Chun-yu1 , GU Zhen-lun1 , HAN Rong1 , ZHU Lu-jia1 , ZHO U Wen-xuan2 , GUO Ci-yi2
( 1. Depar tment of Pharmacy , Medical Colleg e of Suzh ou Univ ersity , Suzh ou Institute o f Chinese
Mete ria Medica , Suzhou 215007, China; 2. Hong Kong Health Ca re Association, Hong Kong , China )
Key words: the seed of Astragalus complanatus Bge. ; carbon tet rachlo ride; hepatic injury; antioxida-
tion
　　沙苑子为豆科植物扁茎黄芪 Astragalus com-
planatus R. Br干燥成熟的种子 [1 ]。具有温补肝肾 ,
固精 ,缩尿 ,益肝明目的功能。药理研究表明沙苑子
提取物具有改善血液流变学指标、降低血压、调节血
脂、抑制血小板聚集、保护肝脏、增强免疫功能、抗
炎、镇痛及调节中枢神经系统等作用 [2 ]。为了进一步
阐明沙苑子保肝有效成分 ,本实验观察了沙苑子醇
提物的石油醚部位 ( LACE) 和水溶液 部位
·1104· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-06-07基金项目:香港保健协会资助项目作者简介:刘春宇 ( 1961-) ,女 ,江苏人 ,副教授 ,苏州大学医学院药学系天然药物教研室主任 ,主要从事中药有效成分及药理作用研究 ,目前主要研究中药保肝抗纤维化有效成分。 Tel: ( 0512) 65125091 65226475