全 文 ：15　张宗勤 ,杨建英 ,吴耀武 .西北植物学报 , 1998, 18( 4): 488
16　 Hirasuna T J, Peatchanker L J, Srinivasan V , et al . Plant Cell
Tis s and Org Cul , 1996, 44: 95
17　 Fet t-Neto A G, M elanson S J, Sakata K, et al . Bio Tech nol,
1993, 11: 731
18　 Fet t-Neto A G, Zhang W Y, Dicosmo F, Biotech Bioeng,
1994, 44: 205
19　 Wickremesinhe E R M , Arteca R N, J Plan t Ph ysiol, 1994,
144: 183
20　甘烦远 ,郑光植 ,袁丽萍 ,等 .植物生理学报 , 1997, 23( 1): 43
21　 Ketch um R E B, Gibson D M. Plant Cell Tis s Org Cul, 1996,
46: 9
22　 Mirjalili N , Linden J C. Biotech Bioeng, 1995, 48: 123
23　 Bringi V , Prakash G. WO Patent 17121, 1993
24　吴兆亮 ,元英进 ,胡　萍 ,等 .中草药 , 1998, 29( 9): 589
25　 Fet t-Neto A G, Melanson S J, Nicholson S A, et al . Bio tech
Bioeng, 1994, 44: 967
26　 Dai Q L, Xingguo M ei, Lu Ming Bo. 华中理工大学 1997年研
究生学术年会优秀论文集 , 1997: 170
27　李家儒 ,曹孟德 ,刘曼西 ,等 . 植物研究 , 1999, 19( 3): 356
28　甘烦远 ,彭丽萍 ,郑光植 . 云南植物研究 , 1996, 18( 4): 451
29　 Yukihi to Y, Tabata H, Higashi Y, et al . Natu re Biotech ,
1996, 14: 1129
30　 Ciddi V , S rinivasan V , Sh uler M J. Bio tech Lett , 1995, 17
( 12): 1343
31　 Ch ris ten A A, Gibson D M , Bland J. US Patent 5019504, 1991
32　元英进 ,董　芳 ,韩金玉 ,等 .迎接 21世纪新的挑战——第七届
全国生物化工学术会议论文集 . 北京:北京工业出版社 , 1996:
537
33　李家儒 ,刘曼西 ,曹孟德 ,等 . 植物研究 , 1998, 18( 1): 78
34　荆迎军 ,刘曼西 ,柯　铁 ,等 . 生物技术 , 1998, 8( 4): 21
( 1999-12-14收稿 )
药用植物发根培养及发根培养器△
广州暨南大学生物工程系 ( 510632)　　徐明芳
摘　要　分析了发根培养技术生产次级代谢产物及发根培养器 (反应器 )在中药领域的国内外研究动态 ,表明药用
植物发根培养的基础理论研究已远远超过了发根培养器的应用研究 ,而药用植物发根培养生产次级代谢产物的工
业化前景则主要取决于多功能发根培养器的研制成功。
关键词　发根培养　药用植物　发根培养器
　　 80年代后期 ,在植物细胞培养技术领域中发展
起来一项发状根 ( hai ry ro ots)培养的新技术。它是
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes含有的 Ri-
质粒中的 T-DNA片段整合到植物细胞的 DNA
上 ,诱导出发状根 ,从而建立起毛状根培养系统。目
前世界上许多国家如美国、英国、日本、韩国及中国
等都对中药植物和农用植物进行了大量深入的发根
培养的基础理论研究。实验证明 ,毛状根培养系统具
有发根生长迅速、不需要外源性生长激素、生产次级
代谢物高和遗传特性稳定等特点 ,这是细胞培养和
一般器官培养所不能兼备的 ,因此 ,几乎所有双子叶
植物中由根部合成的次级代谢物大多数都可以用毛
状根来生产 ,为利用发根培养技术生产药用重要植
物次级代谢物 (如紫杉醇、抗疟疾青蒿素等药物 )及
食品天然色素、香精香料开辟了新的途径 [1 ]。然而利
用发根培养器对毛状根培养研究却远远落后于发根
培养的基础研究 ,目前除日本、英国、南朝鲜等各国
研究人员在发根培养器方面进行了一些基本的实验
研究外 [ 2～ 5] ,发根培养用于大规模生产药用植物次
级代谢产物并正向工业化的发展方向几乎为空白 ,
因此中药植物发根培养生产药用植物次级代谢产物
能否实现产业化 ,则关键取决于发根培养器的研制
成功。发根培养器已成为制约发根生物技术应用于
医药和农业领域的关键因素 ,大规模植物发根培养
生物反应器的研究迫在眉睫。
1　药用植物发根培养系统与次级代谢物生产
植物细胞培养的最大问题是培养中的细胞遗传
和生理的高度不稳定性 ,细胞间的不一致性 ,在培养
过程中高产菌株不能实现高产率 ,且易形成遗传变
异产生其他代谢产物 ,造成生长周期长 ,收得率低 ,
生产成本高 ,阻碍了其工业化的发展前景。然而 ,自
80年代后期国内外大力开展研究发根培养技术生
产次级代谢产物以来 ,由于发根处于器官化的分化
状态 ,这往往有利于次生代谢物的形成和积累 ,并能
够合成许多悬浮细胞所不能合成的物质 ,生理生化、
遗传特性也相当稳定 ,在医药行业受到广泛的重
视 [6 ]。目前已有不少的药用植物被诱导并产生了发
根 ,且次生代谢物的含量与植物细胞培养相比也大
大提高。
天花粉为葫芦科植物栝楼 Trichosanthes kir-
·798· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 10期
Address: Xu Mingfang , Department of Bioengineering, Jinan Universi ty, Guang zh ou徐明芳　副教授 ,博士后 , 1996年毕业于华南理工大学食品与生物工程学院 ,获工学博士学位 , 1996～ 1998年在华南师范大学生物学博士后工作站专职研究两年 ,现任暨南大学生物工程系教师。 主要研究方向是光生物反应器及其在生物领域中的应用和环境生物生物技术等。△本项目由广东省科学基金资助 ( NO: 980022)
ilowii的根 ,近年来研究发现 ,天花粉蛋白 ( tri-
cho santhin) 能抑制绒毛膜上皮癌细胞的生长和调
节免疫反应 [ 7] ,尤其是天花粉蛋白 GLQ223能够选
择性地抑制 HIV在感染的免疫系统细胞内的复制 ,
减低免疫细胞中受病毒感染的活细胞数 [8 ]。 文
献 [9～ 13 ]报道了利用栝楼发根生产一些生理活性物
质及天花粉蛋白的研究 ,其结果表明 ,由于栝楼发根
的生长速度比人工栽培栝楼块根的生长速度快几十
倍 ,因此 ,从栝楼发根中得到的天花粉蛋白的量显著
高于从人工栽培栝楼块根中的提取量 ,而且 ,也高于
用基因工程方法得到的天花粉蛋白 [14, 15 ] ,可见栝楼
发根生产天花粉蛋白具有明显的优越性 [ 13]。文献分
别报道了利用发根农杆菌转化短叶红豆杉 Taxus
brev ifol ia和 T . chinensis及短叶红豆杉愈伤组织
细胞形成毛状根生产紫杉醇 [16, 17 ] ,经紫杉醇单克隆
抗体酶联免疫反应检测 ,其紫杉醇含量比用组织和
细胞培养方法最多提高 50倍。黄遵锡 [18 ]等人对云
南短叶红豆杉也进行了此项研究 ,表明利用发根农
杆菌 A4诱导毛状根培养物生长速度快 ,合成紫杉
醇能力强 ,与细胞培养相比 ,由于毛状根生长速度
快 ,分支多 ,毛状根本身处于器官化水平 ,产物产量
高。因此利用毛状根培养生产植物次级代谢产物具
有极大的生产潜力 ,将为紫杉醇的药源提供新的途
径。黄花蒿 Artemisia annua L. 性寒味苦 ,为传统清
热解暑药物。其有效成分青蒿素 ( artemisinin)是抗
疟疾有效单体 ,已成为世界卫生组织推荐的产
品 [19, 20 ]。 用青蒿发根培养及青蒿素的生物合成 ,经
过 25 d的培养 ,青蒿素产量为 223. 3 mg /L[21～ 24 ] ,
为青蒿素的工业化生产开辟新的途径。大黄是含蒽
醌类成分的常用生药 ,现代药理实验表明 ,许多蒽醌
衍生物 ,如大黄素、大黄酸、大黄素 -1-甲醚、大黄素 -
8-甲醚都具有上皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶抑
制剂活性 ,因而用植物发根培养法生产蒽醌化合物
有可能为开发新的抗癌药物提供一个新的途径。常
振战等人进行天山大黄 Rheum wit trochi i L. 和掌
叶大黄 R. palmatum L. 发根培养并与愈伤组织、
悬浮细胞培养中的蒽醌类成分分析对比 ,结果表明
采用发根农杆菌 9402所含 Ri质粒遗传转化大黄
以诱导发根 ,用纸电泳法检测发根中冠瘿碱的存在 ,
用 HPLC法测定 ,发现其中芦荟大黄素、大黄酸、大
黄素、大黄素 -8-甲醚的含量高于原植物中的含
量 [25 ]。 赛莨菪类 Scopolia lurida植物如颠茄、洋金
花具有麻醉、止痛、解痉的功效 ,尤其是在微循环研
究上的应用 ,已获人们的重视 [ 26] ;张荫麟 [27～ 31 ]是我
国医药界较早开展药用植物发根培养及其有效药用
成分研究的工作组 ,他们先后对赛莨菪类、金荞麦、
丹参、甘草这几种药用植物进行了发根农杆菌的
Ri-质粒转化和发根培养研究 ,结果表明 ,通过几种
药用植物的发根培养 ,无论在毛状根生物量的增加
或药用有效成分的积累方面 ,都显示了发根培养系
统其独特的优越性。利用 14 L搅拌式生物反应器 ,
Hi lton等进行了曼陀罗 Datura strumonium 发根培
养 ,研究了天仙子胺合成的最佳培养基组成和培养
条件 [32 ] ;黄炼栋 [33 ]等对青蒿、丹参、小蔓长春花
Catharantus minor、穿心莲 Androgrphis panicula-
ta、刺果甘草和三七等 6种药用植物发根进行了研
究 ;费厚满 [34 ]利用发根农杆菌对绞股蓝的转换并对
毛状根中的皂苷进行了研究 ;刘树楠 [35 ]进行了银杏
发根的转化及其悬浮培养无性系的建立 ; 谷正
男 [36 ]对黄芪毛状根及甘草毛状根的研究 ,各项研究
表明 ,尽管发根培养技术的发展历史较短 ,但许多的
发根培养植物已建立 ,亲本植株能合成的次生代谢
物都可以应用发根培养技术生产 ,主要的次级代谢
物有生物碱类 (如吲哚、喹林、莨菪烷、喹嗪烷等 )、苷
类 (如人参皂苷、甜菜苷等 )、黄酮类、醌类 (如紫草宁
等 ) ,以及蛋白质 (如天花粉蛋白等 )等药物和天然色
素、香料、天然调味品 ,因此发根培养技术的出现是
次生代谢物研究领域的一次重大飞跃 ,并将成为次
生代谢物生产应用中的一条可靠和有效的途径。
2　药用植物发根培养器
目前的研究大部分局限于采用传统的摇瓶培养
和光照培养箱等小型试验培养。 然而 ,生物反应器
(培养器 )是植物组织培养生产次级代谢物走向工业
化和商业化的关键环节。 90年代初期 ,世界上开展
生物反应器用于植物发根培养研究工作 [2～ 5 ]的国家
主要有日本、英国、韩国等 , Nuutila[37 ]比较了 3种类
型的生物反应器对长春花发根培养和吲哚生物碱的
合成 ,结果表明长春花发根培养和吲哚生物碱的合
成在喷射 (空 )气流 ( Air-Sparg ed )式反应器中最
好 ,发根在搅拌 ( Stirred)式反应器和培养液环流
( M edium Circulation) 式反应器中则不能生长 ,一
方面是由于发根容易受到剪切力或叶轮转动的机械
损伤 ,另一方面则是由于发根生长迅速 ,反应器的发
根密度较高 ,供氧困难 ,因而这两种生物反应器都不
适合发根培养。 固定转动滚筒式反应器 ( Immobi-
lized Rotating Drum Reacto r)
[38 ]既可以供给足够的
氧气 ,又能避免较高的剪切力 ,比较适合发根培养。
Wea thers
[39 ]首次应用超声雾化反应器进行植物发
　　　　　　　　　中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 10期　　　　　　　· 附 1·
根培养以来 ,各种不同类型的超声雾化反应器进行
植物发根培养普遍受到关注。 中科院化冶所刘春
朝 [32 ]也设计了一种内环流超声雾化生物反应器进
行青蒿发根培养。 从国内外的生物反应器的研究表
明 ,发根培养器的结构及其培养系统的研究主要集
中在一是尽可能减低机械剪切力对发根的损伤 (减
少搅拌 ) ;二是提高气液传质速率 ,增加溶氧量 (超声
雾化 )。然而许多研究也表明 ,对有些植物 ,光对发根
的诱导或次级代谢物的形成具有决定作用。 蔡国
琴 [22 ]考察了光对青蒿发根生长及青蒿素的形成 ,结
果说明无光条件 ,无论是在 MS还是在 L培养基
中 ,都不能产生青蒿素 ;黄遵锡 [19 ]比较不同光照条
件下的发根试验 ,发现对短叶红豆杉在全天 24 h光
照时 ,紫杉醇的合成含量较高 ;但国内外对发根生物
反应器及其光源的研究几乎空白 ,国内外也未见报
道光生物反应器应用于发根培养 ,因此开发研究程
控集成光中药植物发根培养器 ,研究植物发根光合
条件下的代谢机制 ,必将为今后发根培养用之于大
规模生产药用植物次级代谢产物并向工业化的发展
方向迈进奠定基础。
3　双功能光生物反应器应用前景
随着植物细胞培养技术的发展和以农杆菌的
Ti质粒的一段 DNA在植物细胞基因组的整合和
表达导致发根转化系统的建立 ,不仅大大推动了植
物遗传转化的研究 ,为遗传工程改良植物抗病毒、抗
蚜虫、抗旱、抗冻等抗性和品质改良提供十分有效的
途径 ,为高产优质品种的选育创造条件 ;而且发根生
长迅速、具激素自主性、分化水平高、遗传特性稳定、
合成能力强 ,现已发展成为继细胞培养技术之后的
又一新的培养技术生产次级代谢产物 ,发根培养器
的研制成功必将大大加快发根培养技术在中药和农
业领域应用的产业化进程 ,因此开展本项研究具有
特别重要的现实意义。
植物发根在生物反应器的大规模培养过程中 ,
不可避免地存在制约发根培养成功的许多因素 ,其
中最关键的 ,一是强化溶氧传质、避免发根因长期液
体浸泡培养而带来的玻璃化和畸形化现象 ;二是控
制机械剪切力的大小 ,避免因机械剪切力造成培养
物发根的去器官化和愈伤组织的形成 ,使生产率降
低 ;三是程控集成复合光源对植物发根次级代谢物
的调控和代谢作用机制 ,由此可见 ,要实现溶氧性能
好且剪切力低的特点 ,超声雾化方式可使营养液在
反应器中能迅速扩散 ,分布均匀 ,反应器中供氧充
足 ;程控复合光源的研究和设计 ,国外未见报道 ,但
我们已进行了一些研究 ,各色单光源的选择、复合及
程控将是发根培养反应器的又一研究关键所在 ,因
此程控集成光 -超声雾化双功能型生物反应器将是
培养发根的理想反应器。
参 考 文 献
1　 Hamil l J D, Parr A J, Rh od es M J C, et al . Biotech nology,
1987, 5: 800
2　 Rod rig uez-M endiola M A, Staf fo rd R, Cressuwell , et al . En-
zyme Micriob Techn ol , 1991, 13: 697
3　 Whitney P J. Enzyme Micriob Tech nol, 1992, 14: 13
4　 Seng Han Woo, Jong Moon Park. J Chem Technol Biotech nol,
1996, 66: 355
5　刘春朝 ,王玉春 ,郭　晨 ,等 . 应用与环境生物学报 , 1998, 4( 3):
216
6　 Edgington S M. Bio / Tech nol, 1991, 9: 993
7　 Leung K N, Yeung HW, Leung S O. Asian Pacif ic J Allergy
Imm unol, 1986, 4: 111
8　McGrath M S, Hw ang K M , Caldw el l S E. PNAS USA, 1989,
86: 2844
9　 Tsao S W , Yan K T, Yeung HW. Toxicon, 1986, 24: 831
10　 Savary B J, Flores H. Plant Ph ysiol, 1991, 96( suppl): 31
11　 Wang P, Flo res H E, Hum ph rey A E. Biotech Let t , 1994, 16:
955
12　 Tak eda T, Kondo T, M izuk ami H, et al . Chem Pharm Bul l,
1994, 42: 730
13　邱德有 ,朱　 ,朱自清 . 植物学报 , 1996, 38( 6): 439
14　 Sh aw P C, Yung M H, Ho K, et al . Gene, 1997, 97: 267
15　 Kumagai M H, Turpen T H, PN AS U SA. 1993, 90: 427
16　 Richard N. WO Paten t, 23555, 1993
17　 Hamada H, Mik uni K, Takahashi H T. Jpn Kokai Tok kyo Ko-
ho JP07-289, 1996
18　黄遵锡 ,幕跃林 ,周玉敏 ,等 . 云南植物研究 , 1997, 19( 3): 292
19　许杏详 ,朱　杰 ,周维善 . 有机化学 , 1982, 6: 447
20　 Klayman D L. Science, 1985, 228: 1049
21　 Weath er P J, Cheetham R D, Follansbee E, et al . Biotech nol
Let t, 1994, 16( 2): 1281
22　蔡国琴 ,李国珍 ,叶和春 ,等 . 生物工程学报 , 1995, 11( 4): 315
23　刘春朝 ,王玉春 ,欧阳藩 . 植物学报 , 1998, 40( 9): 813
24　刘本叶 ,叶和春 ,李国凤 ,等 . 生物工程学报 , 1998, 14( 4): 401
25　常振战 ,沈　昕 ,果德安 ,等 . 北京医科大学学报 , 1998, 30( 5):
413; ( 6): 500
26　肖培根 .中草药 , 1985, 16: 19
27　张荫麟 .植物学报 , 1988, 30( 4): 368
28　张荫麟 ,宋经元 ,祁建军 ,等 . 中国中药杂志 , 1997, 22( 5): 274
29　张荫麟 ,宋经元 ,吕桂兰 ,等 . 中国中药杂志 , 1995, 20( 5): 269
30　张荫麟 ,吕桂兰 ,周新华 ,等 . 植物学报 , 1992, 34( 8): 603
31　张荫麟 ,周新华 ,杨　岚 ,等 . 中草药 , 1990, 21( 12): 22
32　 Hilton. M G, Rhodes M C. Applied Microbiol Bi tech nol,
1990, 31: 131
33　黄炼栋 ,胡之璧 ,章国瑛 ,等 . 上海中医药杂志 , 1995, 8: 41
34　费厚满 ,梅康凤 ,沈　昕 ,等 . 植物学报 , 1993, 35( 8): 626
35　刘树楠 ,孙天恩 ,李保根 ,等 . 武汉大学学报 (自然科学版 ) ,
1998, 44( 2): 238
36　 谷正男 ,古谷力 ,芮和恺 . 中药材 , 1996, 19 ( 2): 63; 1992, 15
( 12): 3
37　 Nutikle L, Toivon eno O, Kauppinen V. Biotechnol Tech-
niques , 1994, 8( 1): 61
38　 Uozumi N, Kohketsu K, Kondo O, et al . J Fermen t Bioeng,
1991, 72( 6): 457
39　Weathers P J, Ch eeth an R D. Follan sbeek K, et al . Biotech nol
Techniques, 1997, 11: 155
( 2000-02-14收稿 )
· 附 2· 　　　　　　中草药　 Chinese Traditional and Herba l Drugs　 2000年第 31卷第 10期