全 文 ：ELISA试剂盒定量检测中药材和中成药的黄曲霉毒素 B1
中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所(北京 100094) 李延生X 陈建民
摘 要 为评价中药材和中成药的黄曲霉毒素 B1( AFB1) 污染程度,采用了 ELISA 试剂盒定量检测 AFB1, 对一
批中药材和中成药进行检测, 发现 AFB1检出率和含量很高。
关键词 中药材 中成药 黄曲霉毒素 B1 ELISA 试剂盒
Determination of Aflatoxin B1 in Traditional Chinese Medicine by ELISA
Instit ute o f Medical P lant, Chinese Academy o f M edical Science and Peking Union Medical College ( Beijing 100094) L i
Yansheng and Chen Jianmin
Abstract It w as said that the presence of aflatox in B1( AFB1) in t radit ional Chinese medicinal mate-
rials and preparat ions w as of common occurrence. In order to clarify the tr uth o f such say ing , the use of
enzyme-linked immunosor bent assay ( ELISA ) to determine the occurr ence of AFB1 in a number o f Chinese
medicinal samples w as car ried out . Result of the determinat ion show ed that the posit ive rate and contents
of AFB1 were indeed rather high, necessary to alert our deep concern
Key words t raditional Chinese medicinal materials Chinese medicinal preparat ion aflatox in B1
ELISA
中药材采集后不及时干燥或贮存不当或在制备
和加工过程中处理不善,可能污染各种霉菌并产生
真菌毒素,其中黄曲霉毒素 B1( AFB1 ) 毒性最大,致
癌力最强, 文献报道用间接竞争酶联免疫吸附法
( ELISA) 检测中药材和中成药的 AFB1 , 检出率极
高,而且含量也很高[ 1, 2]。为了更客观地评价中药材
的 AFB1污染程度, 保证人民用药安全,我们采用了
ELISA 试剂盒定量检测 AFB1 ,对一批中药材和中
成药进行检测。
1 仪器、试剂、药材
酶 联 免 疫 测 定 仪 ( Bio Rad-550 ) , AFB1
( ELISA ) 检测试剂盒(北京市营养源研究所百林生
物技术公司) ,其组成: ¹ AFB1抗原包被 16 孔×6
条形带框酶标板,º单克隆抗体,»酶标二抗, ¼ 空
白对照液, ½ 底物 ( 1mg×4) , ¾ 底物液 A ,¿底物
液 B, À终止液, Á PBS-T 洗液。
中药材样品来源于海淀医药经营公司, 中成药
为市售品。
2 原理
样品中的 AFB1经提取、脱脂、浓缩后与定量特
异性抗体反应,多余的游离抗体与酶标板内的包被
抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准曲线
比较测定含量。
3 样品测定
3. 1 提取: 样品粉碎过 20 目筛, 取 20. 0 g 加入
250 mL 具塞锥形瓶中, 准确加入 50. 0 mL 甲醇-水
( 80∶20)溶液和 15. 0 mL 石油醚, 盖塞后滴水封
严。超声 30 m in ,用快速定性滤纸过滤于 125 mL
分液漏斗中, 待分层后, 放出下层甲醇-水溶液于 50
mL 烧杯中, 从中取出 10. 0 mL (相当于 4. 0 g 样
品) 于 75 mL 蒸发皿中, 65 ℃ 水浴通风挥干, 用
2. 0 mL 20% 甲醇-PBS 分 3 次 溶解并彻底冲洗蒸
发皿中凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置待测,
此液每 1 mL 相当于 2. 0 g 样品。
3. 2 ELISA 测定
¹ 将下列试剂稀释后备用: PBS-T 洗液: 390
mL 蒸馏水稀释 ( 1∶40) ;底物液 A : 9 mL 蒸馏水
稀释 ( 1∶9) ;抗体: 7 mL 蒸馏水稀释 ( 1∶140) ; 酶
标二抗: 10 mL 蒸馏水稀释 ( 1∶200) ;阴性对照液:
200 LL 抗体+ 200 LL 空白对照液在玻璃试管内混
合振荡后静置。
º抗体抗原反应:抗体与等量样品提取液混匀
后静置 15 m in 。洗涤酶标板 2 次(每次 3 m in) , 晾
干。分别加入此抗体抗原反应液及空白对照液、阴性
·586· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2000 年第 31卷第 8期
X Address : Li Yan sheng, Inst itute of M edicinal Plant Developmet , Ch ines e Academ y of Med ical Sciences, Peking Un ion M edical Col leg e,
Beijing李延生 女, 1996年毕业于山东医科大学, 1992年考入北京协和医科大学,师从中国医学科学院药用植物研究所陈建民研究员, 1999年毕业获理学硕士学位。主要从事中草药成分分析及中药质量标准的研究。
对照液, 130 微升/孔, 37℃ 湿盒中孵育, 2 h 后倒掉
反应液并晾干,洗 3×3 m in, 晾干。
»酶标记反应: 加入酶标二抗, 100 微升/孔, 37
℃ 孵育 1 h,洗 5×3 m in ,晾干。
¼ 显色反应: 1 mg 底物+ 2. 5 mL 底物液 A+
42 LL 底物液 B,待底物充分溶解后加入酶标板, 100
微升/孔, 37 ℃ 15 min 后加入终止液, 40 微升/孔。
½ 测定: 酶标仪 490 nm 测定吸收值。
3. 3 计算
¹ 求出各孔的吸收校正值: 吸收校正值= 吸收
实测值- 空白对照孔吸收值(均值)。
º求出待测样的吸收值:吸收( % ) = [吸收校正
值÷阴性对照孔吸收校正值(均值) ]×100%。
» 求出待测样 AFB1含量( ng/ g ) : 将待测样的
吸收( % )值带入标准竞争抑制曲线, 算出 AFB1含
量。结果见表 1。
4 讨论
ELISA 法检测限达 0. 01 ng ,操作比较简单,样
品不用经过纯化是其优越性。本文所用试剂盒为单
表 1 中药材和中成药的 AFB1含量
药材名称 AFB1 含量
( ng /g ) 药材名称
AFB1 含量
( ng/ g)
神曲 49. 3 山楂 28
青皮 25. 7 白术 15
白芍 2. 3 黄芩 16. 9
泻叶 100 麦冬 0
黄芪 200 胖大海 19
陈皮 106 枳实 23. 5
柴胡 10 续断 44. 7
丹皮 2. 5 姜黄 17
地丁 14. 6 茯苓 0
金钱草 12 银翘解毒丸 29. 5
板蓝根 100 清眩治瘫丸 23. 7
克隆抗体, 与文献所用多克隆抗体方法的检测结果
相比,所测中药材和中成药的 AFB1含量低得多, 但
据了解该试剂盒的单克隆抗体未检验过中药成分,
尚需证实含香豆素或黄酮类化合物的中药对检测
AFB1有无干扰。
参 考 文 献
1 杜平华,杨晓峰 . 药物分析杂志, 1995, 15: ( 2) : 34
2 任凤兰,马宏伟 . 药物分析杂志, 1997, 17: ( 4) : 280
( 1999-07-08收稿)
刺五加提取物中紫丁香苷、紫丁香树脂苷的 HPLC测定法
西安天诚医药生物工程有限公司( 710075) 刘 莹 惠玉虎X
摘 要 以 C18柱,甲醇-水 ( 28∶72) 为流动相, 在 270 nm 检测波长下, 建立了刺五加提取物中紫丁香苷(简称苷
B)、紫丁香树脂苷(简称苷 E)的反相高效液相色谱同时测定方法。该方法快速、准确、灵敏。方法回收率苷 B 为
97. 3% , R SD 1. 95% ; 苷 E 为 96. 8% , RS D 1. 50%。
关键词 刺五加 紫丁香苷 紫丁香树脂苷 HPLC
刺五加提取物是从五加科植物刺五加
A canthopanax senticosus ( Rupr. et Max im. )
Harms 的干燥根及根茎中提取有效成分后喷雾干
燥而成。其中主要含有各种苷类如紫丁香苷(苷B)、
紫丁香树脂苷(苷 E)及多种木脂素类、异秦皮定和
黄酮类等成分[ 1]。关于苷 B 的测定已有报道, 为
HPLC 法, 流动相为甲醇-水-冰醋酸 [ 2, 3] , 氯仿-异辛
烷-冰醋酸[ 1] ;也有分光光度法 [ 1]。为了更好地控制
产品质量,根据客户要求,我们对其中的苷 B、苷 E
的测定方法进行了研究, 建立了苷 B、苷 E 的反相
高效液相色谱同时测定方法。
1 仪器与试药
日本岛津 LC-10AT 高效液相色谱仪, SPD-
10A 紫外检测器,大连化学物理研究所色谱工作站
( WDL-95) , KQ-250型超声波清洗器。
对照品:苷 B、苷 E 均由美国 Alpha 实验室提
供, 刺五加提取物为西安天诚医药生物工程有限公
司生产 (批号为 991107, 991108, 991109, 991110,
991111)。甲醇为分析纯,水为二次重蒸馏水。
2 色谱条件
色谱柱: Supelco sel LC-18-DB 4. 6 mm×150
mm 5 Lm; 流动相: 甲醇-水 ( 28∶72) ; 流速: 1. 0
·587·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2000 年第 31卷第 8期
X Address : Hui Yuhu, Xian T ianch eng Dr ugs & Bioen gineering Co. Ltd. , Xian惠玉虎 男,理学硕士学位,高级工程师。1989年毕业于吉林农业大学农业环保专业,研究方向为农药残留分析。工作期间主要从事农药质量检测及科技推广工作,共发表研究论文 8篇,译文 7篇。现在西安天诚医药生物工程有限公司主要从事中草药提取物的检测和农药残留分析检测等工作。