全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2O15，35(3)：420—427 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guihaia．gxzw201403048
武安泉，王俊生，阮先乐，等．番茄 RGA4蛋白与马铃薯Rpi—blbl蛋白的同源比较分析[J]．广西植物，2015，35(3)：42O一427
Wu AQ，Wang JS，Ruan XI ，et a1．Homology analysis of tomato RGA4 and potato Rpi—blbl protein[J~．Guihaia，2015，35(3)：42O 427
番茄 RGA4蛋白与马铃薯 Rpi-blbl蛋白的同源比较分析
武安泉，王俊生 ，阮先乐，范小芳，陈 龙
(周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001)
摘 要 ：为获得番茄抗晚疫病广谱性基因信息，采用同源电子克隆法 ，基于番茄蛋白序列数据库 ，以马铃薯晚
疫病广谱抗性蛋 白Rpi blbl为种子序列 ，获得番茄疾病抗性蛋白 RGA4，并进行基因电子定位和基因结构、模
体 、二级结构 、基因进化及基因电子表达等分析，以证明两者 的进化关 系。结果表明：番茄 RGA4蛋 白(XP一
004245923．1)序列具有 NB—ARC和 LRR 两个保守结构域 ，定位于第 8条染色体 SL2．40区间，相应基因位于 8
号染色体序列的 57228847—57232935 bp区间，长度为 4 089 bp，由 2个外显子和 1个 内含子组成 ，编码 988
个氨基酸序列 ，该蛋白为不稳定分泌球形蛋白；番茄 RGA4蛋白和马铃薯 Rpi blbl蛋白在二级结构分布、基
因序列组成、基因定位等方面相似性较高 ，可确定两者为垂直同源关系，但在基因进化和模体组成方面存在差
异，可能导致两者功能上的不同。研究结果可为番茄晚疫病广谱抗性基因克隆及其利用提供理论依据 。
关键词 ：番茄；晚疫病；垂直同源 ；生物信息学分析
中图分类号 ：Q943．2；$641．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2015)03 0420—08
potato Rpi_blbl protein
WU A Quan，WANG Jun-Sheng ，RUAN Xian-Le，FAN Xiao-Fang，CHEN I．ong
‘College oj L“e sciences and Agri~’ulture，Zhoukou Normal University，Zhoukou 46600 1，China
Abstract：Using electronic cloning method，the putative disease resistance protein RGA4 and the homologue of the
potato Rpi blbl protein were obtained from tomato’S protein sequences database in NCBI by protein blast when the
sequence of late blight resistant protein Rpi—blbl from potato was used as query sequence，then，they were compared
in gene mapping，gene structure，modify，secondary structure，topological structure and electronic gene expression pro
file，ete，for proving their evolutionary relationship．The result showed that tomato RGA4 protein(XP
一
004245923．1)
was composed of 988 amino acid residues with NB ARC and LRR8 conserved domain，the corresponding cDNA se
quence(XM-004245875．1)was located on SI 2．4O region in the chromosome 8，with genomic DNA length 4 089 bp，
the alignment region in chromosome 8 between 57228847——57232935 bp，and composed of two exons and one
intron．The tomato RGA4 protein was an unstable globular secretory protein without transmembrane structure．To
mato RGA4 protein was regarded as an orthologous of potato Rpi—blbl protein because they were similar in secondary
structure composition，gene sequence composition，gene mapping，etc，but their minor differences in gene evolution and
composition could result in different functions．This study would provide theory for cloning late blight resistant gene
and its utilization in tomato breeding of disease resistance．
Key words：Solanum lycopersicum ；late blight；orthologous；bioinformation analysis
收稿 日期
基金 项 目
作者 简介
通讯作 者
2()l4-05-28 修 回 日期 ：201 4-08—25
河南省教育厅基金(14B2l0022)；河南省高校博士科研肩动经费(zKsYBscx201110)。
武安泉(1973)，男 ，河南西峡人 ，硕士，讲师，主要从事生物化学教学与研究 ，(E—mail)wuanquanl9@1 63．COIn。
王俊生 ，博士，副教授，主要从事生物信息教学与植物分子育种研究 ，(E mail)wjs0099@1 63．corn。
3期 武安泉等 ：番茄 RGA4蛋 白与马铃薯 Rpi—blbl蛋 白的同源比较分析 421
番茄晚疫 病 (Phytophthora infestans)是番 茄
生产中的主要病害 。每年在番茄主产 区均造成较大
的经济损失 ，已成为番茄生产的主要 障碍 。晚疫病
是 由致病疫霉菌引起 的一种真菌性病 害，在世界范
围内广泛分布 ，主要危害 马铃 薯、番茄等茄科作 物
(Kamoun et a1．，2005)。近年来 ，在番茄抗 晚疫 病
基因克隆方面取得了一定进展，分别克隆了抗番茄
晚疫病 的几个主效基因如 Ph一1、P矗一2、Ph一3和 Ph一
4 (Chunwongse et a1．，1998；Moreau et a1．，1998；
Brouwer et a1．，2004)，但随后发现番茄中出现 了对
以上主 效 基 因有 抗性 的晚疫 病 菌 株 (贾 芝琪 等 ，
2009)；Zhang et a1．(2013)把野生醋栗番茄 中获得
的抗性基因 P^ 一3转入番茄栽培种中使其获得了广
谱晚疫病菌抗性，并且对其进行了染色体精 细定位 。
然而 目前已有的番茄野生资源 中，尚没有发现更好
的其他抗性基因，尤其广谱性晚疫病抗性基 因。
近年来 ，马铃薯晚疫病的研究取得 了较快进展 ，
已从 马铃薯野生种 中克隆鉴定出了 20多个抗性基
因(周军会 ，2008)，其 中 Rpi—blb1和 Rpi—blb2是从
马铃薯 (Solanum bulbocastanum)中分离 出的晚疫
病 广 谱 抗 性 基 因 (Van der Vossen et a1．，2003，
2005)，且 Rpi—blb2基 因被转 入番茄 中获得 了抗 马
铃薯 晚疫病 菌株 的番茄 植株 (Van der Vossen et
。￡．，2005)，证 明这种抗性可在番茄和马铃薯之间进
行转移 ，但是否可以抵抗番茄 晚疫病生理小种尚未
可知。马铃薯和番茄同属茄科植物，二倍体物种均
具有 12对染色体 ，是 比较基 因组学研 究的很好材
料 。因此 ，本研究为证 明番茄栽培种 中存在番茄 晚
疫病广谱抗性基 因，以马铃薯抗病基 因 Rpi—blb1的
蛋白序列为种子序列，基于番茄蛋白质序列数据库、
基因组数据库、EST数据库等，利用生物信息学方
法获得 了番茄 中与马铃薯 Rpi—blb1基 因同源 的
RGA4蛋白和基因序列，并对其基因结构信息、定位
信息 ，以及同源蛋白质 的结构与功能信 息进行 了深
入分析，为番茄抗晚疫病的分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1．1种子序列及其来源
以马铃 薯抗晚疫病基 因 Rpi—blb1(Van der
Vossen et a1．，2003)(蛋 白序列 Accession number
为 AAR29o69．1：970AA，核酸序列 Accession number
为 AY426259．1)作 为种子序列 ，利用 NCBI网站提
供的 BLAST—Protein工具搜索非冗 余 的番茄蛋 白
质序列数据库，获得番茄 RGA4蛋 白序列 与其具有
最高的序列相似性 (70％)，与其他所有蛋 白的氨基
酸序列相似性最高为 35 。
1．2生物信息学分析软件
通 过 Conserved Domain(http：／／www．ncbi．
nlm．nih．gov／Structure／cdd／wrpsb．cgi)在线 工具 ，
搜索蛋 白质序 列 保守 域 ；在 BLAST—protein结果
页 ，选择所有序列后 ，利用 Tree View功能显示 比对
序列 与 同 源 序 列 的 距 离 进 化 树 (采 用 Neighbor
Joining法，kimura protein距离 ，序列最大差异值设
定为 0．7，有根树显示)；从 NCBI主页进入 Genomes
& Maps，链接 Map Viewer，而后 利用番茄 RGA4
序列在其基因组序列数据库 中同源 比对 ，从 比对结
果 中 获 得 定 位 信 息 ，或 从 相 应 mRNA 序 列
(XM004245875．1)注释信息中获得基因定位识别号
LOC101251707进行超链接 ，从而获得该基 因定位
信息和基因结构信息；在序列定位基础上，利用
NCBI中提供的番茄遗传图谱对 RGA4蛋 白序列 的
标记进行搜索。
利 用 ExPASy 网 站 的 TMHMM (http：／／
www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM一2．0／)进 行跨
膜区预测；利用 TargetP 1．1 Server软件(http：／／
www．cbs．dtu．dk／services／TargetP／)和 Plant—
PLoc软件(Chou et a1．，2008)进行亚细胞定位分
析 ；利 用 SignalP 4．1 Server(http：／／www．cbs．
dtu．dk／services／SignalP／)预 测信 号 肽序 列 ；利 用
SOPMA (http：／／npsa—pbil．ibcp．fr／egi—bin／npsa
—
automat．pl? page— npsa
— sopma．htm1)软件进行二
级结构预测 ；利用 NPS(Network Protein Sequence
analysis，http：／／npsa—pbil．ibcp．fr)提 供 的 Proscan
进行蛋白模体分析。
1．3表达 分析
利用 GeneBank数据库中 EST数据 ，通过同源
比对获 得与 番茄 RGA4核 酸序列 相似 的 EST 序
列 ，从而推测其表达模式或者利用 Unigene数据库
(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／unigene)对其进行
电子表达谱分析 ，在 以上分析基 础上 ，进 一步通过
GEO数 据库 (Gene Expression Omnibus(GEO)
Database)(http：7 7www．ncbi．nlm．nih．gov／geopro—
files／)分析 RGA4相关的表达信息。
422 广 西 植 物 35卷
2 结果与分析
2．1番茄 RGA4蛋白与马铃薯 Rpi—bib1蛋白是垂直
同源物
2．1．1序列同源比对和结构域分析 以马铃薯抗晚
疫病 基 因 Rpi—blbl(基 因组 序列 号 AY426259．1：
7 349 bp)对应的蛋白质序列(AAR29069．1)为种子
序列 ，在番茄非冗余蛋白质数据库进行 BLASTp搜
索，发现番茄蛋 白序 列 XP 004245923．1(编码 988
个氨基酸)，是与马铃薯 Rpi—blbl蛋 白相似性最高
的同源蛋 白(Identities一70 ，E—Value一0)序列 ，其
相应的 mRNA序列为 XM 004245875．1，基因组序
列获取号为 NW 004194350．1，该蛋 白被定义为假
定的疾病抗性蛋 白 RGA4蛋白。
通过 Conserved Domain在线 工具 ，搜 索番茄
RGA4 protein保守域 (图 1：A)，表 明该蛋 白序列具
有 NB—ARC(151～434位 AA)和 I RR一8(522～579
位 AA)两个保守结构域，马铃薯 Rpi blbl蛋白序列
存在 3个保守结构域(图 1：B)，分别为 NB—ARC
(154～434位 AA)、COG4886(460～6l4位 AA)和
LRR8，其 中 COG4886实际是一个包含较多亮氨酸
的 I RR域，因此通过序列相似性和结构域相似性比
较推测，番茄 RGA4 protein(XP 004245923．1)与马
铃薯 Rpi blbl蛋 白(AAR29069)为 同源蛋 白，相应
的基因为同源基 因。
为进一步确定两者 同源关系，利用马铃薯 Rpi—
blbl蛋 白与番茄蛋 白数据库 中所有 的疾 病抗 性蛋
白或晚疫病抗性蛋 白构建分子进化树 ，结果 (图 2)
表明，马铃薯 Rpi—blbl蛋白(图 2中红色箭头所指)
与番茄 RGA4蛋 白距 离最近 (图 2中蓝色箭 头所
指)，尤其两者在 NB—ARC保守区，序列具有更高的
相似性 ，因此推测两者属于垂直 同源物。因此我们
对番茄 RGA4蛋白进行生物信息学分析，以进一步
挖掘番茄 晚疫病广谱抗性基因信息。
2．1．2番茄 RGA4蛋 白基 因结构与定位分析 番茄
RGA4蛋 白的 mRNA 序列 (XM004245875．1)注释
信 息 表 明，其 对 应 的 基 因定 位 序 列 识 别 号 为
I OC101251707，通 过 对 基 因 序 列 识 别 号
I OC101251707进行超链接 ，结果 (图 3)发 现该基
因定位于 8号染色体 SI 2．40，其所在的基 因组序列
(contig群 )为 NC一015445．1，在基 因组序列上 的匹
配位置为 57228847—57232935，长度 4 089 bp，该
基因由 2个外显子(编码序列分别长 433 nt和2 534
nt)和 1个 内含 子 (内 含 子 位 置 为 57229441—
57230341，长度为 901 nt)组成 (图 3)，蛋 白编码 区
(XP004245923．1，图 3 中 红 色 部 分 )与 NC
0l5445．1contig群 内 的 匹配 位 置 为 57229009—
57232874，长度为 3 866 bp，编码 988个氨基酸。进
一 步利 用 NCBI番 茄遗 传 图谱 (Shirasawa et nz．，
2010)上的标记 ，把该基 因定位 在两个 SSR标记之
问(TES1088和 TESO349)，间距 0．651 cM。Van
der Vossen et a1．(2003)研究 表明，Rpi—Bib1基 因
也是由两个外显子(编码序列分别长 427 nt和2 486
nt)和一个内含子(长度 678 nt)组成的，并且定位在
马铃薯 8号染色体上 。
2．1．3番 茄 RGA4蛋 白 亚 细胞 定 位 、跨 膜 区和 信 号
肽分析 用 TargetP 1．1(默认参数)进行亚细胞定
位，结果显示番茄 RGA4蛋白为叶绿体蛋白(cTP)、
线粒体蛋 白(mTP)、分泌途径蛋白(SP)和其它任何
定位的神经 网络分值分 别为 0．043、0．052、0．768，
0．456，定位结果 为分泌蛋 白，可靠性级别 RC值 为
4，可靠性不 高(最 高级别 RC==1，最低级别 RC==
5)，马铃薯 Rpi—Blbl蛋白被定位于 SP蛋白，可靠性
级 别 RC 为 3；进 一 步 用 Plant PLoc(http：／／
www．csbio．Situ．edu．cn／cgi_bin／PlantPLoc．cgi)进
行亚细胞定位分析 ，表明 RGA4蛋 白和 Rpi blbl蛋
白均定位于细胞质 。用 TMHMM 软件进行跨膜区
预测 ，结果显示番茄 RGA4蛋 白和马铃薯 Rpi—Blbl
蛋 白均不 存 在 跨 膜 螺 旋 区 域 ，这 与利 用 “DAS 9_
Transmembrane Prediction server预测结果 一致 ；
信 号 肽分 析 (http：／／www．cbs．dtu．dk／services／
SignalP／)表明两者均不存在信号肽序列。
2．1．4番茄 RGA4蛋 白和马铃 薯 Rpi—blbl蛋 白的二
级结构 和模 体 比较 利 用 SOPMA 软件 对 番 茄
RGA4蛋 白二级结构进行预测 ，结果表 明该蛋 白二
级结构中 0：螺旋、无规则卷曲、扩展束和 f3转角占比
分别 为 60．73 、3O．O1 、7．02 和 2．24 ；马铃薯
Rpi blbl蛋白二级结构中 a螺旋 、无规则卷曲、扩展
束和 8转角占比依次为 62．27 、3o．01％、7．42 和
1．86 ，两者二级结构 占比很接近 ；进一步 比较两者
的二级结构分布(图 4)，结果表 明两者二级结构在
序列 中的分布顺 序也 极其相 似 ，甚至 一致 。利用
NPS提供的 Proscan对两个蛋白进行模体扫描，表
1显示 ，番茄 RGA4蛋 白和野生马铃薯 Rpi—blbl蛋
白具有 7类共同的模体(modify)结构 ，分别是 N一糖




3期 武安泉等 ：番茄 RGA4蛋白与马铃薯 Rpi—blbl蛋 白的同源 比较分析 427
基因在叶片、花器官、根以及愈伤组织中均有表达，
这表 明该基因表达部 位分 布较广 ，表现组成性表达
特点；利用 Unigene数据库获得的 EST表达信息表
明该基因仅在愈伤组织中表达，两者存在较大差异，
这可能与 Unigene数据库信 息量不 足有关 。利用
GEO数据库仅获得 了与番茄 RGA4蛋 白相关 的部
分表达信息，即番茄 RGA4在植株机械伤害(或胁
迫)条件下下调表达 ，Rboh(呼吸猝发氧化酶)基 因
能够 促进 RGA4基 因的表达。当前 结论是利用数
据库中现有信息获得的，因此准确完善地表达信息
还需要 EST数据库和 GEO表达信息库的不断丰富
和完善。更为重要 的是 ，这些表达信息是我们设计
后续实验 的基础和参考，可 以避免不必要 的重复和
浪费 ，从而提高实验的 目的性和效率。
本研究中获得的番茄抗病蛋白 RGA4蛋白序
列(XM00424587．1)是对 番茄测序 品种 Heinzl706
测序结果翻译获得的，因此理论上确 实是晚疫病抗
性蛋 白，所在基因位点是抗性基 因位点 ，但是否具有
抗性基因(或蛋白)的功能与品种本身相关 ，因此 ，在
后续研究中我们将针对该 基因位点 ，在 不同的抗 晚
疫病番茄栽培品种、野生种之间进行同源基 因克隆 ，
并研究该基因的变异和表达与抗 晚疫病 的关系 ，以
其为番茄抗晚疫病分子育种方面提供帮助。
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