全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):３６９－３７４　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．０１６
齐靖,李桂琴,董祯,等．鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察[J]．广西植物,２０１４,３４(３):３６９－３７４
QiJ,LiGQ,DongZ,etal．TransformationoftobaccoplantsbyYaliPPOＧGFPfusiongeneandobservationofsubcelularlocalization[J]．Guihaia,２０１４,
３４(３):３６９－３７４
鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草
转化及亚细胞定位观察
齐　靖１∗,李桂琴１,董　祯２,周　薇１
(１．河北经贸大学 生物科学与工程学院,石家庄０５００６１;２．河北女子职业技术学院,石家庄０５００９１)
摘　要:将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开
展细胞定位研究.通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为１７７９bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基
因重组构建了荧光表达载体pBI１２１ＧPPOＧGFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚
焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合.结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质.
关键词:鸭梨;多酚氧化酶;绿色荧光蛋白;基因融合;遗传转化;亚细胞定位
中图分类号:Q９４２．６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０３６９Ｇ０６
TransformationoftobaccoplantsbyYaliPPOＧGFP
fusiongeneandobservationofsubcelularlocalization
QIJing１∗,LIGuiＧQin１,DONGZhen２,ZHOU Wei１
(１．CollegeofBiologyScienceandEngineering,HebeiUniversityofEconomicsandBusiness,Shijiazhuang
０５００６１,China;２．HebeiWomen＇sVocationalCollege,Shijiazhuang０５００９１,China)
Abstract:ToexplorethesubcelularlocalizationofPolyphenoloxidase(PPO)fromPyrusbretschneideri,the１７７９
bpcDNAofPPOgenewasclonedandfusedwithGFPinframetoconstructabinaryvectorpBI１２１ＧPPOＧGFP．
Then,thebinaryvectorwastransformedintoNicotianatabacumbythetumefanciensＧmediatedmethod．UsingconfoＧ
callaserscanningmicroscopy,greenfluorescentsignalswerelocalizedinchloroplastsofthetransformedNicotiana
tabacumcel．ThisresultssuggestedthatthePolyphenoloxidasefromPyrusbretschneideriwasachloroplastprotein．
Keywords:Yali;polyphenoloxidase;GFP;genefusion;genetictransformation;subcelularlocalization
　　果蔬产品褐变现象发生的主要原因是氧化还原
酶介导的酶促反应,在这个反应中由于多酚类物质
被氧化成了深褐色的醌类物质从而引起了褐变的发
生.多酚氧化酶(PolyphenolOxidase,PPO)是催化
这个氧化还原反应的主要酶类,任何导致该酶含量
下降或活性降低的因素均可以起到抑制褐变的作
用,果蔬生产上常用的抑制褐变方法也正是基于这
一点来延缓果蔬褐变的.由于多酚氧化酶在褐变反
应中具有重要的地位,长期以来有关多酚氧化酶的
研究吸引了众多科学家的目光.深化对该酶的研究
也将有助于从根本上解决果蔬产品褐变问题.
多酚氧化酶是一种质体酶,由细胞核基因编码,
在细胞质中合成后转运到其它细胞区域.细胞化学
和细胞免疫化学分析表明,多酚氧化酶主要存在于
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ１０　　修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ２２
基金项目:河北省科技计划项目(１１２２０１０３DＧ９);河北省高等学校科学技术研究指导项目(Z２０１２０６５);河北省高等学校科学研究计划重点项目
(ZH２０１１１２６).
作者简介:齐靖(１９８１Ｇ),男,河北石家庄人,博士,讲师,主要从事植物生理与分子生物学方面研究,(Email)qijing＠heuet．edu．cn.
∗通讯作者
正常细胞的光合组织(如类囊体的囊泡)和非光合组
织的质体(如马铃薯块茎细胞的造粉体)中(鞠志国
等,１９９８;Vaughnetal．,１９８４;Shermanetal．,
１９９１).缺乏质体的组织没有多酚氧化酶,但含有质
体的植物组织不一定都有该酶存在,其原因至今尚
不明确(王曼玲等,２００５).虽然多酚氧化酶被广泛
认为存在于植物细胞质体中,但针对不同植物来源
的多酚氧化酶,其具体存在的质体种类也表现出明
显的不同 (Huntetal．,１９９３;Thygesenetal．,
１９９５;Chevalieretal．,１９９９).目前,关于鸭梨多酚
氧化酶在细胞中的定位尚属研究空白,虽然在前期
研究中我们通过克隆鸭梨PPO基因,根据生物信息
学分析结果推断该酶定位于细胞类囊体中(李桂琴,
２００９),但这尚缺乏有力的实验结果支持.因此,作
为基因功能研究的一部分,在本研究中我们拟通过
将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白(GreenFluoresＧ
centProtein,GFP)基因相融合共同进行遗传转化
的方式对鸭梨多酚氧化酶的亚细胞定位进行实验验
证,从而为进一步深入研究编码该蛋白的基因功能
奠定基础.
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１植物材料　鸭梨(Pyrusbretschneideri‘Yali’
pear),栽植于河北省农林科学院石家庄果树研究所,
常规管理.三生烟(NicotianatabacumSamsum),由
本实验室种植,培养条件为２２℃,１６h光照/８h黑
暗,光通量密度１１０L􀅰mＧ２􀅰sＧ１,湿度约为３０％.
１．１．２主要试剂　大肠杆菌菌株 DH５α、克隆载体
pUCmＧTVector、UNIQＧ１０柱式质粒小量抽提试剂
盒和DNA胶回收试剂盒为上海生工公司产品;OliＧ
go(dT)１５、RTaseMＧMLV、Taq酶、dNTP、限制性
内切酶、T４ 连接酶以及 DNA Marker均购自
TAKARA公司;农杆菌菌株 EHA１０５、含有 GFP
基因的双元表达载体GFPＧpBI１２１均由本实验室提
供;其它常规化学试剂均为国产分析纯.
１．２方法
１．２．１荧光表达载体的构建　以成熟鸭梨果实为试
材,参照改良CTAB法(董祯,２００７)提取总RNA,
反转录为cDNA.根据已获得的鸭梨PPO基因cDＧ
NA全长序列(李桂琴,２００９)的CDS区设计一对引
物(上游引物:５′ＧTGACGTCTCTTTCACCTCCGＧ
GTAGTCAＧ３′,下游引物:５′ＧAGAAGCAAACTＧ
CAATCTTGATACＧ３′),以鸭梨果实cDNA为模板
扩增除终止密码子 TAA外的完整氨基酸编码序
列,扩增体系为５０μL,其中包含鸭梨DNA５０ng、
１０×PCRBuffer５μL、rTaq(TAKARA)０．５μL、上
下游引物各３０ng,dNTP终浓度为０．２５mmol􀅰
LＧ１.PCR反应在德国Biometra公司生产的TGraＧ
dientPCR仪中进行,扩增程序为９４℃变性３０s,７０
℃退火３０s,７２℃延伸２min,３５个循环.
PCR扩增结束后,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳
分离后回收,与pUCmＧTVector连接后转化E．coli
DH５α感受态细胞,送交上海生工测序.根据测序
结果挑选目标片断正向插入在pUCmＧTVector多
克隆位点的重组质粒以及荧光表达载体 GFPＧ
pBI１２１共同进行XbaI/SacI双酶切.酶切反应结
束后,分别电泳回收PPO基因片断和GFPＧpBI１２１
线性载体,并将两片段连接构建PPOＧGFP荧光表
达载体.PPOＧGFP荧光表达载体经测序验证后,
借助冻融法(王关林和方宏均,２００２)转化农杆菌菌
株EHA１０５用于烟草转化.
１．２．２农杆菌LBA４４０４介导的PPOＧGFP荧光表达
载体转化烟草　选取培养１~２个月的三生烟植株,
取其生长正常细嫩叶片,剪去边缘及主脉,再剪成小
块(大小为０．５cm×０．５cm)作为转化的起始外植体
材料.
参照叶盘法(Horschetal．,１９８５)对烟草进行
侵染转化.首先在无菌条件下,用接种针挑取保存
的农杆菌工程菌株EHA１０５菌液,于含Kan、Rif和
Str各５０mg􀅰mLＧ１的YEB平板上划线培养,２８℃
倒置暗培养直到长出单菌落.在转化平板上挑取单
菌落接种于１mL含同样抗生素的YEB液体培养
基中,２２０r􀅰minＧ１,２８℃振荡培养过夜.在５０mL
含同样抗生素的YEB液体培养基中加入１mL上
述培养物,２２０r􀅰minＧ１,２８℃振荡培养１４h左右,
到菌液OD６００到０．６左右;室温下５０００r􀅰minＧ１离
心１５min,弃上清夜,菌体用 MS液体培养基悬浮,
稀释１０倍后备用.其后将剪切好的烟草叶盘置于
菌悬液中轻微振荡５min后,转入共培养培养基
(MS＋１mg/L６ＧBA)２６℃黑暗共培养３d;再转入
筛选培养基(MS＋１mg/L６ＧBA＋５００mg/LCef＋
３０mg/LKan)进行筛选和分化,每两周继代培养
１次,３~４周后陆续从叶片边缘分化出幼芽,待抗性
芽长到１cm以上时切下,插入生根培养基(１/２MS
０７３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
＋５００mg/LCef＋３０mg/LKan)进行生根.待抗
性芽长有５~８条主根后,将无菌小苗开盖在２５℃
左右条件下培养锻炼２d,然后移栽入土壤中,置于
温室中按常规管理.
１．２．３转基因烟草的PCR检测　根据 Genbank上
发表的 GFP基因序列设计一对引物,上游引物为
５′ＧGTTGAATTAGATGGTGATAATＧ３′;下游引
物 为 ５′ＧATAACCTTCGGGCATGGCACTCＧ３′.
参照CTAB法(王关林和方宏均,２００２)抽提转基因
烟草DNA,并以此为模板进行扩增,扩增体系同
１．２．１,扩增程序为９４℃变性３０s,５８℃退火３０s,
７２℃延伸９０s,共３５个循环.PCR扩增结束后,扩
增产物在１％琼脂糖凝胶电泳中分离,紫外顶下检
测、照相.
１．２．４转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察　
采集经PCR鉴定的转基因烟草叶片制作显微切片,
用激光扫描共聚焦显微镜(LSM５Pascal,Zeiss)观
察叶肉细胞中GFP的表达.采用４０倍油镜进行观
察,激发光波长为４８８nm,带通BP为５０５~５３０
nm,长通LP为５６０nm.
２　结果与分析
２．１荧光表达载体的构建
根据已知鸭梨多酚氧化酶基因全长序列(李桂
琴,２００９)设计一对引物,以鸭梨果实 mRNA为模
板,RTＧPCR扩增除终止密码子 TAA外的完整氨
基酸编码序列,扩增结果如图１:A所示.将目标片
段回收后与pUCmＧT Vector连接后转化E．coli
DH５α感受态细胞,经蓝白斑筛选、质粒酶切鉴定
(图１:B)无误后送交上海生工测序.测序结果显
示,该序列长度为１７７９bp,与已知的鸭梨多酚氧化
酶基因在序列组成上无差异,没有碱基突变的发生,
可用于构建植物表达载体.
所扩增得到的鸭梨多酚氧化酶基因片段在克隆
到载体pUCmＧT Vector时存在正、反两种插入方
式,选择经测序验证片段反向插入pUCmＧTVector
的重组质粒,进行XbaI/SacI双酶切,电泳回收目
标片断,与用同样酶切的含有GFP基因的pBI１２１
线性载体进行定向连接,连接反应完成后将连接产
物转化E．coliDH５α感受态细胞,挑取卡那霉素
(Kan)抗性单克隆,进一步扩繁.提取质粒后,经
XbaI/SacI双酶切鉴定证实多酚氧化酶基因片段
图１　PCR扩增鸭梨多酚氧化酶基因序列及其克隆
载体的酶切鉴定　A．鸭梨多酚氧化酶基因cDNA序列PCR
扩增产物　M．分子量标准(２０００、１０００、７５０、５００、２５０、１００
bp),１．PCR扩增产物;B．阳性克隆的EcoRI/BamHI酶切鉴
定　M．marker,２．阳性克隆的EcoRI/XbaI酶切鉴定结果.
Fig．１　PCRimplificationofPPOandidentificationof
cloningvectorbyendonucleasedigest　A．PCRamplification
productsofPPO　M．１kbDNAmarker(２０００、１０００、７５０、５００、
２５０、１００bp),１．ProductofPCRimplification;B．ProductcutbyEcoR
I/BamHI．　M．DNAmarker,２．Productbyendonucleasedigest．
图２　pBI１２１ＧPPOＧGFP表达载体的酶切鉴定
１,２．重组质粒酶切结果;M．１kbDNALadder.
Fig．２　IdentificationofpBI１２１ＧPPOＧGFPbyrestriction
enzymedigestion　１,２．Recombinantplasmiddoubledigestby
SacIandXbaI;M．１kbDNALadder．
已成功插入表达载体(图２),测序结果显示目标片
段正向排列于３５S启动子和GFP基因之间,可由
３５S启动子完成PPOＧGFP融合基因的转录.构建
好的荧光表达载体图谱如图３所示.
２．２转基因植株的获得
将构建好的pBI１２１ＧPPOＧGFP质粒以及仅含
有GFP基因的pBI１２１质粒(pBI１２１ＧGFP)分别借
助电击法转化农杆菌EHA１０５细胞,参照叶盘法
(李桂琴,２００９)分别对烟草进行遗传转化.分别将
与两种农杆菌工程菌株共培养３d后的烟草叶片接
种于筛选培养基上进行诱导培养,每２周继代１次,
１７３３期　　　　　　 齐靖等:鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察
图３　植物表达载体pBI１２１ＧPPOＧGFP图谱　
Fig．３　DiagramofantisenseexpressvectorofpBI１２１ＧPPOＧGFP
６周后选取长势良好的芽接种到含卡那霉素的生根
培养基上继续培养,３周左右分化出根,选择根系较
发达的移栽到营养钵中,最终得到７７株转pBI１２１Ｇ
PPOＧGFP烟草以及６９株转pBI１２１ＧGFP烟草,两
种转化植株均表型正常.
２．３转基因植株的PCR检测
对经过卡那霉素筛选出的烟草植株,各随机挑
选１０株提取其DNA,并以此为模板应用根据GFP
基因设计的引物进行PCR扩增.电泳结果显示,在
转PPOＧGFP基因的烟草植株中PCR检测结果全
部呈阳性,而在转GFP基因的烟草植株中仅有８株
扩增出了目标片段,２株呈现假阳性(图４显示了部
分电泳结果).
图４　烟草转基因植株PCR鉴定结果　１．pBI１２１ＧPPOＧ
GFP质粒,阳性对照;２．水,阴性对照;３Ｇ８．烟草转基因植株.
Fig．４　PCRanalysisoftransgenictobaccoplants　１．posＧ
itivecontrol;２．negativecontrol;３Ｇ８．transgenictobaccoplants．
２．４报告基因GFP的表达
对PCR检测阳性的烟草植株用激光共聚焦显
微镜观察其叶片中 GFP的表达情况,结果显示在
４８８nm的激发光下,野生型烟草仅在大于５６０nm
处出现叶绿素自发荧光(红色),在GFP发射光波段
５０５~５３０nm没有任何信号(图５:AＧC).pBI１２１Ｇ
GFP转基因植株在５０５~５３０nm 波段,GFP荧光
(绿色)在细胞质中呈弥散状分布(图５:DＧF).而在
pBI１２１ＧPPOＧGFP转基因植株中,GFP荧光信号与
叶绿素自发荧光信号共定位于叶绿体中(图５:GＧ
I).该结果表明本研究获得的鸭梨多酚氧化酶基因
所编码蛋白的成熟肽位于叶绿体中,故该蛋白质为
核基因编码的叶绿体蛋白质.
３　讨论与结论
蛋白质在细胞器中的定位对于明确其功能和参
与的代谢途径有着非常重要的作用.多酚氧化酶在
细胞内的定位情况较为复杂,在其它植物的叶绿体
(Kimetal．,２００１)、线粒体(Harutaetal．,１９９９)、
过氧化物体和微体(Panetal．,２００５)中均发现有该
酶的存在.Sommeretal．(１９９４)和Smeekenset
al．(１９８６)认为多酚氧化酶主要位于植物细胞的类
囊体内,而汪敏等(１９９４)则发现凤眼莲中的多酚氧
化酶主要存在于线粒体中,鞠志国(１９８９)也发现在
莱阳在梨的亚细胞颗粒中以线粒体的多酚氧化酶活
性最高.这些研究报道给我们透露出一个明显的信
息,即不同植物来源的多酚氧化酶似乎都有其独特
的细胞定位方式,也使得我们很难基于前人研究来
推定鸭梨鸭梨多酚氧化酶所定位的细胞器.尽管如
此,在前期研究中,我们还是基于他人研究结果围绕
鸭梨多酚氧化酶基因做了大量的生物信息学分析工
作(李桂琴,２００９),结果显示鸭梨多酚氧化酶与大多
数定位于叶绿体的植物多酚氧化酶结构特征相符,
故在之前的研究中我们推测鸭梨多酚氧化酶很可能
定位于叶绿体中.也正是基于这样的推论,在本研
究中我们未对其它细胞器做免疫荧光处理,仅借助
叶绿体自发荧光即实现了鸭梨多酚氧化酶的细胞定
位分析.可见,在缺乏研究背景的情况下对拟细胞
定位的蛋白做详细生物信息学分析是非常必要的,
这将有效的节省科研工作者的工作量.
在利用GFP报告基因对蛋白质进行叶绿体定
２７３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图５　转基因烟草叶肉细胞中GFP荧光的观察　 AＧC．野生型烟草植株GFP荧光观察;DＧF．转基因pBI１２１ＧGFP植株GFP荧光
观察;GＧI．转基因pBI１２１ＧPPOＧGFP植株GFP荧光观察.A,D,G．GFP绿色荧光;B,E,H．叶绿体自发荧光;C,F,I．叠加后的结果;AＧI．
标尺为２０μm.
Fig．５　Fluorescencedetectioninthetransgenictobaccocels　AＧC．Wildtypetobaccofluorescentdetection;DＧF．Transgenicplant
pBI１２１ＧGFPfluorescentdetection;GＧI．TransgenicplantspBI１２１ＧPPOＧGFPfluorescentdetection;A,D,G．GFPfluorescence;B,E,H．Chlorophyl
autofluorescence;C,F,I．Overlapping;AＧI．Scalebarsare１０μm．
位的研究领域,多数研究报告所应用的方法是仅将
目标蛋白的预测转运肽与GFP融合来实现细胞定
位.在研究过程中我们虽然也发现了鸭梨多酚氧化
酶基因所推导氨基酸序列NＧ端８７~８９区域具备一
个AlaＧXＧAla的切割位点,且１~８９氨基酸序列区
域N端有大量的亲水性氨基酸残基,C端氨基酸残
基中半数以上为疏水残基,与已报道的大多数多酚
氧化酶转运肽特征相符(Fraignieretal．,１９９５).但
考虑到植物多酚氧化酶复杂的细胞定位方式,我们
还是保守的采用 RTＧPCR克隆基因 CDS序列与
GFP基因相融合的方式来实现鸭梨多酚氧化酶的
细胞定位.虽然这种构建融合蛋白的方式可使定位
结果更具说服力,但却未能证实研究所发现的引导
肽序列.因而,进一步验证鸭梨多酚氧化酶转运肽
序列,从而阐明经加工后的成熟鸭梨多酚氧化酶结
构和组成特点也成为了我们今后深化多酚氧化酶研
究的一个重点.
在本研究中,我们借助农杆菌介导法实现了荧
３７３３期　　　　　　 齐靖等:鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察
光表达载体向烟草的转化,并最终实现了鸭梨多酚
氧化酶在烟草中的细胞定位.虽然从理论上说,将
荧光表达载体转化鸭梨细胞中镜检更具说服力,但
实际操作中我们发现与烟草相比,鸭梨细胞体积过
小,我们很难对GFP发光源进行定位,因此只能选
择模式植物烟草进行遗传转化.虽然在分子水平上
这种验证方法是间接的,但考虑到利用GFP报告基
因实现蛋白在模式植物中的细胞定位已经成为蛋白
研究领域中普遍使用的一种方法(AbdelＧGhanyet
al．,２００５;Gaoetal．,２００６),且有着坚实的理论基
础,所以我们相信多酚氧化酶在鸭梨中的细胞定位
与本次实验结果相同,是位于在叶绿体中的.
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