全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Nov．２０１３,３３(６):８６５－８６９　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１３．０６．０２６
张春艳,王义,孙春玉,等．吉粳８８高效再生体系的建立[J]．广西植物,２０１３,３３(６):８６５－８６９
ZhangCY,WangY,SunCY,etal．EstablishmentofaneficientregenerationsystemofJijing８８[J]．Guihaia,２０１３,３３(６):８６５－８６９
吉粳８８高效再生体系的建立
张春艳,王　义,孙春玉,王康宇,张美萍∗
(吉林农业大学,吉林 长春１３０１１８)
摘　要:以吉粳８８为材料,通过对不同培养基和激素的筛选,确定最佳的再生体系.结果表明:NMB培养基为
吉粳８８最适的愈伤组织诱导培养基.通过L９(３３)正交实验研究最适激素浓度配比,筛选出吉粳８８愈伤组织诱
导的最佳激素配比为２．０mg/L２,４ＧD＋０．２mg/L６ＧBA＋０．１０mg/LNAA.在添加２．０mg/L６ＧBA＋０．５mg/L
NAA的NMB基本培养基条件下,吉粳８８的分化率最高,成培苗率也最高.
关键词:吉粳８８;培养基;诱导率;分化率;成苗率
中图分类号:S５１１　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１３)０６Ｇ０８６５Ｇ０５
Establishmentofanefficientregeneration
systemofJijing８８
ZHANGChunＧYan,WANGYi,SUNChunＧYu,
WANGKangＧYu,ZHANGMeiＧPing∗
(JilinAgriculturalUniversity,Changchun１３０１１８,China)
Abstract:Jijing８８wasusedastheresearchmaterialanddiferentmediaandhormonecombinationswereselected,in
ordertoobtainitsoptimalinＧvitroregenerationsystem．TheresultsshowedthatNMBmediumwasthemostsuitable
mediumforricecalusinductionamongthe５medium．Themostsuitableplanthormoneratiowasinvestigatedby
usingorthogonaltestL９(３３),andtheinductionratewasthehighestwhen２．０mg/L２,４ＧD,０．２mg/L６ＧBA,０．１０
mg/LNAAwereadded．Thediferentiationrateandregenerationratewerethehighestwhen２．０mg/L６ＧBA,０．５
mg/LNAAwereadded．
Keywords:Jijing８８;culturemedium;inductionrate;diferentiationrate;regenerationrate
　　水稻(Oryzasativa)是最重要的粮食作物之一,
种植已超过一万年(Sasakietal．,２００５).全球有超过
２/３的人是以水稻为主食(Pathaketal．,１９８２).吉粳
８８株型理想、高产稳定,可抗稻瘟病和稻曲病.其米
质优良,外观品质好且食味佳.吉粳８８还具有茎秆
粗壮、抗倒伏、根系发达和耐冷性强等优良农艺性状.
吉粳８８具有较多优良农艺性状,为吉林省广泛栽培
品种(张三元等,２００５).但是关于吉粳８８的组织培
养的研究及其应用研究的相关报道较少.为了更好
地开发并利用该品种的资源,吉粳８８离体培养体系
的构建就显得极为重要和必要.
组织培养技术是一项目前已广泛应用于水稻的
遗传改良(Rainaetal．,１９８９).刘巧泉等(２００４)为
提高中国稻米的铁含量,通过农杆菌介导将自行克
隆的菜豆铁结合蛋白基因导入到一个高产粳稻品种
中并获得了稳定遗传的高铁含量的植株.国际水稻
研究所(IRRI)将β胡萝卜素基因导入水稻中得到
了可以表达维生素 A的黄金水稻.(JacquelineA
收稿日期:２０１３Ｇ０３Ｇ２３　　修回日期:２０１３Ｇ０５Ｇ０９
基金项目:长春市科技计划项目(１１kz７７);吉林省自然科学基金(２０１２１５１８１)
作者简介:张春艳(１９８５Ｇ),女,湖南郴州人,硕士研究生,主要从事植物细胞工程方面的研究,(EＧmail)zhangcy１９８５＠yahoo．com.
∗通讯作者:张美萍,博士,教授,主要从事功能基因组学与系统生物学方面的研究,(EＧmail)wanglaoshi０６０６＠１６３．com.
Paine,２００５).因此,构建一个稳定的水稻再生体系
对于水稻的遗传转化就显得尤其重要.
前人主要从培养基类型、激素类型、激素添加浓
度、外植体材料等方面进行水稻再生体系的研究.
卢勤等(１９８９)、欧阳琳等(２００７)研究了不同培养基
及激素类型对胚性愈伤组织诱导及愈伤组织分化的
影响.王辉等(２０１２)以花药为外植体材料诱导愈伤
组织,并将诱导体系进行了优化.不同品种对培养
基的类型及激素配比要求不一,本实验在前人研究
的基础上,进一步探讨几种培养基对吉粳８８的适用
性,且以正交实验优化愈伤组织诱导体系,该体系的
成功构建为遗传转化奠定了坚实的基础.
１　材料与方法
１．１实验材料
超级稻吉粳８８,由吉林省农业科学院水稻研究
所提供.
１．２方法
１．２．１种子的消毒处理　选取籽粒饱满且无虫咬过的
成熟水稻种子,去壳,用７５％酒精表面消毒９０s,再用
０．１％的升汞振荡消毒７min,无菌水冲洗４~５次,用
无菌滤纸吸干表面水分.将消毒后的种子接种于诱
导培养基,每瓶均匀接种８粒,于２６~２８℃暗培养.
定期进行观察记录,２８d左右统计愈伤的诱导情况.
１．２．２培养基筛选　以 NMB、N６、MS、B５和LS为
基础培养基,根据表１添加不同种类和浓度的植物
生长调节剂,筛选最适合水稻愈伤组织诱导、继代增
殖和分化的培养基(表１).
表１　培养基的组成
Table１　Mediumcomponents
培养基类型
Mediumtype
成分Component
MS MS＋２．０mg/L２,４ＧD＋０．５mg/L６ＧBA＋０．１mg/L
NAA,＋３％蔗糖＋０．６５％琼脂,pH５．８Ｇ６．０
N６ N６＋２mg/L２,４ＧD＋０．５mg/L６ＧBA＋０．１mg/L
NAA＋３％蔗糖＋０．６５％琼脂,pH５．８
LS LS＋２mg/L２,４ＧD＋０．５mg/L６ＧBA＋０．１mg/
LNAA＋３％蔗糖＋０．６５％琼脂,pH５．８
B５ B５＋２mg/L２,４ＧD＋０．５mg/L６ＧBA＋０．１mg/L
NAA＋５％蔗糖＋０．６５％琼脂,pH５．５
NMB NMB＋２mg/L２,４ＧD＋０．５mg/L６ＧBA＋０．１mg/L
NAA＋３％蔗糖＋０．６５％琼脂,pH５．８
１．２．３优化愈伤组织诱导体系　以 NMB培养基为
基础培养基,琼脂０．６５％,蔗糖３％,５００mg/L脯氨
酸,３００mg/L酸水解酪蛋白,pH５．８.以２,４ＧD,６Ｇ
BA,NAA三个激素为因素设计正交实验进行愈伤
组织诱导(表４).
１．２．４优化愈伤组织分化体系　以 NMB为基础培
养基,琼脂０．６５％,蔗糖３％,５００mg/L脯氨酸,３００
mg/L酸水解酪蛋白,pH５．８.添加不同浓度配比的
激素(表２).将继代培养１~２次的愈伤置于滤纸
上干燥处理２d后,在光强为３０００lx的条件下培
养,光照１６h,黑暗８h的培养周期培养.培养２８d
后,统计分化率及成苗率.
表２　分化培养
Table２　Differentiationculture
序号 No． ６ＧBA(mg/L) NAA(mg/L)
１ １ ０．５
２ １ １．０
３ １ １．５
４ ２ ０．５
５ ２ １．０
６ ２ １．５
７ ３ ０．１
８ ３ ０．５
９ ３ １．５
１．３统计方法
愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织数/接种数×
１００％;愈伤组织分化率＝分化愈伤组织数/接种数
愈伤数×１００％;成苗率＝成苗的愈伤块数/接种的
愈伤块数×１００％
２　结果与分析
２．１不同培养基对诱导率及愈伤状态的影响
吉粳８８种子在５种愈伤诱导培养基中培养２８
d(表３),以 B５培养基出愈率最高,为８２．１１％;
NMB为其次,出愈率为８１．７３％;诱导效果最差的
为LS培养基,诱导率仅为６４．８５％.从愈伤组织形
态观察,虽然B５培养基的诱导率高,但诱导出的愈
伤组织含水量高,继代后褐化较为严重,愈伤增殖效
果也不佳;而 NMB培养基诱导出的愈伤组织色泽
淡黄,结构致密,继代培养后增殖迅速(图１).因
此,后续研究均采用NMB培养基作为基础培养基.
２．２以NMB为基础培养基进行正交试验诱导愈伤
结果
接种表４培养基上的水稻成熟胚在诱导培养７
d后,胚一端盾片处开始有淡黄色的愈伤组织形成.
６６８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
图１　不同培养基诱导２８d后的愈伤组织　A．MS培养基;B．N６培养基;C．LS培养基;D．B５培养基;E．NMB培养基.
Fig．１　Inducedricecalusondifferentmediacultivationafter２８d　A．MSmedium;B．N６Medium;C．LSmedium;D．B５
Medium;E．NMBMedium．
表３　五种不同培养基诱导率及诱导效果
Table３　Inductionrateandstatusoffivedifferentmedia
培养基
Medium
接种数 (个)
Inoculatenumber
诱导数 (个)
Inductionnumber
诱导率
Inductionrate(％)
愈伤状态
Calusstatus
MS ４６４ ３４５ ７４．３５ 淡黄,但增殖速度慢
N６ ５０４ ３７６ ７４．６０ 色泽淡黄,继代后愈伤稍微水化
LS ５２８ ３４１ ６４．５８ 过于致密,且有较多根状物,增殖慢
B５ ６２６ ５１４ ８２．１１ 色泽偏暗黄,含水高,继代后易褐化
NMB ３１２ ２５５ ８１．７３ 色泽淡黄,致密,增殖速度快
诱导培养２８d后进行计数,统计结果见表４.
当２,４ＧD的浓度为２mg/L,６ＧBA为０．２mg/
L,NAA为０．０５mg/L时,均值分别为最大.通过
综合比较,诱导的最佳激素配比应为２mg/L２,４Ｇ
D,０．２mg/L６ＧBA,０．０５mg/LNAA.
R２,４ＧD＞R６ＧBA＞RNAA,说明２,４ＧD对诱导率影响
最大,６ＧBA次之,NAA最小.结果显示组２诱导率
最高,基本符合最佳激素组合,且因２,４ＧD为主导因
素,NAA的量变化对诱导率影响最小,最终本实验
选择２mg/L２,４ＧD,０．２mg/L６ＧBA,０．１０mg/L
NAA这一激素浓度配比为最佳激素配比.
２．３愈伤分化率
继代培养１~２次的愈伤组织置于滤纸上干燥
处理２d后接种于不同激素配比的分化培养基上
(表３).接种３０d左右进行分化率和成苗率的统
计.分化出的苗进行移栽,并收集成熟后的种子.
分化出的苗及移栽后的苗和抽穗后的水稻苗如
图２.
结果表明,３、４、６组愈伤分化的效果最好.其
中４组愈伤分化效果不仅明显,分化率达７６％,而
且成苗率高达４３．７５％.其他组的愈伤在分化培养
了２~３个星期后,愈伤出现褐化现象,可能与添加
的激素浓度有关.４、５、６组愈伤褐化不太明显.综
合愈伤分化效果及成苗率和愈伤状态等因素的考
虑,最终选择４组为最佳激素配比:２mg/L６ＧBA,
０．５mg/LNAA.
３　结论与讨论
影响水稻再生的因素有很多,包括培养基的类
型、培养条件、激素配比和基因型等.本实验在相同
培养条件下,诱导率最高的为B５培养基,其次为
７６８６期　　　　　　　　　　　　　张春艳等:吉粳８８高效再生体系的建立
图２　分化出的苗及炼苗移栽　A．愈伤组织诱导出的再生苗;B．移栽后的苗;C．移栽苗结的穗.
Fig．２　Regeneratedplantsandplanting　A．Regeneratedriceplantsfromcalus;B．Transplant;C．Ricespike
表４　激素配比及结果
Table４　Hormonecombinationandresults
序号
No．
２,４ＧD
(mg/L)
６ＧBA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
诱导率
Inductionrate
(％)
污染率
Contamination
rate(％)
１ １ ０．２ ０．０５ ５２．１９ １７．５
２ ２ ０．２ ０．１０ ６６．２５ １２．５
３ ３ ０．２ ０．１５ ５６．２５ ２０
４ １ ０．５ ０．１０ ５０．１９ ２０
５ ２ ０．５ ０．１５ ５７．４４ １７．５
６ ３ ０．５ ０．０５ ５８．８８ ２０
７ １ ０．８ ０．１５ ５１．４４ ２０
８ ２ ０．８ ０．０５ ６２．６９ ７．５
９ ３ ０．８ ０．１０ ４４．４４ ２２．５
T１ １５３．８２ １７４．６９ １７３．７６
T２ １８６．３８ １６６．５１ １６０．８８
T３ １５９．５７ １５８．５７ １６５．１３
T１ ５１．２７ ５８．２３ ５７．９２ T＝４９９．７７
T２ ６２．１３ ５５．５０ ５３．６３
T３ ５３．１９ ５２．８６ ５５．０４
R １０．８６ ５．３７ ４．２９
表５　在不同激素配比下愈伤组织分化及成苗率
Table５　Differentiationandregenerationrate
underdifferenthormonecombinations
序号
No．
接种数(块)
Inoculate
number
分化数(块)
Differentiation
number
分化率
Differentiation
rate(％)
成苗率
Planting
rate(％)
１ １００ ６７ ６７ ２６．２５
２ １００ ６１ ６１ １８．７５
３ １００ ７０ ７０ ３１．２５
４ １００ ７６ ７６ ４３．７５
５ １００ ５１ ５１ ２２．５
６ １００ ７４ ７４ ３２．５
７ １００ ６８ ６８ ２８．７５
８ １００ ６６ ６６ ３１．２５
９ １００ ５７ ５７ ２７．５
NMB培养基,最差的为LS培养基,与 Niroulaet
al．(２００５)、李楠等(２０１０)报道的N６培养基是最适
合水稻愈伤组织诱导和分化的培养基结果不一致.
其原因可能是本实验在培养基中添加酸水解酪蛋白
和脯氨酸.由于基因型,培养条件等差异,诱导率可
能有微小的差异.MS培养基诱导和继代的愈伤较
软且继代后易于褐化,B５培养基诱导的愈伤过于致
密,且易于产生根状物,与Jaruwanetal．(２００８)报
道的结果相似.刘香玲等(２００５)都通过NMB培养
基进行水稻愈伤组织的诱导和继代,都得到了较高
的诱导率,适合水稻的诱导和分化.
２,４ＧD为水稻诱导最有效的激素,且以２．０mg/
L２,４ＧD为最佳的诱导激素.李楠等(２０１０)在诱导
愈伤实验中选用了２,４ＧD,６ＧBA 和 KT为诱导激
素,而向阳等(２００４)在诱导中运用了２,４ＧD和６ＧBA
这两种激素.本实验以２,４ＧD,６ＧBA和NAA设计
了一个３因素３水平的正交实验,结果显示,对诱导
率影响最大的激素为２,４ＧD.但由于种子陈旧程度
不同,有些种子已被虫咬过,在进行诱导培养时污染
率较正常情况大很多,这也是与李楠等(２０１２)的结
果相比,诱导率偏低的原因之一.本实验用６ＧBA
和NAA诱导分化,结果表明添加２．０mg/L６ＧBA
和０．５mg/LNAA分化率最高,成苗率也最高,为
４９．６７％.这与曾桂萍等(２００４)最适激素比为３
mg/L６ＧBA,０．５mg/LNAA不完全一致.
水稻以其基因组小且已测序等优点,已广泛作
为遗传转化的受体.但水稻为单子叶植物,不是农
杆菌的天然受体从而导致转化率低.因此,构建一
个高效的水稻再生体系可以弥补水稻不是农杆菌的
天然受体的缺陷.本实验通过培养基及激素的优
化,成功建立相对较成熟的离体培养体系,并很好地
解决了成苗率低的难题,为下一步水稻的遗传转化
奠定了前期基础.
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