全 文 ：分子标记及其在葫芦科作物抗病育种中的应用
周 　辉1 , 2 ,赵福 宽1 ,林 　成2 ,高遐 虹3 ,程继 鸿3
(1.北京农学院生物技术系 ,北京 102206;2.新疆农业大学园艺学院 ,乌鲁木齐 , 830052;3.北京农学院植物科技系 ,北京 102206)
　　摘　要:分子标记技术是较形态标记 、细胞标记和生化标记更为理想的遗传标记 , 已被广泛地应用于生
命科学研究的各个领域。本文综述了分子标记技术的基本原理和应用范围 , 近年来在植物抗病性遗传基因
的 DNA 分子标记和定位 , 分子标记辅助选择在抗病育种方面的应用 , 对葫芦科作物病害以及应用分子标记
进行抗病育种研究的现状进行了介绍 , 并对目前的研究中所存在的问题及应用前景进行了探讨。
关键词:分子标记;葫芦科;抗病
中图分类号:S642.603.4　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2005)01-0004-03
　　由病毒 、细菌 、真菌等引起的病害侵染葫芦科作物后会表
现出多种症状 ,常导致产量和品质的降低 , 严重时甚至绝产。
其中病毒病的发生和流行已成为困扰葫芦科生产的主要因
素 ,这些病毒已遍及世界各地种植葫芦科作物的地区。虽然
人们已较深入地研究了葫芦科作物病害发生与流行的趋势 ,
完善了多种病原检测技术 , 也为寻找相关抗病种质资源做了
大量工作 ,但其危害还是有不断发展的趋势 , 主要原因在于缺
乏单抗或多抗病害的栽培品种。而利用传统的育种方法使筛
选抗源和培育新抗病品种的过程漫长 , 又耗费人力物力。作
为一种强有力的辅助性工具 ,分子标记已全方位渗透到现代
植物育种的各个方面 ,从原材料的收集到标记辅助育种都显
示了它无可比拟的优越性。它的应用不仅没有造成传统育种
体系的紊乱 ,反之却使后者更趋成熟 、合理与完善 , 从而成为
一种高效 、快速 、准确的改良和创造作物新品种的新技术体
系。在葫芦科抗病育种中 , 利用分子标记可以加快抗源筛选
和抗病基因鉴定的速度 ,从而加快抗病育种的进程 , 促进抗病
基因的有效利用。
1　用于植物抗病育种的分子标记
分子标记是继形态标记 、细胞标记和生化标记之后发展
起来的一种新的遗传标记形式。同那些标记相比 , 分子标记
直接以 DNA 的形式表现 , 数量多且多态性高 , 许多分子标记
表现为显性 、共显性 , 能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型 ,
提供完整的遗传信息供育种实践利用[ 1] 。
1980年 Bostein 和White 等首次提出用 RFLP 作为遗传
标记构建遗传连锁图谱 ,之后 , 相继出现了 20 多种 DNA分子
标记方法 ,它们的应用已覆盖了生命科学的许多领域。按其
　　第一作者简介:周辉 , 女 , 1979 年生 ,
2002 年毕业于新疆农业大学园艺学院 , 现
为在职硕士研究生 , 在北京农学院生物技
术系从事蔬菜生物技术育种方面的研究。
参与了北京市教委与农业应用新技术北京
市重点实验室资助项目南瓜育种课题的研
究工作。
＊北京市教委和农业应用新技术北京市重点实验室资助项目
收稿日期:2004-09-08
技术原理 , 分子标记可分为 3 大类:第 1类是以分子杂交为基
础的标记技术 , 主要是 RFLP(Restriction Fragment Length
Polymorphism)。第 2 类是以 PCR 反应为基础的一系列分子
标记技术 , 如 RAPD(Random Amplified Polymo rphic DNA);
SSR(Simple Sequence Repeat);SCAR(Sequence Characterized
Amplified Regions);STS(Sequence Tagged Site)等 。第 3 类是
以酶切和 PCR 为基础的分子标记技术 , 如 AFLP(Amplified
F ragment Length Polymorphism);CAPS(Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence)。目前应用较多的是 RFLP , RAPD ,
AFLP 及 SS R。
RFLP 是指不同生物的 DNA 经限制性内切酶消化后 , 通
过分子杂交检测酶切同源片段大小上的差异。 这种差异是
DNA分子碱基突变引起的限制性内切酶酶切位点的缺失或
增加 , 以及 DNA 分子片段插入 、重复 、缺失等行为造成的酶切
片段长度上的差异。 RFLP 标记一般为共显性 , 但 RFLP 操
作较复杂 、费用较高。
RAPD是Williams 和Welsh(1991)两个研究小组同时创
建的一种运用随机引物扩增基因组 , 寻找多态性 DNA 片段
作为分子标记的新技术。 RAPD技术建立在 PCR(Polymerase
Chain Reaction)技术基础之上 , 利用一系列不同的寡聚核苷酸
为引物 , 对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增。 RAPD 技
术程序简单 、快捷 、成本低。
AFLP标记是由 Zabean 和 Vos(1993)发明的一项 DNA
分子标记。其要点是选择性地扩增基因组 DNA 的限制性酶
切片断:首先用两个(也可一个或多个)限制性内切酶消化基
因组 DNA , 再用与这两个酶酶切末端配对的两个双链人工接
头连接限制性酶切片段 , 作为扩增反应模板。 其实质是
RFLP 与 PCR结合的一种技术。 AFLP 多态性强 、稳定性高 、
重复性好。该技术的缺点是通常需用同位素 ,危害人的健康 ,
成本较高。
SSR也叫微卫星 DNA , 是指 DNA 分子中 2-4 个碱基组
成的简单重复序列 , 其分布遍及人类和动植物的所有染色体
及染色体各个片段[ 3] 。不同品种间 , 其重复单位数有极高的
变异 ,根据其两端特异序列来设计引物 , 通过 PCR 扩增基因
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组中的重复序列位点 , 分析基因组的多态性。该标记具有
RAPD 标记的所有优点 , 且多态性更丰富 , 同时又克服了
RAPD缺点 , 具有较高的稳定性。但要获得 SSR 引物需要进
行大量克隆 、测序和杂交验证工作。
在植物抗病育种中 ,分子标记除了被用于种质资源鉴定 、
分子遗传连锁图的构建 、基因克隆 、杂种优势预测外 ,还主要
用于目标性状基因的分子标记和标记辅助选择。
利用 DNA 分子标记对与抗性基因连锁的基因组区域进
行分析 ,鉴定染色体上特异的 DNA 片段 , 找出与抗病基因连
锁的分子标记 ,进而确认其在染色体上的位置 , 为以标记为基
础的选择和分离抗病基因打下基础[ 3] 。携带目的基因的近等
基因系是抗病基因分子标记定位的首选模式材料 , 但需要经
过多代回交才能获得 , 周期很长。在没有近等基因系的条件
下可以采用 Michelmore(1991)提出的 BSA 法 , 它只需在分离
群体中(如 F2、BC , DH 等)依据目标性状表型的差异(如抗病
与感病)构建两个基因池 , 即可对目的基因进行标记。目前 ,
利用分子标记已对多种作物的抗病基因进行了定位 ,徐炎 ,王
跃进[ 4]等采用 SSR和 PAPD 技术通过 155 个随机引物的筛
选 , 获得了一个与葡萄抗白腐病基因连锁的 RAPD 标记
OPP09-760 , 并在中国野生葡萄 8 个种的 32 个株系及欧洲
葡萄 16 个品种中得到验证:Paran 和 Michelmo re将生菜抗霜
霉病的 RAPD 标记 、Chang 将番茄抗斑萎病基因 Sw -5 标记
转化为 SCAR 标记;田苗英[ 6]等应用 RAPD方法获得了一个
与番茄 ToMV 抗性基因 Tm2nv连锁的标记。已定位的还有茄
子抗青枯病基因 RAPD 标记 , 马铃薯的青枯病基因 , 番茄抗
斑萎病基因等。
我们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择 ,
这称为标记辅助选择(MAS ,markerassisted selection)。它可以
使我们易于发现抗病材料 ,既省去抗病接种鉴定的繁琐程序 ,
又无需受各种环境因素的影响 , 这将加速对抗源的筛选与抗
病基因的鉴定 ,对制订有效的育种计划 ,提高育种效率 , 缩短
育种周期提供帮助。Hittalmani等以抗稻瘟病基因 Pi2(t)为
目标 ,先用一个与遗传距离为 2.8 cM 的标记进行选择 , 准确
率为96.8%;而用 Pi2(t)另一侧与之相距5.0 cM 的标记共同
选择时 ,准确率为 100%,说明分子标记辅助选择在抗病育种
中应用是完全可行的。 Barone等用 RLFP , RAPD和 AFLP分
子标记分析了马铃薯栽培品种与野生种(S.cmmer sonii)的
BC1 , BC2 和 BC3 回交各代中携带的野生型基因的程度及抗
软腐病基因渐渗的效率 ,以指导回交后代的选择。
2　葫芦科作物病害及防治
2.1　葫芦科作物病害
葫芦科作物的生产受到多种病害的侵袭 ,发病植株明显
矮化 ,叶片褪绿 、斑驳甚至卷曲变形 ,果实皱缩畸形 , 致使产量
降低 ,品质下降 , 商品性差 ,给生产造成较大的损失 , 已引起人
们的普遍关注。在我国 , 随着近几年葫芦科作物的栽培面积
逐年增加 ,病害也愈来愈严重。 特别是病毒病已成为导致葫
芦科作物损失最严重并最难防治的病害 , 凡是种植瓜类作物
的地区都会有病毒病的发生 , 常年发病率为 1%～ 100%, 各
种瓜类作物都有过病毒病危害减产甚至毁灭性灾害的报道。
王中原[ 7]等 2000 年对湖北江汉平原的甜瓜病毒病进行了调
查 , 当年病毒病的暴发造成甜瓜约 50%的面积减产 , 有 260
hm2(公顷)以上的面积绝收。 到目前为止 , 经国际病毒分类
委员会(ICTV)承认的能侵染葫芦科作物的病毒就包括 38 个
确定种和 9 个暂定种。其中黄瓜花叶病毒(CMV), 西瓜花叶
病毒(WMV), 小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV), 南瓜花叶病
毒(SqM V),番木瓜花叶病毒(PRSV-W)等为世界性分布和
危害最严重的病毒。
2.2　葫芦科病害的防治
研究葫芦科病害的目的在于寻找有效防治措施 , 控制和
减轻病害所造成的损失 。由于病害的发生受病原 、传播媒介 、
寄主和环境等多种因素的制约 , 其防治的手段也是多方面的 ,
如农业防治 、化学防治 、脱毒和繁育无病毒苗木 、交叉保护等。
而采用抗病品种是防治葫芦科作物病害的最根本有效的措
施 , 目前进行抗病育种可以采用基因工程育种 , 传统的杂交育
种及分子标记辅助选择育种。
基因工程育种中的有效基因主要来源于病毒 , 葫芦科作
物上应用较多的是外壳蛋白基因策略。在国外 ,葫芦科作物
的几种主要病毒WMV-2、CMV、SqMV、ZYMV 的外壳蛋白
基因均有转入葫芦科作物的报道。目前 , 通过 CP 基因策略
在葫芦科作物上已获得了一些工程植株 , 但由于多是采用单
一基因策略 , 获得的工程植株常表现的是阶段抗病性及延迟
发病 , 因此 ,研究者们将两种或多种 CP基因转化到葫芦科作
物上 , 以扩大其抗病范围。M.Fuchs(1995)等在日内瓦调查
了表达 ZYMV 和 WMV -2 的蛋白外壳基因的转基因南瓜
ZW-20 对这两种病毒混合接种表现高水平抗性。在我国也
已经把 WMV 的 CP 基因转入甜瓜 、西瓜 、黄瓜;CWV 的 CP
基因转入南瓜 、甜瓜 、番茄 、辣椒;SqMV 的 CP 基因转入烟
草[ 8 ～ 10] 。但目前我国报道的都是转入单一病毒的 CP基因。
传统杂交育种方法获得抗病性的最重要前提是筛选和收
集抗病材料。目前在葫芦科作物上已收集到的抗病种质资源
在抗病育种中发挥着重要的作用 。甜瓜对病毒病的抗性研究
在葫芦科中起步较早。 1967 年 R.E.Webb 就选育出了抗病
毒病的厚皮甜瓜品系 B66-5。 Provvidenti和 Robision(1978)
对南瓜属 14 个抗病野生种和 3 个栽培种进行了抗多种病毒
的筛选 , 发现南瓜品种中 C.moschata Nigerianlocal , C.maxi-
ma Pai Yu (China), C.ecuado rensis , C.ficifolia, C.feotidissima
和 C.pedatifo lia等对WMV-2 均有一定抗性。两个野生种
C.ecuadorensis和 C.foetidissima 高抗 WMV 和 PRSV —W , 对
CMW也有一定的抗性 , 是南瓜属中最有希望的 2 个多抗瓜
类作物优势病毒的野生种 。康东木等对西瓜野生材料 Egun
鉴定 , 初步表现出对WMV 、ZYMV、 CMV 等病毒高抗。古勤
生等对中国 18 个西瓜品种(品系)进行了抗 ZYMV 的筛选 ,
结果表明全部品种(品系)均感病 。
3　分子标记在葫芦科作物抗病育种中的应用
通过传统的杂交育种法获得抗病性就是要从现有品种 、
原始品种或农家品种及其相关的种间 、属间选择抗性材料;或
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者需要鉴定抗病基因 ,通过增系法或回交法 , 将抗病基因导入
现有品种。但是传统的抗病育种是以表型选择为基础的 , 杂
种后代的抗病筛选比较复杂 ,费时费力 , 抗性鉴定结果易受环
境和生育期的影响 , 且难以同时对多个抗性基因进行筛选。
特别是对植物数量性状抗性基因的鉴定和筛选中 , 投入人力
物力最多 , 工作量最大 , 效果不明显 , 严重地阻碍了数量抗病
基因在抗病育种中的应用。而现在采用传统的杂交育种和分
子生物学结合的方法可以弥补传统育种方法的许多弊病。在
葫芦科作物抗病育种中利用分子标记可加快抗源筛选和抗病
基因的鉴定速度 ,提高品种选育效率 , 缩短育种周期 ,从而加
快抗病育种的进程和促进抗病基因的有效利用。
目前 ,已经有许多葫芦科作物的抗病基因得到了可靠的
标记:许勇等获得了与西瓜抗病材料 PI296341抗枯萎病生理
小种 1的抗性基因连锁的分子标记 OPP01/ 700 , 该标记与抗
病基因的遗传距离为 3.0 cM 。通过 Southern 杂交检测证明
抗病连锁 RAPD 标记 OPP01/ 700 为单拷贝 ,对其进行克隆与
测序并转化为 SCAR 标记。该技术在抗病转育 F3 代群体中
得到了很好的应用。这是国内外到目前为止首次在西瓜上获
得的抗病基因 RAPD 标记及 SCAR 标记 , 并成功建立了一整
套西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。Wechter
等在甜瓜抗病材料 MR-1 上获得了与抗枯萎病生理小种 1
连锁的 RAPD 标记 , 并成功地将其转化为 SCAR 标记。
Hallen 等找到了与黄瓜抗病基因紧密连锁的 PCR 标记 , 并设
计了自动化操作设备 ,每天可对 4 800 个样品进行分析。
4　问题与展望
DNA 分子标记技术是建立在分子生物学基础上的 , 它使
对抗病基因和遗传变异的研究从传统的形态学性状分析跨入
到以核苷酸多态性为基础的分子水平分析 , 从而在选择的手
段上实现了从表现型选择到基因型选择的质的飞跃。尽管十
多年来分子育种的理论研究已取得了很大的进展 , 在植物抗
病育种中的应用还处于逐步探索阶段。在葫芦科作物抗病育
种实际应用中 ,凭借分子选择手段育成品系或品种的报道的
例子还很少。究其原因主要是以下几点:
首先是基因定位研究与育种程序相脱节 ,绝大多数的研
究者只把工作目标确定在鉴定和定位重要的基因上。在设计
研究方案时 ,选材往往只考虑基因定位的便利而不考虑育种
的需要。因此 ,在完成目标基因的定位后 , 并不能直接应用于
育种。如果选用的试验材料是目前推广的优良品系或品种 ,
那么目标基因定位的结果就可以直接指导育种实践。其次 ,
基因定位和分子标记技术在实用性和成本方面还有待于进一
步改进。对于质量性状的基因定位在技术上是成熟的 , 但对
于数量性状的基因定位仍然是个耗资费力的过程[ 2] 。而且 ,
缺乏良好的抗病种质资源 , 特别是缺乏单抗或多抗病害的栽
培品种成为分子育种的主要制约因素。尽管人们在现有的葫
芦科作物栽培种中努力寻找良好的抗源 ,但收效甚微。而要
把在近缘野生种中已找到一些抗源基因引入栽培种还有一定
的难度。对葫芦科野生种质抗病的生理生化机制和遗传规律
等基础理论的研究也很缺乏。现已从番茄 、小麦 、水稻 、大豆
等多种作物的种质资源中筛选出高抗品系 , 葫芦科作物病害
研究的系统性缺乏 , 使得该类作物在抗病育种方面远远落后
于其它作物。
随着新的分子生物学技术的发展 ,我们相信会有更完善 、
效率更高的新的分子选择育种技术体系建立起来 , 从而产生
更多精确定位的分子标记 , 在标记辅助选择研究领域中发挥
重要的作用 , 成为加快植物抗病育种进程的更可行和实用的
新途径 , 也为葫芦科作物抗病育种工作开辟新的前景。
主要参考文献:
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保护地栽培芹菜的病害防治
侯 和 菊
芹菜保护地栽培主要病害有芹菜斑枯病和叶斑病 ,以叶 、
茎危害为主。防治措施:
1　种子处理　采用温水浸种法 ,将种子置 48 ℃～ 50 ℃温水
中 ,并加以搅拌 , 30 min(分钟)后转用冷水浸 20 min(分钟),
滤出晾干播种 , 可杀死种子上的病菌。
2　实行轮作　这两种病菌均可在土壤中存活 , 实行 2 ～ 3 年
轮作可减轻发病危害。
3　控制温度　白天一般控制在 15 ℃～ 20 ℃, 高于 20 ℃应
通风 , 夜间控制在 10 ℃～ 15 ℃, 缩小昼夜温差 ,减少结露。
4　摘病叶　发病初期 ,将发病株的病叶和底部老叶摘除 , 带
出棚外深埋 , 防止传染。
5　合理密植　科学灌水 ,栽培密度要适宜 ,不能过密 , 灌水要
避免大水漫灌 , 防止棚内温度过大 , 引起病害的发生和流行。
6　药剂防治　为了不增加棚内温度 ,常采用烟雾剂或粉尘剂
防治 , 667 m2(平方米)用 45%百菌清烟剂 0.23 kg(公斤), 或
5%百菌清粉尘剂 1 kg(公斤)。
(山东省沂水县职教中心 , 276400)
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