全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2015，35(3)：414～419 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guihai~gxzw201311045
陈仲刚，吕秀兰，王进，等．24份甜樱桃材料自交不亲和s基因型鉴定_J]．广西植物，2015，35(3)：414—419
Chen ZG，I n XLan，Wang J，et a1．Identification of self-incompatibility genotypes of 24 sweet cherries[J]．Guihaia，2015，35(3)：414—419
24份甜樱桃材料自交不亲和 S基因型鉴定
陈仲刚，吕秀兰 ，王 进，阳姝婷，涂勋良，赖 静
(四川农业大学 园艺学院，四川 雅安 625014)
摘 要：甜樱桃品种绝大部分 自交不亲和，限制 了甜樱桃的正确评价和合理利用，因此 自交不亲和基因型的
鉴定对于生产具有重要意义。以 24个甜樱桃主栽品种为材料，用 5对蔷薇科李属引物组合对 24个甜樱桃 品
种进行了 S等位基因的 PCR扩增 ，克隆 S基因的扩增片段 ，用核酸序列在 GenBank上搜索 ，确定了 5种 S基
因的核酸序列和大小。结果表明：PruC2+PruC4R引物组合扩增效果最好 ；在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增
带其核酸序列相同，是同一种 S基因；5种 S基因扩增片段的大小分别是 S1为 800 bp，S3为 762 bp，S4为 962
bp，S5为 300 bp，S6为 456 bp，S9为 650 bp；24个甜樱桃 S基因型是红手球 、早红宝石为 $1S3，拉宾斯 SIS4 ，
红宝石 $1S6，布鲁克斯 $1S9，那翁 $3S4，秦林、泰安大紫、先锋、早大果 、丽珠、美早、5-106、左滕锦、桑提娜 为
$3S6，黑珍珠、红灯 、萨米脱、秦樱为 $3S9，胜利为 $5S9，明珠、红蜜 、雷尼、滨库为 $6S9。
关键词：甜樱桃；自交不亲和；S基因型
中图分类号：Q943；$662．5 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2015)03—0414—06
Identification of self-incompatibility genotypes
0f 24 sweet cherries
CHEN Zhong-Gang，LU Xiu-Lan ，WANG Jin，
YANG Shu—Ting，TU Xun Liang，LAI Jing
(College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)
Abstract：Sweet cherry exhibits the monofactorial gametophytic selgincocompatibility system，the correct evaluation and
rational utilization on sweet cherry cultivars have been 1imited because of the selbincompatibility。therefore。determina—
tion of correct pollen incompatibility groups and assignment of cultivars to the groups are essential for good crop produc—
tion．W ith 24 sweet cherry cultivars as materials，using 5 pairs of prunus primer combinations to amplify S-allele-specific
PCR for 24 kinds of sweet cherries and S-genotypes of sweet cherry cultivars were identified，the S~gene amplified frag
ments were cloned and searched in GenBank，and combined with 5 primer combinations，S~genotype of 24 cultivars were
identified．The conclusion was as follows：the same S genes displayed the same size fragments in electrophoresis；The si
zes of S-gene amplification fragments were s1 800 bp，S3 762 bp，S4 962 bp，S5 300 bp，S6 456 bp，S9 650 bp．And the
S genotypes of the tested self-incompatible cultivars were identified that Hongshouqiu and Early Ruby were S1S3；Lapins
was S1S4；Ruby was$1S6；Brooks was S1S9；Napoleon was$3S4；Qinlin，Tartarian，Van，Zaodaguo，Lizhu，Meizao，
5-106 and Satonishiki the same as Santina were$3S6；Heizhenzhu，Hongdeng，Samituo and Qinying were 8389；Victor
W3S$5S9；Mingzhu，Hongmi and Rainier the same as Bing were$6S9．
Key words：sweet cherry；self-incompatibility；S-genotypes
收稿 日期 ：
基金 项 目 ：
作者 简介 ：
通 讯作者 ：
2O14 03 28 修 回 日期 ：2014一O5—23
四川省科技支撑计划项 目(2013NZ0008)
陈仲刚(1 987)，男，四川雅安人，硕士，研究方向为果树种质资源与遗传育种 ，(E mail)465114431@qq．COFI1。
吕秀兰，博士，教授 ，研究方向为果树栽培学 ，(E mail)xlvj@]63．com。
3期 陈仲刚等 ：24份甜樱桃材料 自交不亲和 S基因型鉴定 415
樱桃 是蔷薇科李 属 (Prunus)樱桃 亚属 (subg．
Cerasus)植物 。甜樱桃(P．avium)果实大 ，颜色鲜
丽，味美 ，营养价值和药用价值高，是果农增收、增效
的果树产业之一 。但 由于甜樱桃 自交不亲和，大大
降低了座果率 ，限制其发展和正确评价。植物界 自
交不亲和主要有两种，一种是孢子体自交不亲和，另
一 种是配子体 自交 不亲和，而甜樱桃属于配子体 自
交不亲和。s基因遗传上由染色体上具有复等位基
因构成 的单一 位 点或 基 因座 控 制 (Bruce et a1．，
2006)。在一个 S基 因座上，含有多个 S等位 基因。
S基因在雌蕊中特异表达 ，产物糖蛋白(McClure et
nZ．，1989；Sassa et a1．，1992；Xue et a1．，1996)，具有
核糖 核 酸 酶 (RNase)活 性，这 种 糖 蛋 白也 叫 S—
RNase，它分布的位置 (Anderson et a1．，1986；Cor—
nish et a1．，1987)正是花粉生长抑制 的区域 ，能降解
同类品种花粉中的 RNA，抑制其授粉受精过程 。
鉴定 S基因的方法主要有 4种，本研究所 采用
的是 PCR法 (Jie et a1．，2005；Haldsz et a1．，2005；
Lopez et a1．，2004；Sanzol et a1．，2002)。所谓 PCR
法就是利用 PCR扩增 ，对扩增 片段进行克隆 ，再将
克隆序列在 Genbank上对 比搜索 ，确定 S基 因。该
方法简单、准确。通过深入 了解甜樱桃 自交 不亲和
性(SI)的遗传、分子机制和生殖现象，为品种间配置
授粉树和亲本育种选配提供理论依据 。
1 材料与方法
1．1材料
2012年 3月 9日于 山东果树研究 所苗辅 圃地
采集样品 ，24个甜樱桃品种名称(编号)分别为明珠
(1)、红蜜(2)、那翁(3)、秦林(4)、雷尼(5)、泰安大紫
(6)、先锋(7)、布鲁克斯(8)、黑珍珠 (9)、拉宾斯
(10)、早大果 (11)、早 红宝石 (12)、红 灯 (13)、滨库
(14)、萨米 脱 (15)、红 手球 (16)、丽珠 (17)、美 早
(18)、胜利(19)、5-106(2O)、红宝石(21)、秦樱 (22)、
左滕锦(23)、桑提娜 (24)，取完 整、无病虫 害的甜樱
桃幼嫩叶片为材料提取基因组 DNA。Taq DNA 聚
合酶、Mg。 、dNTPs、PCR—bufer及 5对 S—PCR 引
物组合购 自上海生工生物工程股份有限公司。
1．2方法
1．2．1基 因组 DNA 提 取 及 检 测 采 用 改 进 的
CTAB法提 取甜樱 桃 叶片基 因组 DNA(Verdoodt
et aZ．。1998；Struss et aZ．。2001)。
1．2．2引物序列(表 1)及 PCR扩增体 系 根据 已发
表的甜樱桃 S基因保守序列设计引物(Sonneveld et
nZ．，2001，2003)，引物 由上海生工生 物工程技术服
务有限公司合成 。
PCR 反 应 体 系 ：10× PCR Buffer 2．5 L，
dNTPs(2．5 rnmol·L。)1．6 FL，引物 1(10 Fmol·
L。)、引 物 2(10／~mol·L )均 为 0．8 L，DNA
(50～100 ng)0．5 L，TaqDNA 聚合酶 (5 U ·L )
0．2 L，PCR反应总体积 20 L。PCR反应程序 ：预
变性 94℃ 3 min，94℃ 30 S，32个循环 (56℃ 30
S，72℃ 2 min)，72℃延伸 5 min，12℃，PCR产物
在 1．5 9／6的琼脂糖凝胶上进行电泳分离电泳后用 EB
染色成像 。
表 1 蔷薇科李属通用引物组合及其序列引物组合
Table 1 Rosaceae Prunus universal primer combinations
and sequences of primer combinations
引物组合
Primer combination
序列 (5 一3 )
Sequence (5 — 3 )
EM—PC2consFD
EM—PC3consRD
PruC2
PruC4R
BFP93
BFP94
BFP2O8
BFP209
BFP21 2
BFP213
TCACMATYCATGGCCTATGG
AW CTRCCRTGYTTGTTCCATTC
CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC
GGATGTGGTACGATTGAAGCG
GTTCTTGCTTTTGCTTTCTTC
CATAGGCCATGGATGGTG
GTAATTGCAACGGGTCAAAATATGAG
ACAACTCAGTATTAGTTGCTGGATCA
ACATGGTACATGTTCCCAACGGATC
CTGCTGTTCGATTACAGTCAATATGTAC
1．2．3 S一等位基 因PCR扩增产物回收与纯化 用琼
脂糖凝胶 回收试剂盒 (OMEGA)回收 、纯化 扩增得
到 目的 DNA片段
1．2．4 目 的 片段 连 接 克 隆 载 体 Escherichia coli
DH5a来 自中国科 学院遗传 与发育研究所 601组 ，
pMD19-T载体 购 自 Takara公 司。将 回收 片段 与
Takara pMD19-T载体连接 ，连接体系如表 2，16℃
连接过夜 。
表 2 连接反应体系 I
Table 2 Components of ligation 1
试剂 Reagent 用量 Amount(FI )
Solution 1
pM D19 T
回收 DNA Recorer
1．2．5质粒 DNA热激转化 将 欲转化的连接体系
加入到装有 100 FL DH 5a感受态细胞 的管 中，冰
浴 30 min；取出放入 42℃水浴 中连接 90 S；将转化
416 广 西 植 物 35卷
混合物冰上放置 2～5 rain，加 900 L无添加抗生
素的 I B培养液 ，37℃，150 r·rain。保 温 45～60
min；取 5O L菌液涂布于含 0．1 mg·mI 。Amp的
I B琼脂平板上，倒置于 37℃温箱培养 12～16 h。
1．2．6重组菌落 PCR鉴定 挑取 白色单菌落接种 1
mI I B含氨苄(0．1 mg·mI )的液体培养基中，37
℃，200 r·min。’振荡培养 5 h；取 1 L的菌液作为
模板，用相应 的引物进行 PCR扩增，20 I 反应体
系见表 3。
表 3 PeR反应体系Ⅱ
Table 3 Components of PCR reaction 2
试剂 Reagent 用量 Amount( I )
lO× PCR Buffer(M g plus)
dNTP Mixture(Each 2．5 mlno1·I )
Sense Primer(1 0 fzmol·I )
Anti—Sense Primer(10 #m ol·I )
菌液 Bacili
FaKaRa Taq (5 U ·uI )
ddH ()
电泳检测 PCR，若出现了很亮的条带并与目的
片段的大小相一致 ，说 明 目的片段已经连接到克隆
载体中，取该菌液 1．5 mL，送上海生工公司测序。
2 结果与分析
2．1不同引物组对甜樱桃 S基 因的扩增效果及特异
性引物
2．1．1引物 组 合 EM PC2consFD+ EM—PC3consRD
对甜樱桃 S基因的扩增效果 从 图 1可以看 出，引
物组合 EM—PC2consFD+EM PC3consRD对一些
实验品种可以扩增出带，大多数都是两条带 ；对另一
些实验品种不能扩增 出带 。
2．1．2引物组 合 PruC2+PruC4R对甜 樱桃 S基 因的
扩增效果 由图 2看出，引物组合 PruC2+PruC4R
对实验品种大都可以扩增出带 ，都有两条 ，且比较清
晰 ，扩增效果较好。
2．1．3引物 组合 BFP93+ BFP94对甜 樱桃 S基 因的
扩增效果 由图 3看出，引物组合 BFP93+ BFP94
对实验品种只有少部分品种扩增 出条带 ，扩增仅有
一 条带 ，扩增效果较差 ，不能达到实验 目的。
2．1．4 S1、S5特异性 引物组合 BFP208+BFP209和
BFP212+BFP213对甜樱桃 S基 因的扩增效果 由
图 4看出，24个甜樱桃品种 ，布鲁克斯 、拉宾 斯、红
手球 、红宝石、早红宝石有一条带；胜利有一条带。
2．2甜樱桃 S基因的克隆测序及鉴定结果
对这些 DNA片段克隆测序显示，24个 甜樱桃
品种共包含 6个核苷酸序列 ，分别是 300、456、650、
762、800和 962 bp。通过测序 ，发现相 同位置上的
带 ，核酸序列相似性在 90％以上。进一步与 Gen—
Bank中的序列比较，按照核酸序列及其推测的氨基
酸序列分析 ，不同品种 ，相同大小和位置一致的扩增
片段是同一种 s基因；克隆的各基因部分片段分别
为 S1：800 bp；S3：762 bp；S4：962 bp；S5：300 bp；
S6：456 bp；S9：650 bp。由此 ，把 24个甜樱桃品种
的 S基因型确定，如表 4。
表 4 24份 甜樱桃 材料 的 S基 因型
Table 4 S genotypes of 24 sweet cherry culticars
3 讨论与结论
3．1不同引物组合对甜樱桃 S基因扩增效果
通过 5对引物组合对甜樱桃品种的扩增效果 比
较 ，引物 PruC2+PruC4R组合最好，EM_PC2consFD
+EM—PC3consRD次之 ，BFP93+BFP94最差。与
周杰(2008)得出的结论不一致 ，分析其原因可能是
2
5 6 8 8 5 2 0
2 l 0 O 0 O
【



3期 李立芹等：马铃薯 WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式 407
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