全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：１１８－１２１ ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．０２１
吴琼，黄龙全，张剑韵．烟草ＶＢ６吡哆胺－丙酮酸转氨酶的部分纯化与表征［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：１１８－１２１
Ｗｕ Ｑ，Ｈｕａｎｇ ＬＱ，Ｚｈａｎｇ ＪＹ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，
２０１３，３３（１）：１１８－１２１
烟草吡哆胺－丙酮酸转氨酶的部分纯化与表征
吴 琼１，黄龙全１，张剑韵２＊
（１．安徽农业大学 茶与食品科技学院，合肥２３００３６；２．安徽农业大学 生命科学学院，合肥２３００３６）
摘 要：通过冷冻干燥、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤柱层析，ＳＰ
葡聚糖凝胶Ｃ－２５阳离子交换柱层析等分离纯化技术，对烟草吡哆胺－丙酮酸转氨酶进行分离纯化。采用苯肼
衍生化方法检测活性，并对其基本酶学性质进行分析。结果显示：该酶被纯化了９２．３４倍；最适温度为７０℃，
最适ｐＨ为９．０。在ｐＨ７．０～９．０内稳定且热稳定性较好，８０℃保温３ｈ仍有５１．５５％的酶活力；在最适反应
条件下，测得反应底物吡哆胺和丙酮酸的Ｋｍ 值分别为６．３３７ｍｍｏｌ·Ｌ－１和０．８６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１。该结果为进一
步研究烟草体内ＶＢ６代谢机制奠定了基础。
关键词：烟草；吡哆胺－丙酮酸转氨酶；纯化；性质分析
中图分类号：Ｑ９４５．１４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－０１１８－０４
＊ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓ－
ｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔｏｂａｃｃｏ
ＷＵ Ｑｉｏｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｌｏｎｇ－Ｑｕａｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ－Ｙｕｎ２＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｅａ ＆Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ｂｙ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ，ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５ｉｏｎ ｅｘ－
ｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｙｌ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ９２．３４－ｆｏｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ；ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｄ ａｎ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ７０℃ａｎｄ ｐＨ ａｔ
９．０，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｐＨ７．０－９．０；ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｈｉｃｈ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｂｏｕｔ ５１．５５％ｏｆ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ８０℃ｆｏｒ ３ｈ；ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ Ｋｍｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｗｅｒｅ ６．３３７
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ａｎｄ ０．８６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＶＢ６ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ；ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
维生素Ｂ６（ＶＢ６）是一类吡啶化合物的总称，２－
甲基－３－羟基－５－羟甲基吡啶是它们共同的母体，吡啶
环第四碳位被羟甲基、氨甲基、甲酰基取代后分别形
成吡哆醇（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ，ＰＮ）、吡哆胺（Ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ，
ＰＭ）和吡哆醛（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ，ＰＬ），三者相应磷酸酯形
式为磷酸吡哆醇（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＮＰ）、
磷酸吡哆胺（Ｐｙｒｉｄｏｍｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＭＰ）和磷
酸吡哆醛（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ），这些化合
＊ 收稿日期：２０１２－０４－１７ 修回日期：２０１２－０６－０７
基金项目：安徽省自然科学基金重点项目（ＫＪ２０１０Ａ１１６）
作者简介：吴琼（１９８６－），女，山东临沂人，硕士研究生，从事烟草ＶＢ６ 代谢方面的研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈｕａｎｘｕａｎｌｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
＊通讯作者：张剑韵，博士，教授，从事维生素学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｊｉａｎｙｕｎ２１８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。
物可以相互转化（Ｗｅｎ，１９９７）。ＰＬＰ可作为细胞信
号传导的调节分子，对一些细胞膜上的离子通道具
有调节作用（Ｈａｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，
２００９）；在植物根的发育中，也可保护植物免受高盐、
紫外线、渗透压等一些环境胁迫因子的影响（Ｎａｏｔａ－
ｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。丙酮酸是糖代谢途径中最重要的
中间产物，是多种氨基酸、维生素及其它一些有用物
质的重要前体，吡哆胺－丙酮酸转氨酶（ＥＣ ２．６．１．
３０，ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，简称
ＰＰＡＴ）以ＰＭ 和丙酮酸为底物生成ＰＬ和Ｌ－丙氨
酸。ＰＰＡＴ在 ＶＢ６ 代谢途径中对 ＰＭ 的合成和
ＶＢ６ 降解具有重要意义（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９６２；Ｎｅｌｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８６）。编码ＰＰＡＴ的基因首次在固氮共生
根瘤菌 Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ３０３０９９中被鉴
定、克隆（Ｙｏｓｈｉｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６），但对植物体内
ＰＰＡＴ研究的文献则相对较少。烟草是重要的经济
作物之一，本文以烟草为研究对象，对其体内的
ＰＰＡＴ进行初步分离纯化和部分酶学性质研究，为
深入研究植物体内ＶＢ６ 代谢途径奠定基础。
１ 材料与方法
１．１材料和主要试剂
烟草鲜叶（实验室栽培，品种为云烟２１），盐酸
吡哆胺、盐酸吡哆醛购于美国Ｓｉｇｍａ公司，高氯酸、
苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、以丙酮酸、α－酮戊二酸、草
酰乙酸、盐酸苯肼、甘油等购自上海生物工程公司
（Ｓａｎｇｏｎ）。
１．２方法
１．２．１烟草ＰＰＡＴ酶活性的测定 烟草转氨酶的活
力检测参照Ｙｏｓｈｉｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）的方法。反应
体系为１．５ｍＬ，其中包括０．１ｍｏｌ·Ｌ－１硼酸／ＫＯＨ
（ｐＨ９．０）缓冲液；３ｍｍｏｌ·Ｌ－１酮酸、３ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＰＭ；酶液。３７℃水浴震荡反应２ｈ后添加０．３ｍＬ
的３ｍｏｌ·Ｌ－１高氯酸终止反应。８ ０００ｒ／ｍｉｎ离心
１５ｍｉｎ，弃去沉淀加入１ｍＬ蒸馏水与０．２ｍＬ苯
肼，６０℃反应２０ｍｉｎ，４１０ｎｍ下测定吸光度。对照
为先加入３ｍｏｌ·Ｌ－１高氯酸将酶液灭活。
酶活力单位（Ｕ）定义为：３７℃下，每分钟每毫
克蛋白催化生成的ＰＬ的纳摩尔数。配置不同浓度
的ＰＬ溶液，苯肼反应后在４１０ｎｍ处测定吸光值做
出标准曲线。
１．２．２蛋白质浓度的测定 蛋白质浓度测定采用
Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）的方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
１．２．３烟草鲜叶ＰＰＡＴ的分离纯化 称取烟草鲜叶
片１５０ｇ，按１∶３的比例加入预冷的缓冲液Ⅰ（５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼酸／ＫＯＨ，ｐＨ８．５，０．１ ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＰＭＳＦ、０．０５％巯基乙醇、５０％甘油）于搅拌机中搅
拌２０ｍｉｎ。４℃、８ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２０ｍｉｎ，弃去
沉淀，上清即粗酶液。然后将酶液于－５０℃下进行
冷冻干燥浓缩并将浓缩的酶液于４℃冰箱中保存
（汪家政等，２０００）。将浓缩液上样于ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａ－
ｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ离子交换柱（柱长３００ｍｍ，直径２０
ｍｍ），用缓冲液Ⅱ（５ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼酸／ＫＯＨ，ｐＨ８．５）平
衡后将酶液上柱，以缓冲液Ⅱ和ＮａＣｌ溶液（０．６ｍｏｌ·
Ｌ－１）进行连续梯度洗脱，流速２．０ｍＬ·ｍｉｎ－１，收集
活性峰溶液放入透析袋中，４℃下在缓冲液Ⅰ中透
析，每４ｈ更换一次透析液。将透析后的溶液经聚
乙二醇（２０ ０００）浓缩，上样于Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶
柱（柱长５００ｍｍ，直径２０ｍｍ）中，用缓冲液Ⅱ进行
洗脱，流速０．５ｍＬ·ｍｉｎ－１，５ｍＬ／管。收集活性峰
溶液放入透析袋中，经聚乙二醇（２０ ０００）浓缩后上
样于ＳＰ葡聚糖凝胶 Ｃ－２５离子交换柱（柱长６００
ｍｍ，直径１２ｍｍ），以缓冲液Ⅱ和 ＮａＣｌ溶液（０．６
ｍｏｌ·Ｌ－１）进行连续梯度洗脱，流速０．５ｍＬ·ｍｉｎ－１，
检测蛋白质含量与酶活性，收集活性峰溶液，透析浓
缩后于４℃保存。
１．２．４ｐＨ 值对烟草ＰＰＡＴ酶活性的影响 配制
ｐＨ７．０－１３．０的缓冲体系，除硼酸／ＫＯＨ缓冲液ｐＨ
不同外其他反应条件相同，测定酶在不同ｐＨ 值条
件下的活力。以酶活力最大者为１００％，计算相对
酶活力。反应体系１．５ｍＬ，其中添加酶液，３ｍｍｏｌ
·Ｌ－１ ＰＭ，３ｍｍｏｌ·Ｌ－１丙酮酸，０．１ｍｏｌ·Ｌ－１硼酸／
ＫＯＨ缓冲液（ｐＨ７．０～１３．０）于３７℃下反应２ｈ测
定酶活。另用上述ｐＨ范围的硼酸／ＫＯＨ缓冲液与
酶液混合放置３ｈ后，于３７℃反应２ｈ检测剩余酶
活，以初始酶活为１００％。
１．２．５温度对烟草ＰＰＡＴ酶活性的影响 测定２０
～１００℃不同温度下的酶活力，研究不同温度对酶
活力的影响。除反应温度不同外其他反应条件相
同，缓冲液硼酸／ＫＯＨ（ｐＨ９．０）。以酶活力最大者
为１００％，计算相对酶活力。另将酶液在各温度条
件下保温３ｈ后取出，于３７℃反应２ｈ检测剩余酶
活，以初始酶活为１００％。
１．２．６酶促反应时间与烟草ＰＰＡＴ酶活性的关系
分别设置不同的反应时间，除反应时间不同外其他
９１１１期 吴琼等：烟草吡哆胺－丙酮酸转氨酶的部分纯化与表征
反应条件相同。缓冲液ｐＨ９．０，于３７℃反应不同
时间后检测酶活。以酶活力最大者为１００％，计算
相对酶活力。并以时间和相对活力作图。
１．２．７化学试剂对烟草ＰＰＡＴ酶活性的影响 检测
不同化学试剂对烟草鲜叶中ＰＰＡＴ酶活性的影响
（Ｙｏｓｈｉｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６），向酶活反应中分别添加
不同浓度的化学试剂（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＰＬＰ、ＰＭＰ、羟
胺；１ｍｍｏｌ·Ｌ－１的苯肼、硼氢化钠），于３７℃，缓冲液
硼酸／ＫＯＨ（ｐＨ９．０）条件下反应２ｈ检测酶活。
１．２．８烟草ＰＰＡＴ酶学动力学参数的测定 在最适
反应条件（ｐＨ９．０，３７ ℃）下，分别以不同浓度的
ＰＭ／丙酮酸为底物。采用双倒数法 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅ－
Ｂｕｒｋ（１９３４），以底物浓度的倒数１／［Ｓ］为横轴，测得
酶活力的倒数１／Ｖ为纵轴作图，计算烟草ＰＰＡＴ的
Ｋｍ 值及Ｖｍａｘ。
２ 结果与分析
２．１烟草体内ＰＰＡＴ的初步分离纯化
烟草 ＰＰＡＴ通过冷冻干燥、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝
胶过滤柱层析和ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５阳离子交换柱
表１ 烟草ＰＰＡＴ分离纯化
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＡＴ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ
纯化
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
总蛋白质含量 （ｍｇ）
Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
总活力 （Ｕ）
Ｔｏｔａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
比活力 （Ｕ／ｍｇ）
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
纯化倍数
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ
回收率 （％）
Ｙｉｅｌｄ
粗提液 １８９．８４ ３２．８２ ０．１７ １ １００
浓缩酶 ２８．０５ ３４．８０ １．２４ ７．１７ １４．７８
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ ６．８６ ２７．５８ ４．０２ ２３．２７ ３．６１
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ ２．０８ ２２．８１ １０．９９ ６３．５６ １．０９
ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５ ０．９８ １５．７０ １５．９６ ９２．３４ ０．５２
图１ ｐＨ对ＰＰＡＴ活性的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ＰＰＡＴ
层析分离纯化后，所得到的纯化倍数等见表１。
２．２酶学性质
２．２．１ｐＨ 对烟草 ＰＰＡＴ 酶活性的影响 烟草
ＰＰＡＴ的最适反应ｐＨ 为９．０，ｐＨ８．０～１０．０时该
酶有较高的酶活力，随ｐＨ 升高活性逐渐降低，
ｐＨ１３．０时，酶活力只有峰值的２３．７６％（图１）。酶
液于ｐＨ７．０～１３．０的硼酸／ＫＯＨ缓冲液中放置３ｈ
后取出，于３７℃反应２ｈ检测剩余酶活。结果表
明，ｐＨ７．０～９．０范围内酶活力较为稳定，３ｈ后残
留活力仍在９０％以上。而ｐＨ１０～１３．０范围内酶
图２ 温度对ＰＰＡＴ活性的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ＰＰＡＴ
活力下降较大，分别下降了 １１．２７％、１４．０７％、
３６．６１％和５１．４３％。
２．２．２温度对烟草ＰＰＡＴ酶活性的影响 随着反应
温度的升高，烟草ＰＰＡＴ活性逐步升高，７０℃时酶
活性达到最高，继续升高反应温度，活性逐步降低
（图２）。酶液在各温度条件下保温３ｈ后，于３７℃
反应２ｈ检测剩余酶活。结果表明，在２０～５０℃保
温３ｈ后，残留酶活力仍在９０％以上。６０℃、７０℃
下保温 ３ｈ 后酶活力下降较 大，分别下降了
２１．０２％、３１．９３％。８０℃下保温３ｈ后残留酶活力
０２１ 广 西 植 物 ３３卷
仍有５１．５５％。
２．２．３酶促反应时间和ＰＰＡＴ酶活性的关系 在反
应前３６０ｍｉｎ内，烟草ＰＰＡＴ活性与时间存在较好
的线性关系，随着反应时间的延长，斜率变小，反应
曲线趋于平缓（图３）。
图３ 酶促反应时间和ＰＰＡＴ的关系
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ
ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ＰＰＡＴ
表２ 化学试剂对纯化后烟草ＰＰＡＴ活性的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＰＰＡＴ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
试剂 Ｒｅａｇｅｎｔ ＯＤ４１０ｎｍ（纯化酶）
＋空白 ０．１８０±０．００１
＋ＰＬＰ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１） ０．１８３±０．００１５
＋ＰＭＰ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１） ０．１８２±０．００５５
＋羟胺（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ０．１８２±０．００６
＋苯肼（１ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ０．１８９±０．００１
＋硼氢化钠（１ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ０．１７７±０．００２５
表３ 烟草ＰＰＡＴ与ＰＭＰ和丙酮酸的反应
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ＰＰＡＴ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＭＰ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＯＤ４１０ｎｍ
（粗酶）
ＯＤ４１０ｎｍ
（纯化酶）
Ｅ＋空白 ０．００５±０．００１ ０．００５±０．００１
Ｅ＋ＰＭＰ ０．０２４±０．００３ ０．０１８±０．００１
ＰＭＰ＋丙酮酸 ０．０６６±０．００１ ０．０５２±０．００１
Ｅ＋ＰＭＰ＋丙酮酸 ０．０９１±０．００３ ０．０６６±０．００２
２．２．４化学试剂对烟草ＰＰＡＴ酶活性的影响 检测
不同的化学试剂对烟草鲜叶中ＰＰＡＴ酶活性的影
响，结果如表２所示。ＰＬＰ、ＰＭＰ既不能促进也不
能抑制烟草转氨酶的活性；苯肼、硼氢化钠、羟胺几
种典型的 ＰＬＰ－依赖型酶抑制剂也不能使烟草
ＰＰＡＴ的活性钝化，另外，粗提液与纯化酶液在丙酮
酸、ＰＭＰ存在的情况下，并不能发生转氨作用使ＰＬ
的量增加（表３）。
２．２．５烟草ＰＰＡＴ的酶反应动力学参数测定 在
ｐＨ９．０，３７℃条件下，烟草ＰＰＡＴ分别以不同浓度
的ＰＭ／丙酮酸为底物进行反应。采用双倒数法
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅ－Ｂｕｒｋ测得 ＰＭ 及丙酮酸的 Ｋｍ 值为
６．３３７、０．８６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１。Ｖｍａｘ值分别为０．０４１、
０．０１７μｍｏｌ·ｍｉｎ－
１·ｍｇ－１。
３ 结论与讨论
烟草ＰＰＡＴ通过冷冻干燥、离子交换层析、凝
胶过滤层析等分离纯化方法，纯化了９２．３４倍。烟
草 ＰＰＡＴ 的最适 ｐＨ 为 ９．０，与假单胞菌属中
ＰＰＡＴ最适 ｐＨ 相似（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９６２），且在
ｐＨ７．０～９．０的范围内酶活力较为稳定、放置３ｈ后
残留活力仍在９０％以上，表明该酶具有良好的酸碱
稳定性；烟草ＰＰＡＴ的最适温度为７０℃，这与Ｙｏ－
ｓｈｉｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）从大肠杆菌中纯化的重组
ＰＰＡＴ的最适温度相同，且酶液在８０℃放置３ｈ后
残留酶活力仍有５１．５５％，该酶具有较好的耐热性。
研究发现烟草遭遇病原体侵染后体内的 ＶＢ６ 含量
增加，ＰＬＰ、ＰＬ和ＰＮ 是烟草 ＶＢ６ 的主要存在型
（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１），ＰＰＡＴ能够催化ＰＭ 和ＰＬ之
间的转氨作用，在ＶＢ６ 代谢途径中涉及到ＰＭ 的合
成及ＰＮ的降解途径。烟草ＰＰＡＴ良好的酸碱稳定
性及较好的耐热性，有利于维持烟草体内ＶＢ６ 含量
的动态平衡及植物对不良环境的适应。
ＰＬＰ、ＰＭＰ既不能促进也不抑制烟草ＰＰＡＴ的
活性；苯肼、硼氢化钠、羟胺几种典型的ＰＬＰ－依赖型
酶抑制剂也不使烟草ＰＰＡＴ的活性钝化。ＰＬＰ－依
赖性转氨酶很多，但能像ＰＬＰ－依赖性转氨酶一样催
化反应的ＰＬＰ－非依赖性转氨酶却很少，ＰＰＡＴ利用
ＶＢ６ 的化合物作为反应底物而不是作为辅酶（Ｎｅｌ－
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。烟草ＰＰＡＴ以丙酮酸、ＰＭ 为底
物的Ｋｍ 值分别为６．３３７、０．８６７ｍｍｏｌ·Ｌ－１。本文
为进一步研究植物体内ＶＢ６ 代谢途径提供依据。
参考文献：
汪家政，范明．２００２．蛋白质技术手册［Ｍ］．北京：科学出版
社：６１－６２
Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭＭ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉ－
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２：２４８－２５４
Ｃｈｏｉ ＥＹ，Ｃｈｏ ＹＯ．２００９．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ６ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ａｎ－
ｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｅｒｃｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ
（下转第１２５页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ １２５）
１２１１期 吴琼等：烟草吡哆胺－丙酮酸转氨酶的部分纯化与表征
量不算高，但实际情况是由于样品采集时间和采集
方法的原因造成的。由于野生大豆的炸荚特性，采
集时多数豆荚是没有成熟的青荚，其种子成熟度不
够，直接影响了其蛋白质的含量值。因此，野生大豆
材料的采集应分多次采集成熟度较高的豆荚。另
外，测试结果没有反映出粗蛋白质含量与材料生长
所在地理位之间的相关性，还需要作进一步研究。
栽培大豆是我国主要的油料及粮食作物，作为其近
缘种的野大豆具有许多优良性状，因此在作物育种
上可利用野大豆培育优良的栽培大豆品种。同时，
野大豆营养价值高，又是牛、马、羊等各种牲畜喜食
的牧草，因此对我国丰富的野大豆种质资源，必须加
强保护和开发利用。
本研究测定了８个桐柏野生大豆样品的粗蛋白
质含量，对比两种测试方法，统计分析测试结果一
致，为今后大量进行类似检测采用消化—分光光度
法这一更加简便可行的方法提供了依据。同时，８
个野大豆样品粗蛋白质含量的数据显示，仅有２个
样品高于全国野大豆蛋白质含量的平均值，据此反
思取样方法，探讨并提出了针对野生大豆材料的特
性应采取的取样措施。
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