全 文 ：收稿日期:2008-03-24 接受日期:2008-05-08
基金项目:浙江省重大科技项目(2005C12019-02)
作者简介:田爱梅(1972-),女 ,山西河曲人 ,博士生 , 讲师 ,研究方向为植物生殖发育及其分子调控。 E-mail:tianaimei@126.com
通讯作者:曹家树(1958-),男 ,湖南芷江人 , 教授 ,博士生导师 ,主要研究方向为植物生殖发育及其分子调控。 Tel:0571-86971188;E-mail:jshcao@
zju.edu.cn
文章编号:1000-8551(2008)06-789-05
十字花科植物 LTP 基因 BcMF 15同源序列克隆
与进化分析
田爱梅1 , 2 曹家树1
(1.浙江大学蔬菜研究所 ,浙江 杭州 310029;2.三峡大学化学与生命科学学院 ,湖北宜昌 443003)
摘 要:为获取 LTP 在物种间的演化和分类信息 ,并为验证该基因在花粉发育过程中的生物学功能提供
前期证据 ,根据白菜雄性不育相关的 LTP 基因 BcMF15全长序列设计引物 ,运用 PCR技术分别从十字
花科 6属 10种材料中克隆了 LTP 基因 BcMF 15的同源序列。经比较分析表明 ,这些同源序列的相似性
达 80%以上 ,所推导的氨基酸序列相似性达 53%以上 ,且两者种间差异分别为 0 ～ 1.1%、0 ～ 4.0%,除
圆白 萝卜和其他属的差异较大外 ,属间差异分别是 0.1%～ 23.4%、0.9%～ 5.0%。LTP 基因的氨基酸
序列在 N端的跨膜疏水结构域高度保守 ,而在C 端则存在一定程度的变异 。这些结果表明该基因具有
较好的保守性 ,可能在十字花科植物的花粉发育中行使重要的功能 。由核酸序列构建的分子系统树可
知 ,在亲缘进化关系上芸薹属与萝卜属较近 ,其他依次为荠菜属 、拟南芥属和山芥属 ,而与诸葛菜属最
远 ,可见在十字花科 BcMF15序列差异属间较种间大 。
关键词:十字花科;LTP基因;BcMF15;克隆;系统发育
CLONING AND EVOLUTIONARY ANALYSIS OF HOMOLOGOUS SEQUENCESOF LTP GENE IN CRUCIFERAE
TIAN Ai-mei1 ,2 CAO Jia-shu1
(1.Institute of Vegetable Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 310029;
2.College of Chemistry and Life Science , Three Gorges University , Yichang , Hubei 443003)
Abstract:In order to elucidate the information on evolvement and categorization of LTPs , and clarify mechanism on LTP in
pollen development among plants at gene level , LTP gene analogues from 10 species of 6 genera in Cuciferae were obtained by
PCR strategy using specific primers designed from the full length of BcMF15 , a putitive LTP gene which was male sterile
related.The phylogenetic relationships of these species belonging to the family Cruciferae were investigated through comparison
of the genes.Homologous sequences of BcMF15 comparison indicated that the similarities among the genes at nucleotide and
amino acid levels were over 80% and 53%, respectively.The differences in genes at nucleotide and amino acid levels
between species ranged from 0 to 1.1% and 0 to 4.0%, respectively , except for Raphanus those between genera were 0.1%
-23.4%and 0.9%-5.0%, respectively.The conserved region of amino-acid sequences of BcMF15 orthologs included the
transmembrane region in N-terminal;however there was some variation in C-terminal.These results showed that in Cruciferae
the BcMF 15 was relative conservative in evolution , and BcMF 15 may play an important role in pollen development.The
phylogenetic tree was thus constructed based on the alignment nucleotides sequences.The maximum parsimony (MP)trees
showed that Brassica was closely related to Raphanus , followed by Capsella Medic , Arabidopsis Heynh and Barbarea , most
distantly related to Orychophrogmus.It was concluded that BcMF15 gene was applicable to genus taxon because the
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Journal of Nuclear Agricultural Sciences
differences of sequences in nucleotides and amino acids were lower between species than genera.
Key words:Cruciferae;LTP gene;BcMF 15;isolated;phylogenetic development
在高等植物中 , 脂质转移蛋白(lipid transfer
proteins , LTPs)是植物生命活动中一类重要的活性蛋白
质 ,占细胞可溶性蛋白的 4%,其显著的结构特征是分
子内有一个疏水孔穴 ,在体外能够可逆地结合和转运
多种类型的疏水分子。LTPs具有低分子量 、高的位置
保守性的特点 ,如具有 8个保守的半膀胺酸(Cys)位
点 ,在 N端具有典型的信号肽结构 ,在植物生殖发育 、
抗性和防御反应及信号转导中 ,行使着重要的生理 、生
化功能[ 1 ～ 3] 。
目前分子生物学技术的日益完善 ,使人们有可能
根据核酸资料来探讨生物类群的系统演化关系。核酸
分子包含着生物遗传的信息 ,同时也记载着生物进化
的历史 ,核酸结构指导生物的形态建成和个体发育 ,还
反映生物之间的亲缘关系[ 4] 。我们在利用 cDNA-AFLP
技术结合 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术
分析矮脚黄白菜(Brassica campestris ssp.chinensis , syn.
B .rapa ssp.chinensis)雄配子减数分裂的胞质分裂突
变体(the male meiotic cytokinesis , mmc)与野生型植株花
蕾转录组的差异时 ,发现一个因 MMC 突变而导致沉
默的脂质转移蛋白基因 BcMF15(登录号:EF600901),
BcMF15基因与拟南芥的 LTPs基因有 88%的序列相似
性 ,且具有 LTP典型的结构特征。时空表达模式分析
发现该基因在可育系的 1 ～ 5级花蕾中表达 ,并持续到
嫩角果的形成 ,而在花茎和花茎叶等孢子体组织中未
检测到 BcMF 15的表达 ,而在不育系的对应组织中也
没有表达[ 5] ,通过反义 RNA 和 RNA干涉技术在`油青
菜心 上证实该基因与植物的雄性不育密切相关(资料
待发表)。为进一步研究该基因在花粉发育过程中的
生物学功能 ,除了采用反义 RNA或 RNAi技术等进行
转化分析外 ,采用系统发育关系较明确的相邻类群 ,应
用生物信息学方法对其进行基因组序列分析等 ,可利
用该基因在生物间的演化和分类信息 ,为分析其功能
提供前期依据。本研究根据 BcMF15 DNA全长序列设
计引物 ,运用PCR技术扩增的十字花科6属 10个物种
的LTP同源序列进行克隆和分析 ,为该基因的结构和
功能分析奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
所用十字花科 6属 10个材料(表1)由浙江大学蔬
菜研究所细胞与分子生物学实验室提供 。PCR试剂盒
购自鼎国生物技术有限公司;限制性内切酶购自上海
生物工程公司;PCR产物回收试剂盒购自 V-gene 公
司;pGEM-T easy 载体克隆试剂盒购自 Promega 公司;
Taq DNA聚合酶和 100bp DNA Ladder 为北京鼎国生物
技术有限公司生产;T4 DNA 连接酶和 pGEM-T-easy-
vector 购自美国 Promega 公司;大肠杆菌(Escherichia)
DH5α菌株为本实验室保存 。
表 1 试验所用十字花科的材料
Table 1 Materials of Cruciferae in the experiment
属
genera name
种
species name
品种
cultivars
序列长度
length of
sequence(bp)
基因名称
gene name
芸薹属 Brassica L. 普通白菜 B.campestris ssp.chinensis var.communis 矮脚黄 Aijiaohuang 665 BcMF15
油冬儿 Youdonger 665 BcMF15b
乌塌菜Wutacai 665 BcMF15c
分蘖菜 B.campestris ssp.chinensis var.multiceps 马耳头Maertou 665 BcMF 15a
芜菁 B.campestris ssp.raifera 温州盘菜 Wenzhou-pancai 665 BcMF 15d
萝卜属 Raphanus L. 萝卜 R.sativus L. 圆白 Yuanbai 637 RsMF15
拟南芥属 Arabidopsis Heynh. 拟南芥 A.thaliana 675 AtMF 15
山芥属 Barbarea R.Br. 欧洲山芥 B.vulgaris 674 BvMF15
荠菜属 Capsella Medic. 荠菜 C.bursapastoris 675 BbMF 15
诸葛菜属 Orychophrogmus Bunge 诸葛菜 O.violaceus 665 OvMF 15
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 取适量上述植物材料的叶片 ,分别
置研钵中 ,加入液氮研磨成粉状 ,然后采用 CTAB法提
取植物材料的总 DNA。
1.2.2 引物合成 根据 BcMF15 DNA全长序列设计
引物 ,扩增十字花科植物 BcMF15的同源基因全长序
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列。上游引物 P1:5 -CGAAGCTAATTATCACGAGAAC-
TAC-3 下游引物 P2:5 -CACCAACTTTATGCGTAATAA-
GCATG-3
1.2.3 目的基因的 PCR扩增 、克隆 、测序和序列比较
分别以十字花科 6个属 10 种材料的总 DNA 为模
板 ,扩增 BcMF 15全长。PCR反应总体积 25μl , 包括
(10ng μl)DNA 模板 1μl 0.5μl , 10×PCR 反应缓冲液
2.5μl ,10μmol L dNTP 0.5μl ,上下游引物(10μmol L)各
0.5μl ,Taq DNA 聚合酶 1.5单位 ,反应条件为 94℃预
变性 2min;94℃变性 30s , 56℃退火 30s , 72℃ 延伸
2min ,30个循环;72℃延伸 10min。扩增产物用 1.0%
的琼脂糖凝胶电泳检测其大小 、纯度及亮度 。对扩增
效果好的样品用 VITAGENE公司的 DNA 凝胶回收试
剂盒回收 ,T4 连接酶 4℃连接过夜 ,转入 DH5α大肠杆
菌中 。挑取单个白色菌落 , 用碱裂解法抽提质粒
DNA ,用 EcoRI进行单酶切鉴定和 PCR鉴定后 ,送上海
博亚生物公司测序。对于大于 500bp的片段需要双向
测序然后拼接 , 并根据目的基因进行人工校正与酶切
位点分析 ,去除载体序列 , 获得同源基因序列。使用
DNASTAR软件包中的 MegAlign 程序分析同源基因的
相似性 ,同时用DNASTAR软件分析这些同源基因序列
所编码氨基酸序列 ,并用由SMART软件分析氨基酸序
列的结构特征[ 6] 。
1.2.4 系统树的构建 根据已经分离的 LTP 基因核
苷酸序列 ,参考张 [ 7] 的分析方法 , 利用Clastal X 1.81
软件进行多序列对齐和排序 ,用 GenDOC 软件检测输
出同源比对结果。Clastal X 1.81的结果用最新版的
MEGA3.1软件构建 MP (maximum parsimony)[ 8] 系统进
化树 。
2 结果与分析
2.1 LTP同源基因的扩增与克隆
利用引物 P1 、P2对十字花科 6 属 10种材料的基
因组 DNA分别进行 PCR扩增(图 1)。PCR产物回收
后与 T-easy 载体连接 ,转化大肠杆菌 ,经蓝白斑筛选 ,
挑选阳性克隆 ,经单酶切鉴定后测序。经测序得到
BcMF15同源基因的 DNA 序列 , 序列全长在 637 ～
675bp之间 。
2.2 LTP基因同源序列比对分析
对克隆到载体中的片段测序拼接完成后的序列进
行人工校正和酶切位点分析 ,去除载体序列后获得同
源基因序列(表 1)。基因 DNA 的长度为 637 ～ 675bp
(图 2),最大开放阅读框为 312 ～ 318bp ,10个阳性克隆
图 1 BcMF 15在十字花科 10 种材料中
同源基因的扩增结果
Fig.1 The homologous BcMF15 gene amplified from
10 species in Cruciferae
1:3kb ladder DNA标准分子量;2:代表`马耳头 ;3:代表`乌塌菜 ;4:
代表`油冬儿 ;5:代表`矮脚黄 ;6:代表`温州盘菜 ;7:代表荠菜;8:
代表拟南芥;9:代表欧洲山芥;10:代表`圆白 萝卜;11:代表诸葛菜
1:3kb DNA ladder marker;2:was Brassica campestris ssp.chinensis var.
multicep cv.Maertou;3:was B.campestris ssp.chinensis var.rosularis
cv.Wutacai;4:was B.campestris ssp.chinensis var.communis cv.
Youdonger;5:was B. campestris ssp. chinensis var. communis cv.
Aijiaohuang;6:was B.campestris ssp.raifera cv.Wenzhou-pancai;7:was
Capsella bursapastoris;8:was Arabidopsis thaliana (Columbia);9:was
Barbarea vulgaris;10:was Raphanus sativus cv.Yuanbai ;11:was
Orychophrogmus violaceus
均能推导出完整的氨基酸序列 ,且起始密码子为ATG ,
终止密 TAA , 编码 103 ～ 106个氨基酸。将所得到的
LTP 序列用 DNAStar软件中的 MegAlign 程序按最大同
源性进行核苷酸同源序列比对分析 。结果表明 ,植物
LTP同源基因比较保守 ,在核苷酸水平上的序列相似
性为 80.1%～ 100.0%,氨基酸序列相似性为 53%～
100%(表 2)。分析发现 ,不同植物物种 LTP 同源氨基
酸序列在N端有长度为 26个氨基酸残基的保守区域 ,
而在C 端则存在一定程度的变异。由 SMART 软件分
析N端高度保守处于该跨膜蛋白的疏水区 。
2.3 LTP基因同源序列的演化关系分析
利用 MEGA3.1系统发育分析软件对十字花科 6
属 10种材料的 BcMF15同源序列比对结果进行分析 ,
构建获得其 MP进化树(图 3)。从图中可以看出芸薹
属物种中的同源序列与萝卜属的 RsBcMF15序列亲缘
关系较近 , 其次 为 BbMF 15 、AtMF 15 和 BvMF15 、
OvMF15。这与十字花科属间的演化关系相一致 ,即芸
791 6期 十字花科植物 LTP基因 BcMF 15同源序列克隆与进化分析
图 2 十字花科不同物种 BcMF15 的同源比对
Fig.2 Alignment of BcMF 15 homologous gene
薹属与萝卜属关系较近 ,其次为荠菜属 ,拟南芥属和山
芥属 ,与诸葛菜属关系最远。
3 讨论
阐明脂质转移蛋白基因的功能对整个基因系统演
化的理解至关重要 ,同时对该基因在系统进化中保守
性分析有助于揭示其蛋白结构与功能的关系 ,并能从
基因进化的角度进行研究 。本研究对十字花科 6属
10种材料的基因组 DNA分别进行 PCR扩增 ,并得到
了 BcMF 15同源基因相应的 DNA序列 ,这些序列长度
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表 2 十字花科植物 LTP 同源基因核苷酸和氨基酸序列的相似性比较
Table 2 The similarity analysis of homological sequences of LTP gene from Cruciferae
序列号
sequence No. AtMF15 BbMF 15 BcMF15d BcMF 15 BcMF 15a BcMF 15b BcMF 15 c BvMF 15 OvMF 15 RsMF15
AtMF15 — 99.9 99.2 99.2 99.1 99.2 99.1 99.7 99.2 80.4
BbMF15 100.0 — 99.1 99.1 98.9 99.1 98.9 99.6 99.1 80.2
BcMF15d 96.2 96.2 — 100.0 99.8 100.0 99.8 98.9 100.0 80.7
BcM15 96.1 96.1 100.0 — 99.8 100.0 99.8 98.9 100.0 80.7
BcMF15a 96.2 96.2 100.0 100.0 — 99.8 99.7 98.8 99.8 80.6
BcMF15b 96.2 96.2 100.0 100.0 100.0 — 99.8 98.9 100.0 80.7
BcMF15c 96.2 96.2 100.0 100.0 100.0 100.0 — 98.8 99.8 80.6
BvMF15 99.1 99.1 95.2 95.1 95.2 95.2 95.2 — 98.9 80.1
OvMF15 96.1 96.1 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 95.1 — 80.7
RsMF15 53.7 53.7 53.1 53.7 53.1 53.1 53.1 52.6 53.7 —
注:表中上三角数据表示核苷酸相似百分比;下三角表示氨基酸相似百分比。
Note:The percent similarities of nucleotide and amino acid are shown in the upper and lower triangles of the Table , respectively.
图 3 基于十字花科植物不同物种 BcMF15
序列构建的 MP系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree based on BcMF15 homologous
sequences in Cruciferae
在637 ～ 675bp 之间 ,且均能推导出完整的氨基酸序
列 , 说明该基因在十字花科中广泛存在。由于
BcMF 15不含内含子 ,对该基因同源序列的比较更容
易推测其功能的变异。对所获得的 10个同源片段进
行序列分析发现它们的核苷酸同源性在 80%以上 ,氨
基酸序列同源性在 53%以上。有越来越多的证据表
明 ,功能上较重要的分子或某一分子较重要的部分 ,其
进化(以突变型替换表示)比那些较不重要的要慢些。
在研究中我们发现LTP在芸薹属内核酸和氨基酸的相
似性较高 ,说明分化后碱基替代事件较少 ,因而有可能
在属内不同物种中执行相近的功能[ 9～ 11] 。同时从序列
结构特征分析结果发现 BcMF15的氨基酸序列在 N端
的跨膜疏水结构域高度保守 ,而在 C端则存在一定程
度的变异 。这说明 BcMF 15在演化过程中在环境选择
压作用下适应性地改变了一些氨基酸的组成或顺序。
虽然在序列上存在差异 ,但都具有 BcMF 15 所特有的
结构特征 。说明该基因在十字花科植物中具有较好的
保守性 ,它可能在十字花科植物的花粉发育中行使着
重要的功能。
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