全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：８９－９５ ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．０１６
王琦，冯二艳，王荣，等．ＲＡＣＥ法克隆甜菜ＮＲ基因及生物信息学分析［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：８９－９５
Ｗａｎｇ Ｑ，Ｆｅｎｇ ＥＹ，Ｗａｎｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＲＡＣＥ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１３，３３（１）：８９－９５
ＲＡＣＥ法克隆甜菜ＮＲ基因及生物信息学分析
王 琦１，２＊，冯二艳３，王 荣４，任嘉红１
（１．长治学院 生物科学与技术系，山西 长治０４６０１１；２．北京师范大学生命科学学院 北京１００８７５；
３．重庆大学 生物工程学院，重庆４０００３０；４．长治卫生学校，山西 长治０４６０００）
摘 要：硝酸还原酶是氮素代谢的关键酶和限速酶，研究硝酸还原酶的功能对提高甜菜的产量具有重要作
用。运用ＲＡＣＥ法克隆出甜菜的硝酸还原酶基因，并利用生物信息学对甜菜ＮＲ进行主要结构分析和功能预
测，并使其在拟南芥中表达，观察根对向重性应答过程中的弯曲情况。结果表明，利用ＲＡＣＥ法克隆得到甜菜
ＮＲ ｃＤＮＡ全长为２ ７６０ｂｐ；甜菜ＮＲ为易溶、亲水性强的蛋白；二级结构预测结果显示，甜菜ＮＲ为混合型蛋白；
甜菜ＮＲ含有钼辅因子、细胞色素ｂ５、ＦＡＤ及ＮＡＤＨ结合域，具有跨膜区域，但不含有信号肽；利用拟南芥突变
体观察到野生型比突变体的弯曲较快，暗示甜菜的ＮＲ基因可能通过调节ＮＯ积累参与植物向重性应答。
关键词：甜菜；生物信息学；硝酸还原酶；ＲＡＣＥ；重力
中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－００８９－０７
＊ ＲＡＣＥ ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ
ＷＡＮＧ Ｑｉ １，２＊，ＦＥＮＧ Ｅｒ－Ｙａｎ３，ＷＡＮＧ Ｒｏｎｇ４，ＲＥＮ Ｊｉａ－Ｈｏｎｇ１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｉ ０４６０１１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７５，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｃｈａｎｇｚｈｉ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｈａｎｇｚｈｉ ０４６０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｎｉ－
ｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ（Ｓｂ）ｙｉｅｌｄｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ＳｂＮＲ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＡＣＥ
ａｎｄ ｉｔｓ ３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ｔｏ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｇｒａｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｆｕｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＳｂＮＲ ｇｅｎｅ ｗａｓ ２７６０ｂｐ；ＳｂＮＲ ｗａｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ
ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳｂＮＲ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｍｉｘｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳｂＮＲ ｗａｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ
ＮＲ ｆａｍｉｌｙ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ，ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ，ＦＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＮＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｉｔ ｈａｄ ｎｏ
ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｂｕｔ ｏｎｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｌａｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒａｖｉｔｙ，
ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ＮＯ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔ’ｓ ｇｒａｖｉｔｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＮＲ）；ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）；ｇｒａｖｉｔｙ
糖用甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）是我国两大糖料作物
之一，在我国北方生产中占有重要地位。但近几十
年来，世界各主要甜菜生产国产量停滞，品质有明显
的下降趋势。因此，提高甜菜的产量和品质，将成为
＊ 收稿日期：２０１２－０３－０１ 修回日期：２０１２－０８－０２
基金项目：国家自然科学基金（３１１００４７１）；长治学院校级课题（２０１２２１）
作者简介：王琦（１９８０－），男，山西长治人，在读博士，讲师，主要从事生物化学、分子生物学等教学与研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｗａｎｇｑｉｗｑ＠１２６．ｃｏｍ。
＊通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）
发展我国糖料作物的一项重要任务。除了作物品种
选育落后之外，不合理供应氮素亦是其主因之一（周
仁喜，１９８６；于海彬等，１９８８；Ｃａｂｏｃｈｅ ＆ Ｒｏｕｚｅ，
１９９０；曲文章等，１９９２；Ｚｈｏｕ ＆ Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓ，１９９６；陈
志英等，２００８）。硝酸还原酶（Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，
ＮＲ）是植物体内硝酸盐同化的关键酶与限速酶，在
氮素代谢中起着重要的作用（宋松泉等，１９９３）。一
氧化氮（ＮＯ）是一种广泛存在于动、植物和微生物
体内的胞内和胞间信使分子（Ｂｅｓｓｏｎ－Ｂａｒｄ ｅｔａｌ．，
２００８），作为一种不稳定的气体自由基，在哺乳动物
细胞中，由ＮＯ合酶催化精氨酸产生。目前关于植
物体内ＮＯ产生的主要途径有两条，其中一条是通
过ＮＲ来产生（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｏｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，
２００５），另一条是直接或间接地通过植物体内Ｌ－精
氨酸途径来产生（Ｐａｒｉｈａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。拟南芥中
关于ＮＲ调控ＮＯ产生及其作为信号分子的研究已
经很多，而关于甜菜ＮＲ对ＮＯ信号的调节目前鲜
有报道。
从多种植物中分离克隆了ＮＲ基因全长或片段
（Ｈｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；王利群等，２００３；Ａｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，
２００７；毛伟华等，２００７；田华等，２００９）。当前，Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ里从高等植物、藻类和真菌中已获得的ＮＲ序
列有６０多个，而且这个数字每年还在增长。针对
ＮＲ基因水平上的研究，主要集中在高等植物和真
菌的研究，而有关甜菜 ＮＲ 基因克隆也鲜有报道。
本文报道了参照ＧｅｎＢａｎｋ上检索到的甜菜ＮＲ基
因ＥＳＴ序列和ＮＲ 基因组ＤＮＡ部分序列来设计
引物，本文创新点在于首次采用 ＲＡＣＥ法克隆了
ＮＲ的全长ｃＤＮＡ序列，并运用生物信息学的手段
对ＮＲ基因及ＮＲ的结构与生理功能进行了预测，
同时在拟南芥中表达，观察根对向重性应答过程中
的弯曲情况。理论意义在于从酶分子的结构上揭示
甜菜硝酸还原酶的调控机理，为后续的基因功能鉴
定和应用提供一些理论参考和依据，进而对甜菜合
理施用氮肥、为提高甜菜产量提供理论依据；实践意
义在于对改善与防止农业施肥中硝酸盐给地下水带
来的严重生态污染有重大意义。
１ 材料和方法
１．１材料
选用甜菜二倍体品种甜研７号（Ｔｙ７）作为试
材。Ｅ．ｃｏｌｉ感受态细胞ＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ）、ｐＭＤ１８－
Ｔ克隆载体（ＴａＫａＲａ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
Ｔａｑ聚合酶（ＴａＫａＲａ）、Ｔ４ＤＮＡ连接酶（ＴａＫａＲａ）、
３′－ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、５′－ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、
ＲＮＡａｓｅ／ＥｃｏＲⅠ／ＰｓｔⅠ／ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨⅠ／ＤｒａⅠ
（ＴａＫａＲａ）、质粒提取 Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ
（ＤＬ２０００，ＤＬ１５０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、转基因受体为拟
南芥野生生态型Ｃｏｌ－０、拟南芥ｎｉａ１ｎｉａ２双突变体、
拟南芥 Ａｔｎｏａ１／ｒｉｆ１突变体、ｐＣａｍｂｉａ１３０２表达载
体（ＴａＫａＲａ）、农杆菌菌株为 ＧＶ３１０１（本实验室保
存）、琼脂糖（Ａｍｅｒｓｃｏ）；引物由南京金斯瑞生物科
技有限公司合成，其它试剂均为分析纯。
１．２方法
１．２．１甜菜总ＲＮＡ的提取及ＲＡＣＥ法克隆目的基
因片段 从Ｇｅｎｂａｎｋ中检索到一段甜菜ＮＲ 基因
的ＥＳＴ 序列（登录号：ＢＩ０９６２９６）和 ＮＲ 基因组
ＤＮＡ的部分序列（登录号：ＡＦ１７３６６４），依据此序列
设计引物，以Ｔｙ７的总ＲＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩
增，得到两个序列Ｐ１和Ｐ２。利用Ｐ１和Ｐ２设计向
外扩增的引物，并且利用ＲＡＣＥ法扩增ＮＲ基因的
５′端序列和３′端序列，将已获得的甜菜 ＮＲ ｃＤＮＡ
序列，采用ＤＮＡＳＴＡＲ ７．０进行序列拼接分析，查
明中间序列有缺失，然后采用引物在线设计程序
Ｐｒｉｍｅｒ ３设计引物，设计出缺失片段的引物，反转录
合成ｃＤＮＡ第一链作为模板，扩增，得到Ｐ３，将已得
到的甜菜 ＮＲ ｃＤＮＡ的序列（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、ｃＤＮＡ ３′
端、ｃＤＮＡ ５′端）进行序列拼接分析，得到拼接序列
全长。
１．２．２基因的克隆与测序 运用Ｐｒｉｍｅｒ ３设计编码
区两端的引物，反转录合成ｃＤＮＡ 第一链作为模
板，扩增，扩增产物与ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ进行１６℃
酒精浴过夜连接反应，转化ＪＭ１０９感受态细胞，蓝
白斑筛选后，挑取阳性重组克隆，提取质粒ＤＮＡ，进
行单、双酶切鉴定，阳性克隆送金思特科技（南京）有
限公司进行测序。
１．２．３生物信息学分析 首先用ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ对基
因序列进行 ＯＲＦ（开放阅读框）分析，再利用 Ｔｏｐ－
Ｐｒｅｄ（徐建华和朱家勇，２００５）、ＡＮＴＨＥＰＯＲＴ（殷志
祥，２００４）等软件分析ＮＲ基因编码蛋白的疏水曲线
与跨膜曲线，Ｃｌｕｓｔａ Ｗ 系统进化树分析（王安娜等，
２０１０），ＧＯＲ４ 法预测二级结构 （Ｇａｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９６；张桂荣，２０１０）；同时，应用 ＮＣＢＩ ＣＤ Ｓｅａｒｃｈ、
Ｓｉｇｎａｌ Ｐ对甜菜ＮＲ基因编码蛋白的功能进行预测
（Ｎａｋａｉ ＆ Ｈｏｒｔｏｎ，１９９９；贺光，２００２；丁忠涛等，
０９ 广 西 植 物 ３３卷
２０１１；徐飞等，２０１１）。
１．２．４植物外源基因表达载体的构建 将回收的基
因片段用公用Ｂｕｆｆｅｒ ３７℃双酶切（ＢｇｌⅡ、ＳｐｅⅠ），
载体为ｐＣａｍｂｉａ１３０２用相同酶切体系进行双酶切。
双酶切后琼脂糖电泳，再回收片段和载体，用ＴａＫａ－
Ｒａ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接过夜。将连接产物加到
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９感受态细胞中，在卡那抗性的培养板
筛选阳性转化子。阳性克隆的菌落摇菌后制备质粒
送金思特科技（南京）有限公司进行测序验证，测序
正确后保存质粒。
１．２．５农杆菌介导的浸花序法转化拟南芥 将构建
好的带ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ抗性基因的载体，加到农杆菌
ＧＶ３１０１感受态细胞，培养２ｄ。挑出单克隆ＰＣＲ
鉴定为阳性转化子后，继续培养并收集菌体。将浸
润培养基对Ｃｏｌ－０、Ａｔｎｏａｌ／ｒｉｆ１和ｎｉａ１ｎｉａ２突变体
拟南芥进行浸花处理，暗培养２４ｈ后恢复正常光
照。人工气候室中正常培养开花结实，当拟南芥种
子成熟后收取种子并在３７℃晾干，待用。将晾干后
的种子灭菌后播于含潮霉素的 ＭＳＯ的平板上，进
行抗性筛选，得到阳性苗后移栽于拟南芥土中生长。
等苗长大即培养约２周后，取叶片提基因组，用
ＰＣＲ进行鉴定阳性苗。
１．２．６重力刺激下拟南芥突变体的表型鉴定 将各
拟南芥种子灭菌，４℃放置４８ｈ后移至培养间２５
℃光照１２ｈ，垂直放置培养一周，再将苗移至新培
养基上，进行重力刺激，即将苗水平放置３、６、９、１２、
２４ｈ，观察根弯曲情况，拍照统计结果。
２ 结果与分析
２．１Ｐ１、Ｐ２的克隆
通过Ｔｙ７叶片中提取的总ＲＮＡ，测定ＯＤ２６０与
ＯＤ２８０的比值大于２．０，说明ＲＮＡ纯度较纯，且检测
提取的ＲＮＡ无降解，亦无蛋白质、苯酚等污染；经
上、下游引物对扩增，分别得到５５０、６２０ｂｐ的甜菜
ＮＲ ｃＤＮＡ的Ｐ１、Ｐ２片段，结果如图１。
２．２ＲＡＣＥ法克隆５′和３′端ｃＤＮＡ
参照５′－ＲＡＣＥ、３′－ＲＡＣＥ Ｋｉｔ，扩增得到ｃＤＮＡ
５′端为７６０ｂｐ和ｃＤＮＡ ３′端为１ ２００ｂｐ，结果如
图２。
２．３Ｐ３的克隆
将之前获得的甜菜 ＮＲ ｃＤＮＡ 的序列，利用
ＤＮＡＳＴＡＲ ７．０进行序列拼接分析，显示出中间序
列有缺失。然后利用引物在线设计程序Ｐｒｉｍｅｒ ３
设计引物，设计出缺失片段的引物，经上、下游引物
对扩增，得到５２０ｂｐ的甜菜ＮＲ ｃＤＮＡ的Ｐ３片段，
结果如图３。
图１ Ｐ１、Ｐ２的ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｐ１，Ｐ２ｂｙ ＰＣＲ
Ａ．Ｐ１的ＰＣＲ电泳图（Ｍ：ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－５：Ｐ１的ＰＣＲ结果）；
Ｂ．Ｐ２的ＰＣＲ电泳图（Ｍ：ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－５：Ｐ２的ＰＣＲ结果）。
图２ ｃＤＮＡ ５′端、３′端克隆的ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．２ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃＤＮＡ
５′，３′ｅｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ＰＣＲ
Ａ．ｃＤＮＡ ５′端克隆的ＰＣＲ电泳图（Ｍ：ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－５：
ｃＤＮＡ ５′端的ＰＣＲ结果）；Ｂ．ｃＤＮＡ ３′端克隆的ＰＣＲ电泳
图（Ｍ：ＤＬ １５０００Ｍａｒｋｅｒ；１－３：ｃＤＮＡ ３′端的ＰＣＲ结果）。
２．４ｃＤＮＡ全长的克隆与酶切鉴定
经上、下游引物对扩增，得到甜菜 ＮＲ的全长
ｃＤＮＡ为２ ９００ｂｐ左右片段，与预期的ＮＲ基因全
长大小相符（图４：Ａ）；将所得的ＰＣＲ产物克隆至
ｐＭＤ１８－Ｔ载体，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，挑取阳性克
隆，提取质粒，酶切鉴定，结果如图４：Ｂ。
２．５生物信息学分析
测序分析表明，ＮＲ 基因全长２ ７６０ｂｐ，采用
ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ分析，得到一条长２ ７１８ｂｐ的完整
１９１期 王琦等：ＲＡＣＥ法克隆甜菜ＮＲ基因及生物信息学分析
图３ Ｐ３的ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．３ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｐ３ｂｙ ＰＣＲ
Ｍ：ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－４：Ｐ３的ＰＣＲ结果。
图４ ｃＤＮＡ全长及酶切鉴定ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．４ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｃＤＮＡ
ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ａ ．ｃＤＮＡ全长的ＰＣＲ电泳图（Ｍ：ＤＬ １５０００Ｍａｒｋｅｒ；１－６：ｃＤＮＡ全
长的ＰＣＲ结果）；Ｂ．ｃＤＮＡ全长的酶切ＰＣＲ电泳图（Ｍ：ＤＬ １５０００
Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰｓｔⅠ单酶切；２：双酶切；３：ＥｃｏＲⅠ单酶切；４：质粒）。
ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）开放读码框（图５：Ａ，箭
头所示），起始密码子位于１４８ｂｐ，终止密码子位于
２ ８６５ｂｐ，推测共编码９０５个氨基酸；利用ＴｏｐＰｒｅｄ
软件分析甜菜ＮＲ疏水曲线，纵坐标表示蛋白质中
残基的亲水／疏水特性，横坐标表示蛋白质中氨基酸
残基的序号，其中正值表示疏水，负值表示亲水，而
疏水性较高的肽段位于蛋白质的内部，否则，亲水性
较高的肽段位于蛋白质分子的表面。从图５：Ｂ结
果显示，ＮＲ为一种亲水性较强的可溶性蛋白质，且
推测此蛋白质含有跨膜肽段。利用ＡＮＴＨＥＰＯＲＴ
软件分析的跨膜曲线更能直观地说明这一点，由图
５：Ｃ中，结果显示Ｃ端确实存在一个跨膜区；应用
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 进行系统进化树分析，分析结果如图５：Ｄ
所示。甜菜 ＮＲ与菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）ＮＲ的
亲缘关系最近，同源性达到８６％，来自于同一个分
枝；其次，甜菜 ＮＲ 与烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉ－
ａｎａ）、马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、玉米
（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌ－
ｇａｒｅ）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、阔
叶椴（Ｔｉｌｉａ ｐｌａｔｙｐａｙｌｌｏｓ）、毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏ－
ｃａｒｐａ）等的 ＮＲ 蛋白有很显著的同源性；采用
ＧＯＲ４算法预测，ＮＲ的二级结构如图５：Ｅ所示，结
果表明，甜菜 ＮＲ的α螺旋（ｈ）：１９８，２１．８８％，β折
叠（ｅ）：２１３，２３．５４％，随机卷曲（ｃ）：４９４，５４．５９％。
利用ＮＣＢＩ的保守域（ＣＤ）预测ＮＲ的结构域，
图５：Ｆ表明甜菜ＮＲ 基因编码蛋白的保守域结构
包括钼辅蛋白结合域，细胞色素ｂ５结合域，ＦＡＤ结
合域及ＮＡＤＨ结合域；用Ｓｉｇｎａｌ Ｐ对ＮＲ进行信号
肽预测，图５：Ｇ可以直观地看出，甜菜 ＮＲ没有信
号肽；利用ＴＭｐｒｅｄ网络服务器对目标蛋白质进行
跨膜区预测，提交 ＮＲ蛋白序列，图５：Ｈ 可以直观
地看出，ＮＲ蛋白存在两个由内向外的跨膜区，一个
由外向内的跨膜区，分别位于２０１～２７９处、７７６～
７９４处和７７８～７９６之间。
２．６植物外源基因表达载体的构建
通过ＰＣＲ扩增得到的条带如图６：Ａ所示，Ｓｂ－
ＮＲ全长为２ ７６０ｂｐ，琼脂糖电泳后胶回收条带，再
琼脂糖电泳确定其大小，连接到ｐＣａｍｂｉａ１３０２上，
转化鉴定确定连接到载体上后送金思特科技（南京）
有限公司测序，测序结果正确。构建好的载体用
ＢｇｌⅡ和ＳｐｅⅠ进行双酶切后的条带大小同从ｃＤ－
ＮＡ模板上扩增出的大小一致，如图６：Ｂ所示。
２．７转基因拟南芥植株的鉴定
将 ｐＣａｍｂｉａ１３０２－ＳｂＮＲ 载体转化到农杆菌
ＧＶ３１０１中，再利用农杆菌浸花序法将目的基因转
到野生型和突变体拟南芥植株中，收获Ｔ０代种子。
对Ｔ０种子用含潮霉素抗性在 ＭＳＯ平板上筛选得
到的阳性苗，培养２周后进行取样提取基因组，用
ＰＣＲ鉴定阳性苗。结果表明能在含潮霉素 ＭＳＯ的
培养基上正常生根的苗均为含转化子的阳性苗。如
图７所示，用 ＨＰＴⅡ基因的短片段引物进行ＰＣＲ
扩增得到正确的大小的基因片段。
用Ｔｉｚｏｌ法提取阳性拟南芥苗的ＲＮＡ，反转录
后做ＰＣＲ，鉴定转化的甜菜硝酸还原酶的ＳｂＮＲ后
２９ 广 西 植 物 ３３卷
的基因表达情况，如图８所示，转化的拟南芥都能表 达外源基因。
２．８拟南芥突变体Ａｔｎｏａ１／ｒｉｆ１、ｎｉａ１ｎｉａ２对重力刺
激应答反应情况
野生型拟南芥苗在随着时间的增加对弯曲的感
应比突变体的较快，向下弯曲程度大，在１２ｈ时最
为明显，如图９所示，随后差异逐渐减小。
３ 讨论
３．１实验材料
大多栽培糖甜菜是高度杂合的多倍体，基因组
成比较复杂。而本文选用的是目前栽培面积比较大
的二倍体纯系甜研７号（Ｔｙ７）为试材，这样不仅可
以适合甜菜基因克隆的需要，同时也具有一定的代
表性。
３．２ＲＡＣＥ法克隆目的基因
ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）技
术是借助ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技术发
展起来的，也是一种高效分离目的基因的方法。
ＲＡＣＥ法可以从低含量转录产物中快速扩增出ｃＤ－
ＮＡ ３′和５′端。近年来，ＲＡＣＥ法的广泛应用显示
出，它是一种迅速、高效地克隆ｃＤＮＡ全长，尤其是
从微量甚至痕量ＲＮＡ克隆ｃＤＮＡ全长的方法。对
ＲＡＣＥ法的创新，伴随着诸如ＰＣＲ扩增效率、忠实
性的提高以及ＰＣＲ产物克隆技术的发展，ＲＡＣＥ法
在目的基因克隆、ＲＮＡ剪接、基因家族和基因表达
变化的研究中起着越来越重要的作用。如果想成功
地扩增出目的基因，ｍＲＮＡ逆转录合成第一条ｃＤ－
ＮＡ链是ＲＡＣＥ法中的关键环节，对于得到ｃＤＮＡ
全长５′端来说更为重要。由于 ｍＲＮＡ逆转录时常
会产生截短的ｃＤＮＡ片段，而截短的ｃＤＮＡ在后续
的反应中会优先扩增，产生大量非特异性产物，本文
选用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅢ反转录酶获得全长ｃＤＮＡ，该酶
能降低ＲＮａｓｅ Ｈ活性，在５０℃时具有全部活性，可
增加使用基因特异引物的特异性。
在ＰＣＲ扩增反应中，反应的特异性必须注意。
为了提高特异性，主要应用热启动ＰＣＲ（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ
ＰＣＲ）技术，即在第一个循环中将一种ＰＣＲ关键成
分（如ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ２＋或引物等）手工加入到已
经在高于Ｔｍ值的温度预热的反应体系中，使得引
物与模板的配对特异性更强，本文利用ＲＡＣＥ法成
功地得到ＮＲ的全长ｃＤＮＡ，再次体现了ＲＡＣＥ法
在克隆新基因上应用的潜力和具有的优越性。
３．３生物信息学分析
预测蛋白质结构的目的在于利用已知的蛋白质
氨基酸序列即一级序列来构建出蛋白质的三维结构
模型，而二级结构的预测准确率一般在５５％～
６５％，然而，当前认为二级结构的预测准确率如果达
到８５％，就可以基本准确地预测一个蛋白质分子的
三维结构。本文利用 ＧＯＲ４算法对甜菜 ＮＲ的二
级结构进行了分析，预测结果表明，ＮＲ为混合型蛋
白（α螺旋占２１．８８％，β折叠占２３．５４％），这为三维
空间结构的预测打下了坚实的理论基础。当前，如
果某种蛋白质的一级结构确定以后，就可以方便地
利用网络服务器对相关数据库进行检索分析，与已
知的蛋白质的氨基酸序列进行比较，通过这一比较，
可以建立一些蛋白的超家族。这样的比较经常可以
获得一些意外的效果，可以发现一些蛋白质含有一
些新的结构域或者模体，并由此揭示一些蛋白质可
能具有的新功能。
３．４ＳｂＮＲ在拟南芥中的表达
将外源基因转入拟南芥中进行表达，从而来研
究该外源基因的某些功能是常见的实验方法。利用
拟南芥ＮＯ相关的突变体Ａｔｎｏａ１／ｒｉｆ１和ｎｉａ１ｎｉａ２
来研究植物 ＮＯ，通过对拟南芥野生型和突变体的
比较来观察表型是对基因功能研究的常用手段。
突变体拟南芥苗对向重性反应的减慢表明：拟
南芥的ｎｉａ１和ｎｉａ２基因可能间接或者直接的参与
植物对重力的应答过程，而突变体Ａｔｎｏａ１／ｒｉｆ１则
表明拟南芥中内源 ＮＯ的含量与植物的向重性有
关。这同硝酸还原酶基因在甜菜中向重性刺激下其
ｍＲＮＡ表达水平的不对称性是具有相似性的，这也
说明了在植物体内ＮＯ对重力刺激的应答模式可能
是一致的。
本文采用ＲＡＣＥ法成功克隆到甜菜ＮＲ 基因
并对ＮＲ生物信息学进行了分析，并利用拟南芥的
体外表达，对其基因功能做了初步研究，但对其特性
分析还有待于进一步研究，以便为后续通过基因工
程方法有效合理施用氮肥，提高甜菜品质与产量提
供依据。
３９１期 王琦等：ＲＡＣＥ法克隆甜菜ＮＲ基因及生物信息学分析
图５ 生物信息学分析
Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
Ａ．ＯＲＦ分析；Ｂ．用ＴｏｐＰｒｅｄ分析ＮＲ的疏水曲线；Ｃ．跨膜曲线分析；Ｄ．系统进化树分析；Ｅ．采用ＧＯＲ４算法预测
的甜菜ＮＲ蛋白二级结构；Ｆ．ＮＲ的保守域；Ｇ．ＮＲ的信号肽预测；Ｈ．Ｔｍｐｒｅｄ预测ＮＲ的跨膜区。
４９ 广 西 植 物 ３３卷
图６ ＳｂＮＲ全长片段与双酶切电泳图
Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＳｂＮＲ ａｎｄ
ｔｈｅ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣａｍｂｉａ１３０２－
ＳｂＮＲ ｂｙ ＢｇｌⅡａｎｄ ＳｐｅⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ａ．ＰＣＲ克隆基因ＳｂＮＲ全长片段；Ｂ．载体双酶切
鉴定；Ｍ：ＤＬ ２０００Ｍａｒｋｅｒ
图７ 阳性转化苗基因组中克隆的
ＨＰＴⅡ片段的电泳结果
Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｂｙ
ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＨＰＴⅡ
图８ 阳性苗的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定结果
Ｆｉｇ．８ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｂｙ
ＲＴ－ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＳｂＮＲ
参考文献：
宋松泉，王永瑞，傅家瑞．１９９３．高等植物中硝酸还原酶的研究
进展［Ｊ］．作物杂志，（４）：３２－３５
周仁喜．１９８６．论甜菜氮代谢及其与糖代谢的关系———甜菜合
图９ 水平放置处理１２ｈ，野生型和突变体根弯曲情况
Ｆｉｇ．９ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＷＴ，ｔｈｅ ＮＯ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ Ａｔｎｏａ１／ｒｉｆ１ａｎｄ
ｎｉ１ｎ ２ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｒｏｏｔ ｇｒａｖｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ＷＴ：野生型拟南芥重力刺激１２ｈ下根尖的弯曲情况（Ｎ＝６７）；Ａｔｎｏ１ｌ／ｒｉｆ１：突变体在重力刺激１２ｈ
下根尖弯曲情况（Ｎ＝６９）；ｎｉａ１ｎｉａ２：突变体在重力刺激１２ｈ下根尖弯曲情况（Ｎ＝３４）。
理施用氮肥的依据［Ｊ］．甜菜糖业，（４）：１２－１４
贺光．２００２．生物信息学在蛋白质研究中的应用［Ｊ］．国外医学．
遗传学分册，２５（３）：１５６－１５８
Ａｍｅｙ ＲＣ，Ａｔｈｅｙ－Ｐｏｌａｒｄ Ａ，Ｍｉｌｓ ＰＲ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎ－
ｇｉｃｏｌａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅ－
ｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７６（６）：７５７－７６８
Ｂｅｓｓｏｎ－Ｂａｒｄ Ａ，Ｐｕｇｉｎ Ａ，Ｗｅｎｄｅｈｅｎｎｅ Ｄ．２００８．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ
ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，５９：２１－３９
Ｃａｂｏｃｈｅ Ｍ，Ｒｏｕｚｅ Ｐ．１９９０．Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：Ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄ
Ｇｅｎｅｔ，６（６）：１８７－１９２
Ｃｈｅｎ ＺＹ（陈志英），Ｍａ ＦＭ（马凤鸣），２００８．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ
ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ（甜菜硝酸还原酶的研究进展）［Ｊ］．
Ｊ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃ Ｕｎｉｖ（东北农业大学学报），３９（７）：１３１－１３５
Ｄｉｎｇ ＺＴ（丁忠涛），Ｚｈａｎｇ Ｒ（张锐），Ｇｕｏ ＳＤ（郭三堆）．２０１１．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｇｅｎｅ ＧｈＤｒ１ｒｅ－
ｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓｅｓ（棉花抗逆相关基因
ＧｈＤｒ１的克隆及生物信息学分析）［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｕｌｌ（生
物技术通报），（１）：１００－１０６
Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．１９９６．ＧＯＲ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃ－
ｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｖｅｒｓｉｏｎ Ⅳ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，
２６６：５４０－５５３
Ｈｙｄｅ ＧＥ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＮＭ，Ｃａｍｐｂｅｌ ＷＨ．１９９１．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ ｓｑｕａｓｈ ＮＡＤＨ：ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ
ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ Ａ ｆａｍｉｌｙ
（下转第１０１页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ １０１）
５９１期 王琦等：ＲＡＣＥ法克隆甜菜ＮＲ基因及生物信息学分析
ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｒｉｃｅ（氮肥运筹对水稻产量及稻米品质的影）［Ｊ］．Ｊ
Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖ（扬州大学学报），２３（３）：４６－５０
Ｊｕ ＸＴ，Ｋｏｕ ＣＬ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌ ｅｎｖｉ－
ｒｏｎｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ ａｎｄ ｍａｎｕｒｅｓ ｔｏ
ｔｗｏ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ
Ｐｌａｉｎ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｐｏｌｌ，４５：４９７－５０６
Ｓｈａｎ ＹＨ（单玉华），Ｗａｎｇ ＹＬ（王余龙），Ｈｕａｎｇ ＪＹ（黄建晔），ｅｔ
ａｌ．２０００．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ａｐｐｌｉｅｄ ａｔ ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｌａｔｅ
ｇｒｏｗｉｎｇ ｓｔａｇｅｓ ｏｎ １５ Ｎ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ（中后期追
施１５ Ｎ对水稻氮素积累与分配的影响）［Ｊ］．Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｇｒｉｃ Ｒｅｓ
（江苏农业研究），２１（４）：１８－２１
Ｓｕ ＸＪ（粟学俊），Ｗｅｉ ＰＸ（韦鹏霄），Ｌｕ ＺＲ（吕志仁）．２００４．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ
ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ－ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ（杂交水稻产
量性状配合力研究）［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ（广西植物），２４（１）：９１－９６
Ｘｕ ＲＬ（许仁良），Ｄａｉ ＱＧ（戴其根），Ｗａｎｇ ＸＱ（王秀芹），ｅｔ ａｌ．２００５．
Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ｎ－ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ，Ｎ－ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｎ－ｆｅｒ－
ｔｉｌｉｚｅｒ ｐｌａｎｎｉｎｇ ｏｎ Ｎ ｕｓｅ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｒｉｃｅ（氮肥施用量、施用时期
及运筹对水稻氮素利用率影响研究）［Ｊ］．Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｇｒｉｃ Ｒｅｓ（江
苏农业科学），（２）：１９－２２
Ｚｈａｎｇ ＸＪ（张学军），Ｚｈａｏ Ｙ（赵营），Ｃｈｅｎ ＸＱ（陈晓群），ｅｔ ａｌ．２０１０．
Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｎ ｓｕｐｐｌｙ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ，Ｎ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ
ｗａｔｅｒ／Ｎ ｕｓｅ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｒｉｃｅ（不同水氮供应对水稻产量、吸氮量
及水氮利用效率的影响）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ Ｂｕｌｌ（中国农业通
报），２６（４）：１２６－１３１
Ｚｈａｎｇ Ｘ（张欣），Ｓｈｉ ＬＬ（施利利），Ｌｉｕ ＸＹ（刘晓宇），ｅｔ ａｌ．２０１０．
Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｎ ｒｉｃｅ ｙｉｅｌｄ，ｇｒａｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ
ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ（不同施肥处理对水稻产量、食味品
质及蛋白质组分的影响）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ Ｂｕｌｌ（中国农学通
报），２６（４）：１０４－１０８
Ｚｈａｎｇ ＭＬ（张满利），Ｃｈｅｎ Ｙ（陈盈），Ｈｏｕ ＳＧ（侯守贵），ｅｔ ａｌ．
２０１０．Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ Ｎ ｕｓｅ ｅｆｉ－
ｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｒｉｃｅ（氮肥运筹对水稻产量和氮肥利用率的影响）［Ｊ］．
Ｃｒｏｐｓ（作物杂志），６：４６－５０
Ｚｅｎｇ ＹＪ（曾勇军），Ｓｈｉ ＱＨ（石庆华），Ｐａｎ ＸＨ（潘晓华），ｅｔ ａｌ．
２００８．Ｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｈｙ－
ｂｒｉｄ ｒｉｃｅ（施氮量对高产早稻氮素利用特征及产量形成的影响）
［Ｊ］．Ａｃｔａ Ａｇｒｏｎ Ｓｉｎ（作物学报），３４（８）：
欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁
１ ４０９－１ ４１６
（上接第９５页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ９５）
ｏｆ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６（３５）：２３ ５４２－２３ ５４７
Ｍａｏ ＷＨ（毛伟华），Ｇｏｎｇ ＹＭ（龚亚明），Ｘｉａ ＸＪ（夏晓剑），ｅｔ
ａｌ．２００７．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
（ＮＲ）ｇｅｎｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｎｉ－
ｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｔｒｅｓｓ（黄瓜硝酸还原酶ｃＤＮＡ片段的克隆
及其在缺氮胁迫下的表达）［Ｊ］．Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃ Ｚｈｅｊｉａｎｇ（浙江
农业学报），１９（３）：１６０－１６３
Ｍｅｙｅｒ Ｃ，Ｌｅａ ＵＳ，Ｐｒｏｖａｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｓ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａ ｍａ－
ｊｏｒ ｐｌａｙｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）ｇａｍｅ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ
Ｒｅｓ，８３：１８１－１８９
Ｍｏｄｏｌｏ ＬＶ，Ａｕｇｕｓｔｏ Ｏ，Ａｌｍｅｉｄａ ＩＭ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｎｉｔｒｉｔｅ ａｓ
ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ，５７９：３ ８１４－３ ８２０
Ｎａｋａｉ Ｋ，Ｈｏｒｔｏｎ Ｐ．１９９９．ＰＳＯＲＴ：ａｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｏｒ－
ｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａ－
ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２４（１）：３４－３６
Ｐａｒｉｈａｒ Ａ，Ｐａｒｉｈａｒ ＭＳ，Ｃｈｅｎ Ｚ，ｅｔ ａｌ．２００８．ｍＡｔＮＯＳ１ｉｎｄｕｃｅｓ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ，８２：１０７７－１０８２
Ｑｕ ＷＺ（曲文章），Ｃｕｉ Ｊ（崔杰），Ｌｉ ＢＳ（李滨胜）．１９９２．Ｔｈｅ
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒｂｅｅｔ Ｙｉｅｌｄ ａｎｄ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ａｐ－
ｐｌｉｅｄ（施氮量与甜菜产量的形成）［Ｊ］．Ｓｕｇａｒ Ｃｒｏｐｓ Ｃｈｉｎ（中
国糖料），（４）：２９－３４
Ｔｉａｎ Ｈ（田华），Ｄｕａｎ ＭＹ（段美洋），Ｗａｎｇ Ｌ（王兰）．２００９．Ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ（植物硝
酸还原酶功能的研究进展）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ Ｂｕｌｌ（中国农
学通报），２５（１０）：９６－９９
Ｗａｎｇ ＡＮ（王安娜），Ｗａｎｇ ＣＣ（王婵婵），Ｗｕ Ｌ（吴蕾），ｅｔ ａｌ．
２０１０．Ｓｏｙｂｅａｎ Ｃ４ Ｈｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ（大
豆Ｃ４ Ｈ基因克隆及生物信息学分析）［Ｊ］．Ｊ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃ
Ｕｎｉｖ（东北农业大学学报），（４）：１２－１６
Ｗａｎｇ ＬＱ（王利群），Ｗａｎｇ Ｙ（王勇），Ｄｏｎｇ Ｙ（董英），ｅｔ ａｌ．２００３．
Ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｂｙ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉ－
ｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ（硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸
还原酶基因的克隆）［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（生物工程学报），
（５）：６３２－６３５
Ｘｕ Ｆ（徐飞），Ｃｈｅｎｇ ＳＲ（成述儒），Ｌｕｏ ＹＺ（罗玉柱）．２０１１．
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ＤＲＢ１ｇｅｎｅ（绵羊ＤＲＢ１基
因生物信息学分析）［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｕｌｌ（生物技术通报），
（１）：１１４－１１７
Ｘｕ ＪＨ（徐建华），Ｚｈｕ ＪＹ（朱家勇）．２００５．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（生物信
息学在蛋白质结构与功能预测中的应用）［Ｊ］．Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｍｅｄ
Ｓｃｉ（医学分子生物学杂志），２（３）：２２７－２３２
Ｙｉｎ ＺＸ（殷志祥），２００４．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（蛋白质结构预测方法的研究进展）［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｅｎ－
ｇｉｎ Ａｐｐｌ（计算机工程与应用），（２０）：５４－５７
Ｙｕ ＨＢ（于海彬），Ｓｕｎ ＬＹ（孙立英），Ｃａｉ Ｂ（蔡葆）．１９８８．Ｓｔｕｄｉｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ
（甜菜糖氮代谢特点的研究）［Ｊ］．Ｓｕｇａｒ Ｃｒｏｐｓ Ｃｈｉｎ（中国糖
料），（４）：１１－１７
Ｚｈａｎｇ ＧＲ（张桂荣）．２０１０．Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ ｇｅｎｅ
ｃｒｙ２ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ（玉米隐花色
素基因ｃｒｙ２的电子克隆及生物信息学分析）［Ｊ］．Ｊ Ａｎｈｕｉ
Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ（安徽农业科学），３８（１９）：９ ９７５－９ ９７８
Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｋｌｅｉｎｈｏｆｓ Ａ．１９９６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃ－
ｔａｓｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ，４２（４）：４３２－４４２
１０１１期 杨彩玲等：不同耕作方式下水稻品种吉优７１６产量及氮素吸收利用对氮肥运筹的响应