全 文 ：核 农 学 报 2011，25(5) :0916 ～ 0921
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)05-0916-06
十字花科植物 C2H2 型锌指蛋白新基因 BcMF20
同源序列克隆与进化分析
韩莹琰1，2 张爱红1 范双喜2 曹家树1
(1. 浙江大学蔬菜研究所，浙江 杭州 310029;2. 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206)
摘 要:为获取 C2H2 型锌指蛋白基因在物种间的分类和进化关系，分析其在基因结构上的保守性，更好
地研究该基因在植物花粉发育中的功能，根据白菜花粉发育相关基因 BcMF20 DNA 序列设计引物，运
用 PCR 技术分别从十字花科芸薹属和萝卜属 18 种材料中克隆了 C2H2 型锌指蛋白基因 BcMF20 的同
源序列。经序列比对分析，BcMF20 同源基因在 DNA 序列上的相似性为 86. 9% ～ 100%，所推导的氨
基酸序列相似性为 77. 6% ～ 100%，在锌指的保守区域，氨基酸序列完全相同。这些结果表明该基因具
有较好的保守性，可能在十字花科植物的花粉发育中行使重要的功能。
关键词:十字花科;C2H2 锌指蛋白;BcMF20;克隆;系统发育
CLONING AND EVOLUTIONARY ANALYSIS OF HOMOLOGOUS SEQUENCES OF
A NOVEL GENE ENCODING C2H2 ZINC FINGER PROTEIN IN CRUCIFERAE
HAN Ying-yan1，2 ZHANG Ai-hong1 FAN Shuang-xi2 CAO Jia-shu1
(1. Institute of Vegetable Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310029;
2. Department of Plant Science and Technology，University of Beijing Agricultural，Beijing 102206)
Abstract:In order to elucidate categorization evolvement of C2H2 zinc finger protein，and clarify mechanism on C2H2
zinc finger protein in pollen development among plants at molecular level，the genes encoding C2H2 zinc finger protein
analogues from 18 species of genera Brassica and Raphanus in Cuciferae were obtained by PCR strategy using specific
primers designed from the full length of BcMF20，a putative gene encoding C2H2 zinc finger protein which was related to
the male sterility． The phylogenetic relationships of these species belonging to the family Cruciferae were investigated
through comparison of the sequences． Homologous sequences of BcMF20 comparison indicated that the similarities
among the genes at nucleotide and amino acid levels were 86. 9% ～ 100% and 77. 6% ～ 100%，respectively． In the
zinc finger regions of homologous sequences，the amino acid sequences were identical． These results showed that the
BcMF20 was relative conservation in evolution in Cruciferae，and BcMF20 may play an important role in pollen
development．
Key words:Cruciferae;C2H2 zinc finger protein;BcMF20;isolated;phylogenic development
收稿日期:2010-01-18 接受日期:2011-02-24
基金项目:国家自然科学基金(30871715) ，浙江省重大科技项目(2010C12004) ，北京市教委科技项目(KM201110020004) ，北京市科技新星项目
(2010B020)
作者简介:韩莹琰(1979-) ，女，陕西延安人，博士，讲师，研究方向为植物基因功能鉴定与调控。Tel:010-80799489;E-mail:hyybac@ 126． com
通讯作者:曹家树(1958-) ，男，湖南芷江人，博士生导师，研究方向为植物基因功能鉴定与调控。Tel:0571-86971188;E-mail:jshcao@ zju． edu． cn
自从在矮牵牛中分离了第一个植物 C2H2 锌指蛋
白基因 ZPT2-1 以来［1］，已经在矮牵牛、拟南芥、小麦、
棉花、水稻等植物中相继分离了近百个植物 C2H2 型
锌指蛋白基因。植物 C2H2 锌指蛋白参与植物各个时
期的生长发育以及环境胁迫下基因的表达调控［2］。
本实验室在前期研究中，成功构建了 3 种共享同
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5 期 十字花科植物 C2H2 型锌指蛋白新基因 BcMF20 同源序列克隆与进化分析
一保持系的白菜 ‘矮脚黄’核不育 ajhGMS 两用系
‘Bcajh97-01A /B’、‘Polima’核质互作不育 polG-CMS
系‘Bcpol97-05A’以及‘Ogura’细胞质不育 oguCMS 系
‘Bcogu97-06A’材料体系，之后，又采用 cDNA-AFLP 和
拟南芥基因芯片表达谱分析 3 种不育系与其保持系花
蕾转录组差异［3］，在此研究过程中，我们发现一条在 3
种不育系花蕾中均下调表达的 C2H2 锌指蛋白新基因
BcMF20( 登录号:HM560966)。该基因最大开放阅读
框为 1359bp，无内含子和外显子，与拟南芥中的同源
基因的相似性为 82%。具有 C2H2 锌指蛋白基因的典
型特征，编码一个 MMB 型的 3 锌指蛋白。时空表达
模式分析发现该基因在可育系 4 ～ 5 级花蕾中具有高
表达;原位杂交信号出现在单核小孢子时期的小孢子
和绒毡层细胞中，在花粉成熟早期的小孢子和绒毡层
细胞中继续表达，说明该基因可能在花粉发育后期与
绒毡层和花粉发育有关［4］。
图 1 18 种十字花科植物材料 BcMF20 同源基因扩增结果
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis for cDNA amplifications of BcMF20 from 18 materials by homology cloning
M:GeneRulerTM100bp ladder 的 DNA 标准分子量。泳道 1 ～ 18 分别表示‘大股子’紫菜薹、‘温州盘菜’芜菁、‘矮抗青’白菜、‘中花’芥蓝、
裂叶水菜、‘马耳头’分蘖菜、‘大头 1’芜菁甘蓝、‘浙 72-1’甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥、‘黄芽 14’大白菜、‘小杂 56’大白菜、板叶水菜、‘浙
桐 1 号’茎瘤芥、黑芥、‘圆白’萝卜、‘樱叶’萝卜、‘雪里蕻’分蘖芥和‘鸡心甘蓝’结球甘蓝。
M:GeneRulerTM100 bp ladder plus M marker． Lane 1 ～ 18 indicated B． campestris ssp． chinensis var． purpurea cv． Daguzi，B． campestris ssp．
raifera cv． Wenzhou-pancai，B． campestris ssp． chinensis var． communis cv． Aikangqing，B． oleracea var． Albograbra cv． Zhonghua，B． campestris
ssp． japonica cv． Chisuzi-kyomizuna，B． campestris ssp． chinensis var． multicep cv． Maertou，B． napus var． napobrassica cv． Datou 1，B． napus cv．
Zhe72-1，B． carinata，B． campestris ssp． pekinensis cv． Huangya 14，B． campestris ssp． pekinensis cv． Xiaoza 56，B． campestris ssp． japonica cv．
Kyoukin，B． juncea var． tumida cv． Zhetong 1，B． nigra，R． sativus cv． Yuanbai，R． sativus cv． SaKura Shimada Kon，B． juncea var． multiceps
cv． Xuelihong and B． oleracea var． capitata cv． Jixin．
为进一步研究该基因结构特征、分子进化特性以
及在植物花粉发育中的作用，本研究以十字花科芸薹
属和萝卜属的植物为材料进行 BcMF20 基因同源序列
克隆与鉴定，在 BcMF20 基因同源序列比对的基础上
构建分子进化树; 探讨不同物种BcMF20 基因的进化
关系，分析基因结构上的保守性以及在不同物种间的
变异，从而了解该基因在十字花科植物中的普遍作用，
为更好的研究该基因的功能奠定理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
所用十字花科芸薹属和萝卜属的 18 份材料( 表
1) 由浙江大学蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室
提供。PCR 试剂盒购自鼎国生物技术有限公司; 限制
性内切酶、Taq DNA 聚合酶和 100bp DNA Ladder 购自
上海生物工程公司;PCR 产物回收试剂盒购自 V-gene
公司;T4 DNA 连接酶和 pGEM-T easy Vector 试剂盒购
自美国 Promega 公司; 大肠杆菌 (Escherichia coli)
DH5α 菌株为本实验室保存。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA 提取 上述 18 份材料分单株取材，在莲
座期取 2 ～ 3 片心叶。在田间用 75% 的酒精擦拭干
净，做好标记后投入液氮固定，然后按曹家树等［5］的
方法提取植物材料的基因组 DNA 并检测。
1. 2. 2 目的基因的 PCR 扩增、克隆和测序 以十字
花科芸薹属和萝卜属 18 个材料的 DNA 为模板，根据
BcMF20 的 DNA 序列设计引物，P5 5-ATG GAG CAG
TTC AAA GAG AGG A -3和 P3 5-TCA CTC ATC AAT
AGG AGC AGG A -3。
PCR 的反应体系为 25μl:cDNA 模板 1μl(10ng·
μL-1) ，10 × PCR 缓冲溶液( 含20mmol·L － 1 Mg2 + )3
μl，10mmol·L － 1 dNTPs 1μl，Taq 酶(5U·μl － 1)0. 5μl，
加 ddH2O 至总体积为 25μl。PCR 程序;94℃预变性
4min，94℃变性 30s，55℃退火 45s，72℃延伸 90s，33 个
循环;72℃延伸 7min，4℃保存。
扩增得到的目的片段经琼脂糖凝胶电泳，回收纯
化，用 T4 连接酶连接到 pGEM-T Easy Vector 上(4℃过
夜) ，转化进大肠杆菌感受态DH 5α 感受态细胞，培养
8h，挑取单菌落，用裂解法提质粒，经限制性内切酶酶
切鉴定后，送上海英俊生物技术有限公司测序。
1. 2. 3 序列差异分析和 系 统 进 化 分 析 使 用
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核 农 学 报 25 卷
表 1 同源基因扩增所用的植物材料
Table 1 Cultivars used in homology cloning
属
genera
种
species
品种
cultivars
基因名称
gene name
芸薹属 普通白菜 矮抗青 BcMF20a
B． campestris ssp． chinensis var． communis Aikangqing
分蘖菜 马耳头 BcMF20m
B． campestris ssp． chinensis var． multicep Maertou
紫菜薹 大股子 BcMF20d
B． campestris ssp． chinensis var． purpurea Daguzi
大白菜 黄芽 14 BcMF20h
B． campestris ssp． pekinensis Huangya 14
小杂 56 BcMF20x
Xiaoza 56
水菜 裂叶水菜 BcMF20c
B． campestris ssp． japonica Chisuzi-kyomizuna
板叶水菜 BcMF20k
Kyoukin
芜菁 温州盘菜 BcMF20w
B． campestris ssp． raifera Wenzhou-pancai
茎瘤芥 浙桐 1 号 BjMF20 z
B． juncea var． tumida Zhetong 1
分蘖芥 雪里蕻 BjMF20x
B． juncea var． multiceps Xuelihong
结球甘蓝 鸡心甘蓝 BoMF20 j
B． oleracea var． capitata Jixin cabbage
芜菁甘蓝 大头 1 BnMF20d
B． napus var． napobrassica Datou 1
甘蓝型油菜 浙 72-1 BnMF20 z
B． napus Zhe72-1
芥蓝 中花 BoMF20 z
B． oleracea var． albograbra Zhonghua
埃塞俄比亚芥 — BcarMF20
B． carinata —
黑芥 — BniMF20
B． nigra —
萝卜属 萝卜 圆白 RsMF20y
R． sativus Yuanbai
樱叶 RsMF20 s
SaKura Shimada Kon
DNAStar 软件中的 MegAlign 程序比较十字花科植物
BcMF20 同源基因 DNA 序列的相似性。使用 ClustalX
软件将 BcMF20 和 18 条同源基因 DNA 序列和推断出
的蛋白质进行同源序列比对，邻接法 (Neighbor-
joining，NJ) 构建系统树。
2 结果与分析
2. 1 BcMF20 同源基因的克隆
利用引物 P5、P3 对十字花科芸薹属和萝卜属的
18 份材料的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，结果在不同
材料中扩增得到的均是单一条带，序列大小基本一致
( 图1)。PCR 产物回收后与 T-easy Vector 连接，转化
大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，单酶切鉴定
后测序。测序得到 BcMF20 同源基因的 DNA 序列，分
别命名，见表 1 中基因名称。扩增所得 DNA 序列全长
在 1275bp ～ 1368bp 之间，均为最大开放阅读框，能推
导出完整的氨基酸序列，起始密码子 ATG，终止密码
子 TGA。均裂叶水菜、甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥、结
球甘蓝中同源基因的长度为 1341bp，芜菁甘蓝和‘圆
白’萝卜中同源基因的长度为 1275bp，‘樱叶’萝卜同
源基因的长度为 1368bp，其余的都与 BcMF20 的长度
一致，为 1359bp。
2. 2 十字花科 BcMF20 同源基因核苷酸序列相似性
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5 期 十字花科植物 C2H2 型锌指蛋白新基因 BcMF20 同源序列克隆与进化分析
图 2 BcMF20 同源基因蛋白质比对
Fig． 2 Alignment of BcMF20 homolog protein
黑体部分为保守序列。
Residues highlighted in black are conserved in all of the sequences depicted．
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运用 Clastal W 软件将上述 18 份材料中扩增获得
的 BcMF20 同源基因与白菜中的 BcMF20 共 19 条同
源基因进行核苷酸序列比对，发现‘大股子’紫菜薹、
‘温州盘菜’芜菁、‘矮抗青’白菜、‘中花’芥蓝、‘马耳
头’分蘖菜、、‘黄芽 14’大白菜、‘小杂 56’大白菜、板
叶水菜、‘浙桐 1 号’茎瘤芥、黑芥、‘雪里蕻’分蘖芥这
12 份材料之间相似性很高。使用 DNAStar 软件中的
MegAlign 程序，对十字花科植物 BcMF20 同源基因
DNA 序列进行核苷酸同源序列比对，发现 BcMF20 同
源基因在 DNA 序列上的相似性为 86. 9% ～ 100%。
这说明不同材料中 BcMF20 同源基因较保守。‘大头
1’芜菁甘蓝与‘圆白’萝卜相似程度较高，为 99. 7%，
‘浙桐 1 号’茎瘤芥与板叶水菜间的相似程度达到了
100%，但与其他材料之间的相似度均在 87%左右。
2. 3 BcMF20 同源基因蛋白质的序列比对
本研究对 BcMF20 所有同源基因编码的蛋白质进
行了比对( 图2) ，结果发现，它们所编码的蛋白质同源
性高达 77. 6% ～ 100%，尽管 19 条基因编码的氨基酸
长度不同，但均为 3 锌指的 C2H2 转录因子，依据
Kubo［6］对锌指结构的分类，这 19 条基因编码的 3 锌
指类型一样，均为 MMB 型。在锌指的保守区域，氨基
酸序列完全相同。
2. 4 BcMF20 同源基因的进化关系
从构建的进化树( 图3) 可见，‘大头 1’芜菁甘蓝
与‘圆白’萝卜、‘樱叶’萝卜聚成一类。裂叶水菜、‘浙
72-1’甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥、‘鸡心甘蓝’结球甘
蓝聚成一类，其余聚成一大类。
3 讨论
对 BcMF20 同源基因进化分析表明，裂叶水菜与
甘蓝型油菜聚为一类，裂叶水菜为 AA 型基因组，甘蓝
型油菜为 AACC 型基因组; 埃塞俄比亚芥与结球甘蓝
聚为一类，埃塞俄比亚芥是 BBCC 型基因组，结球甘蓝
是 CC 型;板叶水菜与‘浙桐 1 号’茎瘤芥聚为一类，板
叶水菜是 AA 型基因组，茎瘤芥是 AABB 型;‘小杂
56’大白菜与‘雪里蕻’分蘖芥聚为一类，‘小杂 56’大
白菜为 AA 型基因组，‘雪里蕻’分蘖芥属于 AABB 型，
这些都完全符合禹氏三角的理论［7］。
植物 C2H2 型锌指蛋白的结构与其他真核生物相
比具有的典型特征是其 α 螺旋区一般都有一个
QALGGH 的高度保守序列，这段保守序列是植物锌指
蛋白所特有的，在已发现的所有动物锌指蛋白中都没
有这一段序列，表明植物 C2H2 锌指蛋白家族可能涉
图 3 十字花科 BcMF20 同源基
因 DNA 序列的分子系统树
Fig． 3 Molecular phylogenetic tree of
BcMF20 homolog in family Cruciferase
及到控制植物所特有的生命过程［2］。在本研究中，19
份不同材料中 BcMF20 同源基因编码的蛋白质尽管氨
基酸长度不同，但均为 3 锌指的 C2H2 转录因子，且锌
指类型一样，均为 MMB 型。在锌指的保守区域，氨基
酸序列完全相同。锌指区域的高度保守性同样暗示了
我们植物 C2H2 锌指蛋白家族对于植物行使某些功能
可能具有重要作用。
另外，十字花科植物种类繁多，并且在器官发育上
存在多态现象，例如，有些发育成肥嫩的花球，有些发
育成硕大的叶球，有些则有膨大的地下肉质根，还有的
以散生的叶片为食用器官等等。由于形态差异大，又
有许多中间过渡类型，因而很难对其中的各类物种进
行细致分类和进化定位。近年来，迅速增加的 DNA 序
列分析为系统发育研究提供了较为客观的证据。本实
验室已对多条基因在十字花科不同物种中进行了同源
序列的分离克隆［8-10］，通过核酸序列的差异比较分析，
研究了基因在不同物种中的进化关系，为十字花科植
物的物种分类提供了一些有价值的分子数据。
4 结论
十字花科芸薹属和萝卜属共 19 份不同材料中
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BcMF20 同源基因较保守，它们在 DNA 序列上的相似
性为 86. 9% ～ 100%，编 码 的 蛋 白 质 同 源 性 高 达
77. 6% ～ 100%，且均编码 MMB 型的 3 锌指 C2H2 锌
指蛋白，在锌指的保守区域，氨基酸序列完全相同。
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( 责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
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