全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７６１－７６７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０１０４１
赵冰,郑茜子,李厚华．秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７６１－７６７
ZhaoB,ZhengXZ,LiHH．GeneticdiversityoffivewildpopulationsofRhododendroncalophytuminQinling,ChinabyISSRanalysis[J]．Guihaia,２０１５,
３５(５):７６１－７６７
秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析
赵　冰∗,郑茜子,李厚华
(西北农林科技大学 风景园林艺术学院,陕西 杨凌７１２１００)
摘　要:美容杜鹃是杜鹃花科杜鹃花属常绿观花植物,也是秦岭地区的特有属,在维持当地生态平衡方面发
挥着重要作用,但目前资源正在遭受严重的破坏.该文通过ISSR分子标记技术对秦岭地区５个美容杜鹃野
生种群进行遗传多样性分析,了解美容杜鹃不同种群的遗传分化,从而为美容杜鹃野生种质资源保护策略的
制定提供理论依据.用８个ISSR引物对５个天然种群的９０个单株进行扩增,共扩增出７８条带(平均每条引
物产生９．７５条带),其中６５条带是多态的,多态位点占总位点的百分率为８３％.种群总的Nei’s基因多样性
指数为０．３３８６,Shannon信息多态性指数为０．４９７２,表明美容杜鹃总的遗传多样性水平较高.种群多态位点
百分率为８２．７１％~９０．２５％,Shannon信息多态性指数为０．４１６１~０．５８６７,Nei’s基因多样性指数为０．３０４４~
０．４１２２,表明美容杜鹃不同种群遗传多样性水平差异较大.其中镇安木王种群和柞水牛背梁种群的遗传多样
性水平较高.AMOVA分析表明种群内的遗传变异(９１．２２％)大于种群间的遗传变异(８．７８％).UPGMA聚
类分析表明５个种群的遗传分化程度与地理距离没有相关性.因此建议尽可能地保护美容杜鹃所有的天然
种群原生境条件,以最大限度保护其遗传变异.由于镇安和柞水种群具有较高的遗传多样性,因此建议优先
对这２个种群实施就地保护和迁地保护.
关键词:美容杜鹃;种质资源;遗传多样性;ISSR
中图分类号:Q９４８．１５　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７６１Ｇ０７
GeneticdiversityoffivewildpopulationsofRhododendron
calophytuminQinling,ChinabyISSRanalysis
ZHAOBing∗,ZHENGXiＧZi,LIHouＧHua
(CollegeofLandscapeArchitectureandArts,NorthwestA&FUniversity,Yangling７１２１００,China)
Abstract:RhododendroncalophytumbelongedtoEricaceaefamily,Rhododendrongenus．Itisanendemicevergreen
plantwithbeautifulflowers,andhashighornamentalvalueandbreedingvalue,whichisalsobeneficialtomaintain
thestabilityoftheecosysteminQinlingMountains．Recently,R．calophytumgermplasmwasendangeredduetohuＧ
manbeing’sexcessiveexcavationactivities．ThegeneticdiversityoffivenaturalpopulationsofR．calophytumin
QinlingMountainwasassessedusinginterＧsimplesequencerepeat(ISSR)markers．And７８bandswereamplified
by８informativeandreliableprimers,ofwhich６５werepolymorphicloci,thepercentageofpolymorphicbandswas
８３％．AsanalyzedbythesoftwarePOPGENE,thegeneticdiversitydiferenceamongpopulationswashighwithPPL
of８２．７１％－９０．２５％,Nei’sgenediversity０．３０４４－０．４１２２andShannon’sInformationIndex０．４１６１－０．５８６７．AnalＧ
ysisofmolecularvariance(AMOVA )revealedthatamongandwithinpopulationgeneticvariationsaccountedfor
收稿日期:２０１４Ｇ１２Ｇ１９　　修回日期:２０１５Ｇ０４Ｇ２６
基金项目:国家自然科学基金(K３０５０２１１１０);陕西省自然科学基金(２０１２JQ３００８);陕西省林业厅项目(陕林计字〔２０１１〕７０号).
作者简介:赵冰(１９８０Ｇ),女,河南驻马店人,博士,讲师,主要从事观赏植物种质资源的教学和科研工作,(EＧmail)bingbing２００３９１５＠１６３．com.
∗通讯作者
８．７８％and９１．２２％ofthetotalgeneticvariation,respectively．UPGMAclusteranalysisbasedonNeiandLigenetic
similaritydidnotformcladescorrespondingtogeographicdistance．Therefore,itissuggestedthataltheoriginal
habitatconditionsofR．calophytumpopulationsshouldbeprotectedasmuchaspossibleinordertoprotectitsgenetic
variation．Inaddition,weshouldtakesomemeasuresofinＧsituandexＧsituconservationtoprotectR．calophytum
populationsinZhen’anandZhashuibecausethesetwopopulationshavemuchhighergeneticdiversity．
Keywords:Rhododendroncalophytum;germplasmresources;geneticdiversity;ISSR
　　美容杜鹃(Rhododendroncalophytum)是杜鹃
花科杜鹃花属常绿灌木.在秦岭山区森林生态系统
中具有非常重要的生态意义,此外美容杜鹃花序硕
大,形态变异丰富,花期较早,具有很高的育种价值,
成为秦岭地区最具引种价值的野生杜鹃花属种质资
源之一.目前,秦岭地区对美容杜鹃资源滥采滥挖
的现象比较严重,美容杜鹃的生境遭到破坏,种群数
量大量减少,因此急需对美容杜鹃资源进行保护.
由于不同物种的遗传结构存在很大的差异,因此只
有首先了解物种的群体遗传学信息,才能对该物种
采取有效的保护策略.Falketal．(１９９１)指出在对
物种实施保护的过程中,遗传学资料对该物种原位
保护地的选择和迁地保护策略的制定具有重要的意
义.所以了解物种的遗传多样性水平和群体的遗传
结构,可为物种保护策略的制定奠定重要的理论
基础.
目前国内对野生美容杜鹃的研究主要集中在组
织培养(罗彭等,２００７)、化学成分分析(田萍等,
２０１０)与栽培管理(李天兴等,２００５;司国臣等,２０１２)
等方面,采用简单重复序列区间扩增多态性(ISSR)
分子标记技术对美容杜鹃遗传多样性和遗传分化的
研究尚未见报道,而ISSR分子标记技术已被开始
应用于对杜鹃花属植物的遗传分化分析(金则新等,
２００６;刘旭颖等,２０１０;赵芯等,２０１０;赵凯等,２０１３)
以及其它观赏植物的遗传多样性分析(冯亮亮等,
２０１１;张玉梅等,２０１２,杨美玲等,２０１２;汪琼等,
２０１３).因此本研究通过ISSR技术对秦岭地区５
个美容杜鹃野生种群进行遗传多样性分析,了解美
容杜鹃不同种群的遗传分化,从而为美容杜鹃野生
种群保护策略的制定奠定理论基础.
１　材料与方法
１．１材料
在秦岭山区选择５个有代表性的美容杜鹃种
群.各种群的地理状况和地理分布位置见表１和图
１.美容杜鹃的形态变异见图２.根据种群的大小,
在５个种群内随机选择１０~２５株个体植株进行采
样,采样时应避免采种株间的亲缘关系较近,一般株
间距离在５０m以上,海拔相差５m以上.选取幼
嫩叶片,装于放有硅胶的自封袋中,尽快带回实验室
放在Ｇ２０℃冰箱中保存备用.
表１　美容杜鹃采样种群的环境因子情况
Table１　Environmentfactorsofcolectionpopulations
ofsamplesofRhodoendrocalophytum
种群
Population
取样数量
Samplesize
海拔
Altitude
(m)
经度
Longitude
(E)
纬度
Latitude
(N)
柞水,牛背梁
Niubeiliang,Zhashui
２５ ２２９９~２５０１ １０８°５９′ ３３°５２′
镇安,木王
Muwang,Zhen’an
２０ １７００~２１８０ １０８°３７′ ３３°２４′
宁陕,平河梁
Pingheliang,Ningshan
１８ １６５０~１８２２ １０８°２９′ ３３°２８′
佛坪,凉风垭
Liangfengya,Fuping
１２ ２２００~２２１８ １０７°５１′ ３３°４１′
周至,黑河
Heihe,Zhouzhi
１５ １９２０~２２５０ １０７°４８′ ３３°５３′
１．２方法
１．２．１基因组DNA的提取　采用植物基因组DNA
试剂盒(离心柱型,DP３０５)提取DNA,试剂盒由北
京天根生化科技有限公司提供.用１．５％的琼脂糖
凝胶电泳检测提取的DNA质量,只有点样孔无杂
质,带型均匀,无拖尾的DNA才可以用于下一步的
PCR扩增;另外用紫外分光光度计(BioＧRADSmＧ
artspecMT３０００)检 测 DNA 浓 度,PCR 使 用 的
DNA浓度要稀释标定到５０ng􀅰μLＧ１.最后把提取
出的符合下一步 PCR 扩增的 DNA 样品储存于
Ｇ２０℃冰箱中保存备用.
１．２．２引物筛选与PCR扩增　引物序列根据加拿大
哥伦比亚大学 UBC公司公布的第九套ISSR引物
序列,所用引物均由沃尔森生物工程技术服务有限
公司合成.该实验从５０个合成引物中筛选出８条
扩增条带清晰、扩增条带较多的引物用于美容杜鹃
５个种群９０个DNA样本的分析(表２).PCR扩增
反应在德国 Eppendorf公司生产的 PCR 仪上进
行,本研究采用的Mix反应体系为２５μL反应体系中
２６７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图１　美容杜鹃样品采集地点示意图
Fig．１　ColectionlocationsofRhodoendrocalophytumsomples
含１μL引物、１μLDNA、１２．５μLTaqmix、１０．５μL
ddH２O.PCR扩增程序:９４℃预变性５min;然后
连续进行４０个循环(９４℃变性４５s,５５℃退火４５
s,７２℃延伸９０s);最后７２℃延伸８min,扩增产物
４℃保存.
１．２．３数据处理　采用“０/１”数据记录扩增产物的琼
脂糖凝胶电泳结果上谱带的位置.同一分子量标准
有带记为１,无带记为０,形成０/１矩阵.采用POPＧ
GENE１．３１(Yehetal．,１９９９)计算各种群的遗传多
样性参数.采用AMOVA１．５５软件进行分子方差
分析.采用NTSYSＧpc２．１(Rohlf,２０００)软件对美
容杜鹃种群进行非加权算术平均聚类分析.
图２　美容杜鹃居群内丰富的形态变异
Fig．２　AbundantflowervariationsofRhododendroncalophytumpopulations
２　结果与分析
２．１引物的筛选和ISSR扩增片段的多态性
ISSR分子标记技术用的是通用型引物,由于有
些引物并不能对DNA样品进行很好的扩增,因此
需要对引物进行筛选,只有那些多态性高和稳定性
好的引物才能进行全部基因组的扩增.该研究用
５０个引物作为初选引物,从中筛选出了８个多态性
高、重复性好且分辨能力强的引物(表２).
用选出的８个引物,分别对５个种群９０个美容
杜鹃个体进行扩增,获得７８条带(平均每条引物产
生９．７５条带),其中６５条带是多态的,多态位点百
分率为８３％(表２).从图３可以看出,不同引物所
获得的电泳图谱带型丰富,片段大小有差异,片段数
从９~１２不等.
２．２种群遗传多样性水平和遗传分化程度分析
多态位点百分率(PPL)、有效等位基因数
(ne)、Shannon信息指数(I)和Nei’s基因多样性指
数(h)是评价某一物种遗传多样性水平高低的重要
指标.从表３可以看出,美容杜鹃５个种群多态位
点百分率有很大的差异,其中镇安木王美容杜鹃种
３６７５期　　　　　　　赵冰等:秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析
表２　对美容杜鹃５个种群９０个个体进行扩增的ISSR引物
Table２　ISSRprimersusedforgeneratingISSRmarkersfrom
９０individualsoffiveRhododendroncalophytumpopulations
引物
Primer
序列
(５′Ｇ３′)
Sequence
统计位
点数
No．ofscored
band
多态位
点数
No．of
polymorphic
band
多态位
点比率
Proporationof
polymorphic
loci(P,％)
８１１ (GA)８C １２ １０ ８３
８１５ (CT)８G ８ ７ ８８
８３５ (AG)８YC １１ ９ ８２
８３６ (AG)８YA ９ ７ ７８
８４１ (GA)８YC １０ ８ ８０
８４３ (CT)８RA ９ ８ ８９
８４４ (CT)８RC １０ ７ ７０
８４５ (CT)８RG ９ ９ １００
７８ ６５ ８３
　R＝(A,G)
群的多态位点百分率为９０．２５％,是５个种群中最高
的;佛坪凉风垭美容杜鹃种群的多态位点百分率为
８２．７１％,是５个种群中最低的.５个种群的多态位
点百分率按从高到低的排序依次为镇安木王种群＞
柞水牛背梁种群＞周至黑河种群＞宁陕平河梁种群
＞佛坪凉风垭种群.５个种群的Nei基因多样性指
数(h)和Shannon信息指数(I)所揭示的美容杜鹃
遗传变异规律基本一致,均是镇安木王种群最高(h
＝０．４１２２,I＝０．５８６７),佛坪凉风垭种群最低(h＝
０．３０４４,I＝０．４１６１).
对美容杜鹃种级水平的ISSR检测表明,多态
带百分率占８９．０６％,Shannon信息指数为０．５２０２,
Nei’s基因多样性指数为０．３６０９.在美容杜鹃种群
水平上,上述指标要低得多,PPL、I和h的分别为
８６．７７％,０．４９７２和０．３３８６(表３).说明对于美容
杜鹃这个物种而言,其遗传多样性主要存在于种群
内部.
对美容杜鹃５个种群进行分子变异方差分析
(表４),结果表明,在秦岭５个美容杜鹃野生种群间
存在一定程度的遗传分化.在美容杜鹃总的遗传变
异中,种群内的变异是９１．２２％,种群间的变异是
８．７８％,说明美容杜鹃的主要变异来自于种群内.
该结论与Shannon信息指数和Nei’s基因多样性指
数所揭示的结果是一致的.
２．３种群间遗传分化的聚类分析
利用POPGEN软件计算Nei’s遗传距离,再根
据遗传距离建立美容杜鹃遗传关系聚类树状图.由
图４可以看出,地理距离相距较远的佛坪种群和镇
安种群首先聚在一起,表明这两个种群的遗传距离
图３　３个引物对镇安木王地区美容杜鹃样品的ISSR扩
增谱带　１Ｇ２０．美容杜鹃单株;AＧC．引物８１１、８３５和８４１.
Fig．３　AFLPfingerprintingpatternsofRhododendron
calophytum samplesin Muwang,Zhenanusingthree
primers　１Ｇ２０．Rhododendroncalophytum plant;AＧC．Primer
８１１,８３５and８４１．
最近;镇安种群和宁陕种群的地理距离较近,但在聚
类图上并没有首先聚在一起,说明２个种群的遗传
距离较远,说明美容杜鹃种群间的遗传距离与种群
间的地理距离不相关,该结论与秀雅杜鹃的研究结
论一致(赵冰等,２０１２).
３　讨论与结论
３．１美容杜鹃种质资源的遗传多样性和遗传分化
遗传多样性是物种长期进化的结果,是种群生
存和发展的前提.在评价种群遗传多样性的参数
中,多态位点百分率、Nei基因多样性指数和
Shannon信息指数是衡量种群遗传多样性的主要指
标.该研究利用ISSR技术分析表明,５个美容杜鹃
４６７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
表３　美容杜鹃５个种群的遗传多样性水平
Table３　GeneticdiversityamongfiveRhododendroncalophytumpopulationsinQinling
种群Population
观测等位基因数
na
有效等位基因数
ne
Nei’s(１９７３)基因
多样性h
Shannon信息
指数I
多态位点百分率
PPL(％)
柞水,牛背梁Niubeiliang,Zhashui １．９００２ １．７５３３ ０．３３６４ ０．５４２８ ８８．６４
镇安,木王 Muwang,Zhen’an １．９５６４ １．８２５０ ０．４１２２ ０．５８６７ ９０．２５
宁陕,平河梁Pingheliang,Ningshan １．８２５４ １．７００９ ０．３１９１ ０．４４７０ ８５．０４
佛坪,凉风垭Liangfengya,Fuping １．７９６３ １．６３３４ ０．３０４４ ０．４１６１ ８２．７１
周至,黑河 Heihe,Zhouzhi １．８７１８ １．７４８０ ０．３２０９ ０．４９３５ ８７．２２
种群水平Populationlevel １．８７００ １．７３２０ ０．３３８６ ０．４９７２ ８６．７７
物种水平Specieslevel １．９２０１ １．８０４７ ０．３６０９ ０．５２０２ ８９．０６
　Note:na＝Observednumberofaleles;ne＝Effectivenumberofaleles(１９６４);h＝Nei’s(１９７３)genediversity;I＝Shannon’sInformationindex(１９７２);PPL
＝Percentageofpolymorphicloci．
表４　美容杜鹃种群分子变异的方差分析
Table４　Varianceanalysisofmolecularvariance(AMOVA)ofRhododendroncalophytumpopulations
变异来源
Sourceofvariation
自由度
df
平方和
SS
均方
MS
方差分量
Variancecomponent
方差分量百分率 (％)
Percentageof
variancecomponent
显著性检测
PＧvalue
种群间Amongpopulations ４ ２．１７６３ ０．５４４１ ０．０５２２ ８．７８
种群内 Withinpopulation ８９ ９．４５２５ ０．１０６２ ０．２８７７ ９１．２２
＜０．００１
图４　美容杜鹃５个种群间的Nei遗传距离聚类分析图
Fig．４　DendrogramoffiveRhododendroncalophytum
populationsbasedonNei’sgeneticdistance
种群的各遗传多样性参数的变化趋势一致,均是镇
安木王种群最大,佛坪凉风垭种群最小.由于镇安
木王美容杜鹃的分布面积远远大于佛坪凉风垭,因
此推测这可能与种群的地理分布范围的大小有关.
一个物种的地理分布区域较小时,近交频繁,从而使
该物种遗传多样性水平偏低.如宁陕和佛坪的美容
杜鹃分布面积小,单株数量少,故遗传多样性水平偏
低.而对于地理分布区域比较大的种群,无论是昆
虫传粉还是风媒传粉都比较困难,基因交流受阻碍,
种群内产生分化,使其遗传多样性水平偏高.如镇
安美容杜鹃的分布面积最大,所以其具有较高的遗
传多样性水平.
本研究中,５个美容杜鹃种群的总多态位点百
分率为８６．７７％,Shannon信息指数为０．４９７２,
Nei’s基因多样性指数为０．３３８６,与同科不同属的
其它植物如云锦杜鹃(金则新等,２００６)(PPL 为
８８．２４％、I为０．４３１７、h为０．２８４８)的遗传多样性
水平较接近,但远远高于鹿角杜鹃(赵芯等,２０１０)
(PPL 为６４．３５％,I为０．４６４０,h为０．３０９９)的遗
传多样性,说明美容杜鹃种群具有较高的遗传多样
性水平.美容杜鹃种群具有较高的遗传多样性与其
本身生物学特性有关.Hamricketal．(１９８１)指出,
遗传变异比较高的植物多为寿命长、地理分布广和
结实性高的物种.美容杜鹃是秦岭山区为数不多的
广布种,寿命比较长,结实率很高,在林下常有大量
的幼苗出现,所以表现出较高的遗传多样性.
不同物种在种群内和种群间的遗传分化差异很
大.AMOVA分子变异分析显示,美容杜鹃的遗传
变异８．７８％存在于居群间,说明种群间已产生较大
程度的分化.种群间遗传分化的产生主要与种群间
的基因交流受到限制有关.居群间遗传分化的产生
主要与居群间的基因交流受到限制有关.基因流是
促使群体遗传分化的主要因素之一,在植物中,花
粉、种子的扩散和传播是基因流的两种主要形式(李
建辉等,２００７).调查中发现,美容杜鹃生长海拔较
高,花期较早,主要集中在３月份,此时可供传粉的
昆虫的种类和数量有限,因此多依靠风媒传粉,而由
于５个居群间的空间距离较远,使花粉的传播受到
５６７５期　　　　　　　赵冰等:秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析
了很大的阻碍,限制了种内居群间的随机交配,使得
基因交流变得困难,近交程度加深,因此导致种群间
遗传分化的出现(Weleretal．,１９９６).因此,美容
杜鹃由于种群隔离而产生的基因流受阻是种群间遗
传分化的重要原因.
POPGENE分析表明,美容杜鹃物种水平的多
态位点百分率和Shannon信息指数均高于种群水
平,表明美容杜鹃遗传多样性主要存在于种群内部.
AMOVA分析也表明美容杜鹃种群内的遗传变异
大于种群间.Chappeletal．(２００７)研究发现美国７
种落叶杜鹃花的遗传变异也主要发生在种群内.因
此,从园林植物育种的观点考虑,从同一种群内部选
择单株进行杂交可能会比从不同地理区域选择单株
杂交得到更高的等位基因多样性.
UPGMA聚类结果表明美容杜鹃５个种群间
的遗传分化与它们间的地理距离不相关.而一些物
种如珙桐(张玉梅等,２０１２)和长叶榧(李建辉,２００６)
的研究表明它们种群间的遗传分化和地理距离有一
定的相关性.
３．２美容杜鹃种质资源的保护和利用
遗传多样性是物种适应外界环境变化的进化潜
力基础,遗传多样性丢失将大大降低个体的适应度
和物种对环境变化的适应能力(Frankhametal．,
２００２).美容杜鹃物种和种群都维持较高水平遗传
多样性,种群间产生较大遗传分化,表明美容杜鹃物
种具有较大的进化潜力.
人类活动所导致的生境恶化甚至丧失,使原来
高水平遗传多样性的大种群隔离为若干个范围狭小
的小种群;小种群会导致遗传漂移,这是其它许多濒
危物种的 致濒因素(Erikssonetal．,１９９５).由于
物种在生境遭到破坏和片段化后,种群间的基因交
流受到阻碍而引起种群的分化,进而失去进化的潜
力.据此,建议尽可能地保护美容杜鹃所有的天然
种群原生境条件,禁止滥砍滥挖,以保护尽可能多的
遗传变异.美容杜鹃变异丰富,观赏价值较高,抗寒
抗旱性强,具有重要的育种价值.因此保护好美容
杜鹃野生种质资源,对于改良现有杜鹃花的观赏特
性和抗逆能力从而进行杜鹃花新品种的选育具有重
要的意义.本研究的结果表明镇安和柞水美容杜鹃
种群的遗传多样性水平较高,因此建议优先就地保
护,同时也要采取移栽小植株、扦插或者播种的方法
对其进行一定的迁地保护.建议在迁地保护时,应
当从所有种群采集样本,创造种群间植株迁移、种
子和幼苗交换的条件,尽可能多地保存该物种的遗
传资源.
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７６７５期　　　　　　　赵冰等:秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析