全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Apr． 2015，35(2):231 － 238 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 11931 /guihaia． gxzw201311029
韩兴杰，徐玲玲，廖亮，等． 茶树 HMG-CoA还原酶基因全长 cDNA克隆及序列分析［J］． 广西植物，2015，35(2):231 －238
Han XJ，Xu LL，Liao L，et al． Cloning and sequence analysis of HMG-CoA reductase full-length cDNA from tea (Camellia sinensis)［J］． Guihaia，2015，35
(2):231 －238
茶树 HMG-CoA还原酶基因全长 cDNA克隆及序列分析
韩兴杰1，徐玲玲1* ，廖 亮1，李同建1，邓辉胜1，樊启水2，徐小青3
(1． 九江学院 生命科学学院，江西 九江 332000;2． 江西修水茶叶科学研究所，
江西 修水 332400;3． 九江市湖口县三里林场，江西 湖口 332500 )
摘 要:香气是茶叶的重要品质之一，萜类物质不仅香气好，而且沸点普遍较高，是构成茶叶香气的重要物质
基础，决定着茶叶的香气品质，也可作为茶叶香型划分的依据。在植物中，倍半萜、多萜醇等通过胞质中的甲
瓦龙酸(MVA)途径合成。HMG-CoA还原酶(HMGＲ)催化 HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A)生成
甲瓦龙酸，是依赖 MVA萜类合成途径的关键限速反应。为了有助于理解茶树萜类合成的分子遗传机制，通过
ＲACE-PCＲ方法从茶树中克隆了一个编码 HMG-CoA还原酶的 cDNA全长序列(命名为 CsHMGＲ1)，该序列由
1 979 bp组成，包含一个 1 722 bp的完整开放阅读框，编码 573个氨基酸。其推定的编码蛋白与橡胶树、旱莲
木、人参、荔枝、西洋参、丹参、罗汉果及龙眼的同源蛋白具有 80% ～ 82%的序列一致性。利用 CsHMGＲ1 和其
它物种 HMGＲ同源蛋白的催化区域构建系统发育树，表明其属于真核生物 I类 HMGＲ家族。结构分析表明，
CsHMGＲ1 含有两个跨膜区，推测其与其它真核生物同源蛋白类似地定位于内质网上;含有两个 HMG-CoA 结
合位点、两个 NADPH结合位点、四个保守的催化活性残基及一个磷酸化位点，说明磷酸化 /去磷酸化很可能也
是其活性调节的重要方式。表达分析表明，CsHMGＲ1在“大叶龙”叶芽、母株叶芽及花芽都有较强的表达。其
表达调控及生理活性对茶叶品质可能有重要影响，并在其功能解析的基础上，有可能作为茶叶品质鉴定及育
种的一个依据。
关键词:茶树;HMG-CoA还原酶;HMGＲ;基因克隆;序列分析
中图分类号:S571． 1;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)02-0231-08
Cloning and sequence analysis of HMG-CoA reductase
full-length cDNA from tea (Camellia sinensis)
HAN Xing-Jie1，XU Ling-Ling1*，LIAO Liang1，LI Tong-Jian1，
DENG Hui-Sheng1，FAN Qi-Shui2，XU Xiao-Qing3
(1． College of Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China;2． Xiushui Tea Ｒesearch Institute of
Jiangxi，Xiushui 332400，China;3． Sanli Forest Farm of Hukou County，Hukou 332500，China )
Abstract:Aroma is an important character of tea，and terpenoids，with preferable fragrance and relatively high boiling
point，are substantial substances contributing to tea aroma，which not only determine the aroma quality of tea，but also
provide a classification basis of scent types． In plants，sesquiterpenes and dolichol and so forth are synthesize via the cy-
toplasmic mevalonate-dependent pathway． The enzyme HMG-CoA reductase (HMGＲ)catalyzes the conversion of 3-hy-
droxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA)to mevalonate，which is the committed step in the synthesis of isopre-
收稿日期:2014-05-27 修回日期:2014-07-25
基金项目:江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ10620)
作者简介:韩兴杰(1977-)，男，黑龙江齐齐哈尔市人，博士，主要从事植物分子生物学与基因工程研究，(E-mail)hanxjie@ foxmail． com。
* 通讯作者:徐玲玲，教授，研究方向为植物分子生物学，(E-mail)lingl239@ 163． com。
noids via the MVA pathway． To help understand the molecular and genetic mechanisms underlying terpenoid synthesis of
tea，a full-length cDNA encoding HMGＲ was cloned from tea (Camellia sinensis (L．)O． Kuntze)by using the ＲACE-
PCＲ technique (designated as CsHMGＲ1)． It comprised 1 979 bp，with a 1 722 bp intact open reading frame encoding
a 573-amino-acid protein． The deduced protein showed 80% to 82% similarities to homologs from rubber tree (Hevea
brasiliensis)，common camptotheca fruit (Camptotheca acuminate)，ginseng (Panax ginseng)，litchis (Litchi chinensis)，
American ginseng (Panax quinquefolius)，rooted salvia (Salvia miltiorrhiza)，Momordica grosvenori (Siraitia grosveno-
rii)，and longan (Dimocarpus longan)． The phylogenetic tree，constructed with the catalytic domained of CsHMGＲ1 and
homologs from other species，indicated that CsHMGＲ1 belonged to the eukaryotic class I HMGＲ family． CsHMGＲ1 con-
sisted of two transmembrane domains，implying that it may be localized to endoplasmic reticulum(EＲ)similarly to other
eukaryotic homologs． It also contained two HMG-CoA binding sites，two NADP(H)-binding sites，four conserved catalyt-
ic active residues and a phosphorylation site，indicating that phosphorylation /dephosphorylation is likely a crucial mode
of regulation of its biochemical activity． Tissue expression analysis indicated that CsHMGＲ1 was expressed comparatively
in the leaf buds of C． sinensis cv． Dayelong and in both leaf buds and floral buds of the mother plants． The regulation of
expression and physiological activity of CsHMGＲ1 are likely to impact greatly on tea quality，and CsHMGＲ1 may provide
a basis of the quality evaluation and breeding of tea given that its function is further resolved．
Key words:Camellia sinensis;HMG-CoA reductase;HMGＲ;gene cloning;sequence analysis
萜类(terpenoids)或称类异戊二烯(isopre-
noids)，广泛分布于植物、动物、微生物等体内。植
物界中的萜类组成了植物天然化合物中最大的一
类，结构及生理作用复杂多样，具有重要的应用及经
济价值，如单萜和倍半萜是挥发油的主要组分，紫杉
醇、青蒿素、银杏萜内酯等具有很高的药用价值
(Ｒodríguez-Concepción et al．，2002;Grochowski et
al．，2006;Zhang et al．，2007;Zhou et al．，2009)。尽
管萜类存在结构上的多样性，但生物合成都来源于
异戊烯基焦磷(isopentenyl diphosphate，IPP)及其异
构体 3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(3，3-dimethylallyl
diphosphate，DMAPP)。在植物体内，合成这两种中
心化合物通过两种途径:发生在胞质中的甲瓦龙酸
(mevalonic acid，MVA)途径以及发生在质体中的甲
基赤藓醇 4-磷酸途径(methylerythritol 4-phosphate，
MEP)途径(Ｒodríguez-Concepción et al．，2002;Gro-
chowski et al．，2006;Ｒohmer，2007)。HMG-CoA 还
原酶(HMG-CoA reductase，HMGＲ)催化 3-羟基-3-甲
基戊二酸单酰辅酶 A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-
CoA，HMG-CoA)生成甲瓦龙酸，是 MVA 途径的关
键限速反应(Ｒodríguez-Concepción et al．，2002;Ｒo-
hmer，2007)。
香气是茶叶的重要品质之一。萜类物质不仅香
气好，而且沸点普遍较高，是构成茶叶香气的重要物
质基础。萜类的组成决定着茶叶的香气品质，也可
作为茶叶香型划分的依据。单萜及倍半萜大都带有
浓郁的甜香、花香和木香，是各类茶的主要香气成分
(Zhang et al．，2000;Yu et al．，2008;He et al．，
2012)。近年来，对萜类化合物及其生物合成途径
的研究不断深入，通过关键基因克隆利用基因工程
手段选择性地调控萜类代谢途径，改变萜类的含量
及组成，可从根本上改良植物性状和品质(Ma et
al．，2006;He et al．，2012)。本研究通过 ＲACE-PCＲ
技术从茶树中克隆了一个编码 HMG-CoA 还原酶
(HMGＲ)的 cDNA 全长序列，对它及其编码蛋白的
序列和结构特征进行了分析，并讨论了其在植物中
的作用。茶树 HMG-CoA 还原酶基因的克隆，为研
究其在萜类合成中的功能提供了基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
茶树(Camellia sinensis)材料取自江西省修水茶
叶科学研究所，大叶龙品系源自 1 株不开花无蕾芽
突变体，通过无性繁殖得到的后代(Xu et al．，
2009)。2010 年 9 月采集大叶龙叶芽、母株花芽及
叶芽，立即放入液氮中，带回实验室后保存于-80 ℃
冰箱;基因克隆完成于 2011 年 3 月。
1． 2 方法
1． 2． 1 茶树总 ＲNA 的提取 使用通用植物总 ＲNA
提取试剂盒(ＲP3301，百泰克生物技术公司，北京)，
具体试验步骤按照产品使用说明书进行。
1． 2． 2 5-ＲACE 获得 5-末端 cDNA 序列 5-ＲACE
的引物设计和试验依照 SMAＲTer ＲACE cDNA Am-
3422 期 韩兴杰等:茶树 HMG-CoA还原酶基因全长 cDNA克隆及序列分析
plification Kit(Cat． No． 634923，Clontech)进行。逆
转录反应以茶树总 ＲNA为模板，使用 5-ＲACE CDS
Primer A为引物，并在 5-末端添加接头 SMAＲTer II
A Oligonucleotide，再以逆转录 cDNA 产物为模板进
行 PCＲ 扩 增，基 因 特 异 引 物 为 GSP1:5-
GGCGAGACGTGGATGGGCATTGAA G-3。
1． 2． 3 3-ＲACE 获得 3-末端 cDNA 序列 利用 5-
ＲACE得到的 HMGＲ 序列设计特异引物，3-ＲACE
试验使用 Clontech SMAＲTer ＲACE cDNA Amplifica-
tion Kit进行。以茶树总 ＲNA为模板，3-ＲACE CDS
Primer A为引物进行逆转录反应。以逆转录 cDNA
产物为模板，利用套式 PCＲ 进行 3-末端扩增，基因
特异引物为 GSP2:5-TAAGAGGGCGGCGGCGAT-
ACGGAGGG-3(第一轮)和 NGSP2:5-AATGGCTG-
GTGCTCTTGGTGGCTTCA-3(第二轮)。
利用 5-ＲACE和 3-ＲACE得到的序列，通过一
对引物扩增 cDNA 全长，上游引物:5-GGTCGGAT-
TCCGGCTAAAA-3，下游引物:5-CATCATACGCT-
TCGTGACCACT-3。以上得到的 PCＲ 产物通过琼
脂糖凝胶分析，目的条带用 SanPrep 柱式 DNA 胶回
收试剂盒(Cat． SK8132，上海生工公司)进行回收纯
化，连接到 pUCm-T载体(上海生工公司)，测序工作
由上海生工公司进行。
1． 2． 4 序列分析及系统进化树的构建 对不同克隆
测序得到的结果，用 Vector NTI的子程序 Contig Ex-
press进行序列拼接，用 cDNA 序列及其编码的蛋白
序列与 NCBI 数据库中的其它物种同源序列进行
BLAST分析。蛋白序列对齐用 Clustalx 2． 0 软件;系
统发育树的构建用 MEGA 5． 2 软件的最小进化法，
并进行 Bootstrap检测(抽样次数为 1 000)。蛋白质
序列跨膜区预测用 TMPred(http:/ / ch． embnet． org /
software /TMPＲED_ form． html)和 TMHMM(http:/ /
www． cbs． dtu． dk /services /TMHMM/)。蛋白质空间
结构使用 Phyres2 线串法进行同源建模(Kelley et
al．，2009)，使用 3DLigandSite 进行配体结合位点分
析(Wass et al．，2010)。
1． 2． 5 基因表达分析 茶树总 ＲNA 使用 DNase I
(2270A，宝生物工程公司)消化处理，以去除可能存
在的 DNA 污染。以 oligo(dT)为引物，使用 Ｒever-
tAid试剂盒(#K1621，Fermentas)进行 cDNA 第一链
的合成，并用一对特异引物进行 ＲT-PCＲ 基因表达
分析，上游引物:5-CTGACAACGGTGGACGATGAA-
3，下游引物:5-GCTGGCTTCTTATCCGAGCAA-3。
2 结果与分析
2． 1 茶树 HMGＲ基因全长 cDNA克隆
以茶树叶芽提取的总 ＲNA 为模板，通过 5-
ＲACE得到的 DNA片段经过测序，获得片段长度为
1 479 bp的 DNA 序列(不包括接头引物，下同)(图
1)。与 NCBI数据库中的序列进行比对，该片段与
其它物种 HMGＲ 基因的序列相似性为 76% ～ 89%;
其编码的氨基酸序列与其它物种 HMGＲ 蛋白的序
列相似性为 71% ～80%，由此可以确定获得的该序
列片段属于茶树中的 HMGＲ 基因。利用获得的 5-
末端基因片段设计引物，通过 3-ＲACE，获得长度为
407 bp 的 HMGＲ 基因 3-末端 cDNA 片段(图 1)。
将 5-ＲACE及 3-ＲACE 得到的序列进行拼接，得到
茶树中 HMGＲ 基因完整的 cDNA 序列，并用特异引
物对其全长进行了克隆(图 1)。
该 cDNA序列由 1 979 bp 组成，其 5-cDNA 末
端序列第一个碱基是 G，符合真核生物基因转录一
般从嘌呤(主要是 A，也可能是 G)起始的特点，5-
UTＲ(非翻译区)的长度为 135 bp;包含一个 1 722
bp的开放阅读框，编码 573 个氨基酸，在近氨基末
端存在 2 个跨膜区域;3-UTＲ 的长度为 122 bp，尾
部包含一段 poly(A)结构，其紧邻的上游碱基是 C，
符合植物 poly(A)位点(YA，Y = T或 C)的特征(图
2)。将该 cDNA 命名为 CsHMGＲ1(GenBank 基因登
录号:KF649853)。
2． 2 氨基酸序列比对及结构分析
CsHMGＲ1 氨基酸序列与 NCBI 数据库序列进
行比对，与橡胶树 (Hevea brasiliensis)、旱莲木
(Camptotheca acuminata)、人参(Panax ginseng)、荔
枝(Litchi chinensis)、西洋参(Panax quinquefolius)、丹
参(Salvia miltiorrhiza)、罗汉果(Siraitia grosvenorii)、
龙眼(Dimocarpus longan)的同源蛋白具有 80% ～82%
的序列一致性，这说明 CsHMGＲ1属于植物 HMGＲs家
族。CsHMGＲ1的氨基酸序列包含两个 HMG-CoA结合
位点(EMPVGFVQIP 和 TTEGCLVA)、两个 NADP(H)
结合位点(DAMGMNM和 GTVGGGT)、四个
442 广 西 植 物 35 卷
图 1 茶树 HMGＲ1基因全长 cDNA克隆 1． 5-ＲACE;2． 3-ＲACE;3． 基因全长;M． DNA分子质量标准。
Fig． 1 Cloning of the full-length cDNA of HMGＲ1 from tea
1，2，3． represent 5-，3-ＲACE fragments and the full length gene，respectively;M． DNA ladders．
图 2 茶树 HMGＲ1 cDNA序列及其推定编码的氨基酸序列 横线上的位置表示该两段氨基酸序列为跨膜区。
Fig． 2 Sequence of HMGＲ1 cDNA from tea and the deduced amino acid sequence
Two transmembrane (TM)regions in the amino acid sequence are underlined．
5422 期 韩兴杰等:茶树 HMG-CoA还原酶基因全长 cDNA克隆及序列分析
图 3 茶树 HMGＲ1与其它植物 HMGＲ蛋白的多序列对齐 TM． 跨膜区;↓催化活性位点;磷酸化位点(丝氨酸，S)。序列来
源分别为 KF649853(茶树)，ACV65036(人参)，ABF56518(荔枝)，AAB69727(旱莲木)，AAU08214(橡胶)，ACD37361(丹参)。
Fig． 3 Multiple alignment of CsHMGＲ1 with other plant HMGＲs TM． transmembrane region;↓ Catalytic active sites; Phosphoryla-
tion site (serine，S)． Sequences are as follows:KF649853 (C． sinensis)，ACV65036 (P． ginseng)，ABF56518 (L． chinensis)，AAB69727 (C． acumi-
nate)，AAU08214 (H． brasiliensis)，ACD37361 (S． miltiorrhiza)．
氨基酸残基(E、K、D、H)的催化位点和一个丝氨酸
(S)磷酸化位点(图 3)。这些结构具有高度的保守
性，在其它物种中也存在类似序列(Bochar et al．，
1999;Istvan et al．，2000a;Friesen et al．，2004;Kuzuy-
ama et al．，2010;Dai et al．，2011)。
使用 Phyres2 线串法对 CsHMGＲ1 蛋白质进行
空间结构建模，并使用 3DLigandSite 进行配体结合
位点分析。在 CsHMGＲ1 的三级结构中，包含多个
α-螺旋和 β-折叠结构，配体结合位点位于三维结构
中部的凹陷处(图 4)。
642 广 西 植 物 35 卷
图 4 茶树 HMGＲ1蛋白序列三维空间结构预测 A． 蛋白折叠结构(内示二级结构域);B． 蛋白质与配体(箭头所示)的结合。
Fig． 4 Predicted three-dimensional structure of the CsHMGＲ1 protein A． Dimensional folding configurations，
wherein the secondary level structures are shown;B． Binding of the protein and ligands (arrowed)．
2． 3 HMGＲ蛋白家族系统发育分析
HMGＲs是广泛存在于原核生物(细菌、古菌)
和生物真核(真菌、植物、昆虫、哺乳动物)中的家族
(Bochar et al．，1999;Istvan et al．，2000a;Friesen et
al．，2004;Kuzuyama et al．，2010)。利用 CsHMGＲ1
和其它物种 HMGＲ 同源蛋白的催化区域构建系统
发育树，茶树 CsHMGＲ1 和其它种植物 HMGＲ 蛋白
聚类在一起，和动物、真菌的 HMGＲ 蛋白同属于 I
类(Class I)HMGＲs，而细菌和古生菌的 HMGＲ蛋白
同时分布于 I类和 II类(Class II)HMGＲs中(图 5)。
2． 4 CsHMGＲ1 的表达分析
以茶树肌动蛋白(Actin)基因为内参进行定量，
通过 ＲT-PCＲ 对 CsHMGＲ1 进行组织表达分析。结
果表明，CsHMGＲ1 在“大叶龙”叶芽、母株叶芽及花
芽中均有较高水平的表达(图 6)。
3 讨论与结论
根据 HMGＲs 催化活性区域序列特征，存在两
种具有明显区别的类型。I 类(Class I)主要分布于
真核生物，也存在于一些古生菌及细菌中;II 类
(Class II)只存在于原核生物中(Bochar et al．，
1999;Friesen et al．，2004;Kuzuyama et al．，2010)。
真核生物的 HMGＲs在 N-端含有 2 ～ 8 个跨膜区，以
同源四聚体的形式定位于内质网上发挥作用;尽管
在 N-端区域存在较大变异，但在 C-端(催化活性区
域)十分保守。而原核生物 HMGＲs 不含有跨膜区，
是可溶性蛋白，以同源二聚体的方式行使功能(Ｒoi-
telman et al．，1992;Istvan et al．，2001;Kuzuyama et
al．，2010)。茶树 CsHMGＲ1 属于 I类的植物 HMGＲ
家族，在它们的 N-端序列差异较大，而 C-端十分保
守。在 CsHMGＲ1 的 N-端含有两个跨膜区，推测其
与其它真核生物同源蛋白类似地定位于内质网上。
I类 HMGＲ以 NADPH 作为辅酶，而 II 类 HMGＲ 既
有利用 NADPH作为辅酶，也存在同时可以 NADPH
及 NADH作为辅酶的情况(Kuzuyama et al．，2010)。
结构分析表明，位于 CsHMGＲ1 的 C-端催化区域含
有两个 NADPH结合位点。磷酸化(失活)和去磷酸
化(激活)是真核 HMGＲs 催化活性调节的普遍特
征，磷酸化的丝氨酸位点精确地位于催化活性组氨
酸位点 C-末端一侧的第六个残基位置(Goldstein et
al．，1990;Istvan et al．，2000b)。在 CsHMGＲ1 组氨
酸催化位点后的第六个残基位置为丝氨酸，推测为
磷酸化位点，磷酸化 /去磷酸化很可能也是其活性调
节的重要方式。
在植物萜类物质的生物合成途径中，倍半萜、多
萜醇、植物甾醇、油菜素内酯、细胞分裂素及蛋白质
的异戊烯化通过胞质中的 MVA 途径，泛醌由胞质
中合成的 IPP前体输入到线粒体中合成(Ｒodríguez-
Concepción et al．，2002)。由此可见，作为依赖 MVA
萜类合成途径的关键基因，茶树 CsHMGＲ1 在植物生
长发育调节、维持细胞功能及信号转导等过程中可
能具有重要作用。挥发性倍半萜是构成茶叶香气
(香型)的重要物质基础，茶树 CsHMGＲ1 可能参与
这些呈香物质的合成。表达分析表明，CsHMGＲ1 在
“大叶龙”叶芽、母株叶芽与花芽中均有较高水平的
表达。其表达调控及生理活性对茶叶品质可能有重
要影响，并在其功能解析的基础上，有可能作为茶叶
7422 期 韩兴杰等:茶树 HMG-CoA还原酶基因全长 cDNA克隆及序列分析
图 5 茶树 HMGＲ1与其它物种 HMGＲ同源蛋白的系统发育树 ●植物，○真菌，■动物，◆古生菌，□细菌。
Fig． 5 Phylogenetic tree constructed with CsHMGＲ1 and homologous proteins ●Plant，○Fungi，■Animal，◆Archaea，□Bacteria．
品质鉴定及育种的一个依据。
单萜和倍半萜的合成及其上游的代谢反应，多
是调控挥发性萜类物质合成的研究对象。研究表
明，可通过改变萜类代谢途径关键基因的表达而改
变植物的代谢流，从而改变植物的遗传性状、萜类代
谢产物的产量及组成(Ma et al．，2006;He et al．，
2012)。
本研究克隆了茶树 CsHMGＲ1 基因的 cDNA 全
长序列，有助于对茶树萜类合成代谢途径的研究。
其在茶树中的生理功能及对茶叶品质的作用，值得
进一步深入研究。
842 广 西 植 物 35 卷
图 6 CsHMGＲ1的组织表达分析
1． 大叶龙叶芽;2． 母株叶芽;3． 母株花芽。
Fig． 6 Tissue expression analysis of CsHMGＲ1
1． Leaf buds of C． sinensis cv． Dayelong;2，3． Leaf buds and
floral buds of mother plants，respectively．
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