全 文 ：书广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ Ｆｅｂ．２０１５，３５（１）：８４－９１ ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．１１９３１／ｇｕｉｈａｉａ．ｇｘｚｗ２０１４０５００９
李小平，曾庆发，张根生，等．大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 负调控植物叶片衰老进程［Ｊ］．广西植物，２０１５，３５（１）：８４－９１
Ｌｉ ＸＰ，Ｚｅｎｇ ＱＦ，Ｚｈａｎｇ ＧＳ，ｅｔ ａｌ．ＧｍＭＩＲ１６０Ａ，ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１５，
３５（１）：８４－９１
大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
负调控植物叶片衰老进程
李小平＊，曾庆发，张根生，赵 娟
（淮北师范大学 生命科学学院 资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北２３５０００）
摘 要：叶片衰老是受内外多种因子影响的遗传发育进程。生长素、细胞分裂素和乙烯等多种植物激素是调
控叶片衰老的重要内部因子，它们通过长或短距离运输形成叶片组织内特定的区域分布和浓度梯度，从而直
接或间接参与植物叶片衰老过程。分子遗传学表明，细胞分裂素和乙烯分别是叶片衰老的抑制子和正调节
子，而生长素如何参与叶片衰老的分子机制目前还不清晰。植物体内成熟小分子ＲＮＡ由小ＲＮＡ基因转录
并通过特定酶加工形成的２１～２３ｂｐ的双链ＲＮＡ分子。这些小分子通过不完全配对方式抑制其靶基因转录
和／或表达，参与植物生长发育多个过程，然而这类小ＲＮＡ分子如何调控植物叶片衰老发育过程目前则还鲜
有报告。大豆是重要的油料作物，具有典型的单次结实性衰老特征。研究大豆叶片衰老具有重要的科学意义
和深远的应用价值。该文采用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技术分析大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ基因Ｇｍ－
ＭＩＲ１６０Ａ 的表达模式，发现大豆第一复叶中ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 表达受外源生长素和黑暗处理的诱导，暗示该基
因是生长素快速响应的叶片衰老相关基因。为进一步探究ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在大豆叶片发育中的功能，构建了
肾上腺皮质激素（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ，ＧＲ）类似物地塞米松（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）诱导表达ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 双元表
达载体并通过农杆菌介导的子叶节方法转化野生型大豆。通过抗性筛选和基因组ＰＣＲ鉴定并结合表型分
析，共获得了４株诱导表达的稳定遗传转基因植株（株系ＯＸ－３、ＯＸ－５、ＯＸ－７和ＯＸ－８）。ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达
植株根、茎、叶、花和果实在形态学上与野生型相比无显著差异，但叶片的叶绿素含量增加、最大光量子效率
（Ｆｖ／Ｆｍ）增强。进一步分子分析发现，转基因大豆叶片中ＧｍＡＲＦｓ和衰老标记基因（ＧｍＣＹＳＰ１）表达明显下
降，表明大豆Ｇｍａ－ｍｉＲ１６０通过抑制靶基因ＧｍＡＲＦｓ的表达来负调控植物叶片的衰老进程。该文揭示了生
长素通过小分子ＲＮＡ调控叶片发育一条新途径，为研究植物激素调控植物叶片衰老提供了新的思路。
关键词：大豆；ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ；生长素响应因子；过表达
中图分类号：Ｑ９４５．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１５）０１－００８４－０８
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ，ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ，
ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
ＬＩ Ｘｉａｏ－Ｐｉｎｇ＊，ＺＥＮＧ Ｑｉｎｇ－Ｆａ，ＺＨＡＮＧ Ｇｅｎ－Ｓｈｅｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｕａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｕａｉｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｉｂｅｉ ２３５０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ａｎｄ／ｏｒ ｅｘｔｅｒｉｏｒ ｆａｃ－
ｔｏｒｓ．Ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ａｎｄ ａｕｘｉｎ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｏｒ ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓ ｐｉｖｏｔａｌ
收稿日期：２０１４－０７－０２ 修回日期：２０１４－１１－２５
基金项目：国家自然科学基金（３０９７０２４５）；安徽省教育厅基金（ｋｊ２００７Ｂ１１０）；安徽省优秀青年教师基金（２００７ｊｑ１１６１）。
作者简介：李小平（１９７２－），男，江苏南京人，博士，副教授，研究方向为植物分子生物学，（Ｅ－ｍａｉｌ）１２４４２３２０７４＠ｑｑ．ｃｏｍ。
＊通讯作者
ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｙ ｌｏｎｇ ａｎｄ／ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．
Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｔｕｄｙ ｈａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｗｏｒｋ ａｓ ａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ａｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａ－
ｔｏｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｇｕ－
ｌａｔｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｓ ｌａｒｇｅｌｙ ｕｎｋｎｏｗｎ．Ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｒｅ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｓｍａｌ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ２１－２３ｂｐ ｌｅｎｇｔｈ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｆｉｒｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｒｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｔｈｅｓｅ ｓｍａｌ ＲＮＡｓ ａｒｅ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍａｎｙ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓ－
ｓｅｓ ｂｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ａｎ ｉｎａｃｃｕｒａｃｙ ｍａｎｎｅｒ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲ－
ＮＡ ｃｏｕｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｌａｎｔ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｏ ｆａｒ．Ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓ ａ ｂｏｔｈ ｏｉｌ ｃｒｏｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｅｅｄ－ｓｅｔｔｉｎｇ ｄｅ－
ｐｅｎｄｅｎｔ ａｇｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｏ ｕｎｃｏｖｅｒ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｈｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒ－
ｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｔ，ｗｅ ｕｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓ－
ｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐ－
ｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｆｏｌｉａｇｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｖｅｓ．Ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｗａｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ ｂｏｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｐｐｌｉｅｄ ａｕｘｉｎ ａｎｄ ｄａｒｋｎｅｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｂｏｔｈ ａｎ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ａｕｘｉｎ－
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ．Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｌｉｋｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ，
ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（ＤＥＸ），ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉ－
ａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｎｏｄｅ ａｓ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｒｄｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓｃｒｅｅｎ，ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｗｅ ｆｉｎａｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｏｕｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ（Ｌｉｎｅ
ＯＸ－３，５，７ａｎｄ ８）ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｔ－ＤＮＡ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｒｏｏｔｓ，ｓｔｅｍ，ｌｅａｖｅｓ，
ｆｌｏｗｅｒｓ，ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｂｕｔ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｍａｘｉｍｕｍ ｑｕａｎｔｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
（Ｆｖ／Ｆｍ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｆｏｌｉａｇｅ ｌｅａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｓｔａｇｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ＧｍＡＲＦｓ ａｎｄ ＧｍＣＹＳＰ１，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ
ｆｏｒｍｅｒ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｉｓ ｔｈｏｕｇｈｔ ａｓ ａ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ，ｗｅｒｅ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｒａ－
ｍａｔｉｃａｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｒｉｆｏｌｉａｇｅ ｌｅａｖｅｓ．Ｔａｋｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｇｍａ－ｍｉＲ１６０ｍｉｇｈｔ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ
ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ．Ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｔ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ
ｈｏｒｍｏｎｅ ａｕｘｉｎ ｃｏｕｌｄ ｍｏｄｉｆｙ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲ－
ＮＡ ｇｅｎｅ Ｇｍａ－ｍｉＲ１６０ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ＧｍＡＲＦｓ ａｎｄ ａｌｓｏ
ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｎｅｗ ｃｌｕｅｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｈｏｗ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ；ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒｓ；ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
叶片衰老是遗传程序控制的主动发育进程。叶
片衰老进程中，有些基因转录水平显著下降，称为衰
老下 调 基 因 （ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ，
ＳＤＧＳ），如编码与光合作用有关的多数蛋白质基
因；另一些基因是被衰老诱导表达的基因，称衰老相
关基因（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ，ＳＡＧＳ），这类
基因参与了新蛋白质的合成。多种植物激素直接影
响或参与调控叶片衰老进程（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；
Ｂｕｃｈａｎａｎ－Ｗｏｌａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｒａａｆｆ ｅｔ
ａｌ．，２００６）。乙烯通过其细胞信号组分如ＥＩＮ３来正
调控叶片衰老（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）；细胞分裂素通过受
体ＡＨＫ３／ＡＨＫ４和相应的下游磷酸化途径抑制植
物叶片的衰老（Ｋｉｍｅｔ ａｌ．，２００６）。另外，细胞分裂
素还与类受体蛋白激酶形成调控网络参与调节叶片
衰老过程（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。生长素如何参与调控植
物叶片衰老过程中的作用机制目前不很清晰，尤其
是作为正调节子的证据还不够。虽然发现生长素响
应因子ＡｔＡＲＦ２功能缺失影响叶片衰老进程（Ｅｌｉｓ
ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌｉｍｅｔ ａｌ．，２０１０），但生长素如何通过
其细胞信号组分参与到叶片衰老的调控还有待进一
步阐明。
在植物组织中，生长素通过长、短距离运输形成
组织器官组织中的特定浓度梯度，从而调控在植物
生长发育（Ｌｅｙｓｅｒ，２００６；Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
生长素受体（ＴＩＲ１）、转录因子（Ａｕｘ／ＩＡＡ）、生长素
响应 因 子 （ＡＲＦｓ）和 具 有 生 长 素 响 应 元 件
（ＡｕｘＲＥｓ，ＴＧＴＣＮＣ）的下游靶基因等组成生长素
细胞信号转导的核心组分（Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００１；
Ｋｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。当生长
素含量很低时，Ａｕｘ／ＩＡＡ与 ＡＲＦｓ结合，阻遏了下
５８１期 李小平等：大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 负调控植物叶片衰老进程
游靶基因的转录；当生长素的含量达到一定程度，生
长素就会起到分子胶的作用，使Ａｕｘ／ＩＡＡ与ＴＩＲ１
结合在一起，形成ＳＣＦＴＩＲ１－生长素－Ａｕｘ／ＩＡＡ 复合
体，促使 Ａｕｘ／ＩＡＡ 降解，从而解除 Ａｕｘ／ＩＡＡ 对
ＡＲＦｓ的抑制，释放下来的 ＡＲＦｓ与下游具有
ＡｕｘＲＥ的靶基因结合，发挥生长素的调控功能
（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＡＲＦｓ除受
Ａｕｘ／ＩＡＡ调节外，其转录产物还受到转录后水平的
ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ的调控。ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ依靠序列不完全
配对方式寻找靶基因并进而抑制它们的活性（Ｖｏｉｎ－
ｎｅｔ，２００９；Ｓｕｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｎｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，
２０１０）。拟南芥基因组含有３个小ＲＮＡ基因（Ａｔ－
ＭＩＲ１６０Ａ－Ｃ），它 们 编 码 的 成 熟 小 ＲＮＡ（Ａｔｈ－
ｍｉＲ１６０）和 靶 基 因 ＡｔＡＲＦ１０，ＡｔＡＲＦ１６ 和
ＡｔＡＲＦ１７在特定的器官组织中发挥重要的调节功
能。修饰靶基因ＡｔＡＲＦ１０，ＡｔＡＲＦ１６和ＡｔＡＲＦ１７
的作用位点会导致靶基因转录本降解受阻及Ａｔ－
ＭＩＲ１６０ｓ的表达下调，并造成明显的发育障碍（Ｌｉｕ
ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，
２００５），暗示在植物组织中Ａｔｈ－ｍｉＲ１６０和靶基因之
间互为精确调控并维持一定平衡。在拟南芥中过表
达ＡｔＡＲＦ１０／１６／１７无明显的表型，推测是拟南芥
细胞中表达有足够的Ａｔｈ－ｍｉＲ１６０来维持对靶基因
的抑制（（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７），而对其它物种是否也存
在这种现象还不是很清楚。本文以大豆叶片为研究
材料，探究Ｇｍａ－ｍｉＲ１６０及其靶基因是否在叶片衰
老中发挥调控功能。在分析ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在叶片
衰老及生长素诱导中的表达特征基础上，我们通过
农杆菌介导转化方法获得ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达转
基因大豆并对转基因植株叶片衰老表型进行分析。
研究叶片衰老的分子机制对进一步的分子遗传育种
具有理论指导意义。
１ 材料与方法
１．１供试材料
１．１．１菌种、质粒及培养基 菌种Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；农
杆菌ＬＢ４４０４；植物表达载体ｐＴＡＭ１，由本实验室
提供。大肠杆菌培养：ＬＢ培养基；农杆菌培养：
ＹＥＰ培养基。
１．１．２试剂与酶 常规ＰＣＲ试剂和限制性内切酶购
自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ标准分子量购自全式金公
司；高保真 ＫＯＤ酶购自上海东洋坊公司；ＲＮＡ提
取试剂盒为 Ｓｙｓｔｅｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ和 Ｑｉａｇｅｎ 公司，
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司。高纯质
粒小量提取试剂盒，购自威格拉斯生物技术公司，其
它试剂均为上海生工产品。
１．１．３引物 根据ｈｔｔｐ：／／ｄｉａｎａ．ｉｍｉｓ．ａｔｈｅｎａ－ｉｎｎｏｖａ－
ｔｉｏｎ．ｇｒ／和ｈｔｔｐ：／／ｓｏｙｂａｓｅ．ｏｒｇ／提供ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
和靶基因（ＧｍＡＲＦｓ）序列并结合ＮＣＢＩ数据库相应
ＥＳＴ，设计各定量 ＰＣＲ和相应载体构建引物（表
１）。ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－ＯＸ Ｆ／Ｒ是用于构建化学诱导过
表达载体。
１．２方法
１．２．１大豆栽培和叶片处理 所试大豆种植在混合
土壤中（泥炭土∶珍珠岩∶蛭石＝３∶３∶１）中，于人
工培养室中培养（１６ｈ白天／８ｈ夜晚；光照２５０
μｍｏｌ·ｍ－
２·ｓ－１；温度：２３～２５℃；相对湿度：７０％）。
叶片自然衰老：取营养生长期（Ｖ１）至生殖生长期
（Ｒ５）最先出现的完全展开第一复叶（Ｆｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，
１９７１），进行定量ＰＣＲ；离体叶片衰老处理：选取完
全展开的第一复叶（２０ｄ），放入加有蒸馏水的培养
皿中，确保复叶叶柄与水充分接触，然后用锡箔纸包
裹培养皿，放在恒温培养箱中进行黑暗处理，在不同
时间间隔取出叶片（０，３，６和９ｄ），提取总ＲＮＡ并
分析。转基因植株基因表达（Ｔ３代）：选取完全展开
的第一复叶（２０ｄ），提取总ＲＮＡ并进行定量ＰＣＲ。
外源生长素处理：一定浓度的生长素ＩＢＡ（１μｍｏｌ·
Ｌ－１）喷在完全展开的第一复叶上（２０ｄ），每隔５ｍｉｎ
取下叶片，提取总 ＲＮＡ并分析。所有试验进行至
少３次生物学重复。
１．２．２ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 定量ＰＣＲ ＲＮＡ提取和反转
录按Ｓｙｓｔｅｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ的ＱｕａｎｔｉＭｉｒ ＲＴ Ｋｉｔ操作
手册进行，首先对小ＲＮＡ３’端添加腺苷酸形成多聚
腺苷酸末端（ＰｏｌｙＡ），然后添加寡聚脱氧胸腺嘧啶
接头，最后反转录形成ｃＤＮＡ。反转录产物利用通
用引物和小ＲＮＡ特异引物的进行定量ＰＣＲ，荧光
定量 ＰＣＲ 试剂盒为 Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
ＴａｑＴＭＩＩ（ＤＲＲ０８１Ａ），相 应 引 物 见 表 １。Ｇｍ－
ＭＩＲ１５６ｂ为内参基因（Ｋｕｌｃｈｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。按
以下反应体系进行：２ｘＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭＩＩ（ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ ＭｇＣＩ２、ｄＮＴＰ ｍｉｘ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄＵＴＰ）１５μＬ；上游
引物Ｆ １μＬ，下游引物 Ｒ １μＬ；ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ２
μＬ。总体为３０μＬ。定量 ＰＣＲ仪扩增反应条件
设置：５ ０℃２ｍｉｎ；９ ５℃１ ０ｍｉｎ；９ ５℃１ ５ｓ～６ ０℃
６８ 广 西 植 物 ３５卷
表１ 本文所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列 （５′－３′）Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
应用
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｑＧｍＭＩＲ１６０Ａ ＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＡ ＭｉｒｃｏＲＮＡ，ＲＴ
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－ａｄａｐｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ Ｍｉｒｃｏ ＲＮＡ，ＲＴ
ｑＧｍＡＲＦ１０－Ｆ１ ＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１６３ｂｐ
ｑＧｍＡＲＦ１０－Ｒ１ ＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＣＧＴＧ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１６３ｂｐ
ｑＧｍＡＲＦ１６－Ｆ ＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＡＡＡＧＡＧ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１２１ｂｐ
ｑＧｍＡＲＦ１６－Ｒ ＧＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＣ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１２１ｂｐ
ｑＧｍＡＲＦ１７－Ｆ ＣＣＧＴＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧＴ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１０９ｂｐ
ｑＧｍＡＲＦ１７－Ｒ ＴＣＣＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＣ ｑＲＴ－ＰＣＲ，１０９ｂｐ
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－ＯＸ－Ｆ ＣＡＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＣＴ Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－ＯＸ－Ｒ ＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴ Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－ＩＦ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－ＩＲ ＣＴＴＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｑＧｍＣＹＳＰ１－Ｆ ＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＴ ｑＲＴ－ＰＣＲ
ｑＧｍＣＹＳＰ１－Ｒ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＣＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ
ｑＭＩＲ１５６ｂ ＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＣＡ Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｑＡＣＴ２／７－Ｆ ＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡ ＣＣＴＴＣＣＡＡ Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｑＡＣＴ２／７－Ｒ ＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡ ＣＡＣＴＣＣＡＴ Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
图１ 化学诱导基因表达载体Ｔ－ＤＮＡ结构 编码转录因子ＧＶＧ 的ＤＮＡ片段插入至３５Ｓ启动子和终止子之间。ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
片段通过内切酶ＳｐｅＩ和Ｘｈｏ插入到６×ＧＡＬ４启动子和终止子之间。ＨＰＴ．潮霉素；ＬＢ．左边界；ＲＢ．右边界。
Ｆｉｇ．１ Ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ Ｔ－ＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＧＶＧｗｅｒｅ ｐｌａｃｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｐＴＭ－１ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ＳｐｅＩ ａｎｄ ＸｈｏＩ ａｎｄ ｗａｓ ｐｒｅｃｅｄｅｄ ｂｙ ａｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｓｉｘ ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＡＬ４．ＨＰＴ．Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ；ＬＢ．Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ；ＲＢ．Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ．
６０ｓ～７２℃３０ｓ（４０个循环）；７２℃１０ｍｉｎ。用
２－ △△Ｃｔ法计算相对表达量。
１．２．３ ＧｍＡＲＦｓ和ＧｍＣＹＳＰ１定量ＰＣＲ 取对应叶
片，按 Ｑｉａｇｅｎ公司专门提取 ＲＮＡ 的试剂盒进行
（ＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ），反转录产物的荧光定量
ＰＣＲ试剂盒为 Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭＩＩ
（ＤＲＲ０８１Ａ）。ＡＣＴ２／７为定量的内标基因，扩增片
段长度为１１９ｂｐ。ＧｍＣＹＳＰ１是大豆叶片衰老标记
基因，扩增片段长度为１６２ｂｐ。ＧｍＭＩＲ１６０调控
１２个靶基因（ＧｍＡＲＦｓ）的转录，选择三个ＧｍＡＲＦｓ
（ＧｍＡＲＦ１０／Ｇｍ１３ｇ ４００３０．１， ＧｍＡＲＦ１６／
Ｇｍ１０ｇ０６０８０．２，ＧｍＡＲＦ１７／Ｇｍ０４ｇ４３３５０．１）来分
析ＧｍＭＩＲ１６０过表达是否引起靶基因的抑制表
达。ＧｍＡＲＦｓ和ＧｍＣＹＳＰ１表达量相对于大豆内
标基因ＡＣＴ２／７，用２－ △△Ｃｔ法计算相对表达量。
１．２．４化学诱导型载体构建 利用高保真的 ＫＯＤ
酶，以大豆基因组为模板，扩增１ １６２ｂｐ的ＰＣＲ片
段，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 的前体序列位于该扩增片段的中
心位置（Ｌａｕｆｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。在ＰＣＲ产物两端引入
ＳｐｅＩ和 ＸｈｏＩ位点，双酶切 ＰＣＲ 产物后导入到
ｐＴＡＭ１载体对应的克隆位点（图１）。
１．２．５农杆菌转化 取鉴定成功的双元载体１～２
μＬ用电击转化法转化农杆菌感受态细胞ＬＢ ４４０４
（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，２．５ｋｖ／ｕｍ／ｍｓ）。转化后的农杆菌重悬
于１ｍＬ ＹＥＰ培养基中，２８℃，转速为２００×ｇ·
ｍｉｎ－１，培养２～３ｈ，取５０～１００μＬ涂在具有卡那霉
素和壮观霉素（ＳｐｅｃＲ）双抗ＹＥＰ培养基上，２８℃倒
置培养２～３ｄ。挑选已分散开的单克隆，经菌裂解
ＰＣＲ鉴定稳定表达的阳性克隆，用于大豆转化。
１．２．６大豆转化和转基因鉴定 以科丰３４品种大豆
为材料，采用子叶节法进行转化，转化过程按文献并
加以调整（Ｓｃｈｍｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｐａｚ ｅｔ ａｌ．，２００４；
７８１期 李小平等：大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 负调控植物叶片衰老进程
Ｐａｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）。各转化培养基的成分：（１）萌发
培养基（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ｂａｓｅ ｓａｌｔ，Ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｍｇ·
Ｌ－１，ｐＨ ５．８，Ａｇａｒ ６．５ｇ·Ｌ－１）；（２）共培养培养基：
（１／１０ Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ ｂａｓｅ ｓａｌｔ，Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ ５
Ｖｉｔａｍｉｎ，ＭＥＳ ３．９ｇ·Ｌ－１，Ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ·Ｌ－１，ＢＡＰ
１．８ｍｇ·Ｌ－１，ＧＡ３ ０．２ｍｇ·Ｌ－１，ＡＳ ０．１ｇ·Ｌ－１，
ＤＴＴ ２００ｍｇ·Ｌ－１，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ４００ｍｇ·Ｌ－１ ｐＨ ５．２，
Ａｇａｒ ４．５ｇ·Ｌ－１）；（３）芽诱导培养基（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５
ｂａｓｅ ｓａｌｔ，Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５Ｖｉｔａｍｉｎ，ＭＥＳ １．２ｇ·Ｌ－１，
Ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ·Ｌ－１，ＢＡＰ １．８ｍｇ·Ｌ－１，Ｃｅｆ ２００ｍｇ·
Ｌ－１，Ｃａｒｂ ５００ｍｇ·Ｌ－１，Ｈｙｇ ２５～５０ｍｇ·Ｌ－１ ｐＨ
５．４，Ｐｈｙｔａｇｅｌ ３．０ｇ·Ｌ－１）；（４）生 根 培 养 基
（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ｂａｓｅ ｓａｌｔ，Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ Ｖｉｔａｍｉｎ，
ＭＥＳ １．２ｇ·Ｌ－１，Ｓｕｃｒｏｓｅ ３０ｇ·Ｌ－１，ＩＡＡ ｌ ｍｇ·
Ｌ－１，ｐＨ５．８，Ａｇａｒ ６．５ｇ·Ｌ－１）。大豆筛选抗生素为
潮霉素，筛选过程辅助以头孢霉素来去除残留农杆
菌。抗性筛选成功的转基因小苗（Ｔ０）经驯化后移
入土壤中进行传代。用引物组合（ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－
ＩＦ／ＩＲ）对每代植株进行ＰＣＲ鉴定，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－
ＩＦ是ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 上的特定序列，ＭＩＲ１６０Ａ－ＩＲ是
双元表达载体ｐＴＡＭ１上的转录终止区序列的特定
序列，扩增片段８５１ｂｐ。
１．２．７叶片生理指标测定 大豆叶绿素提取用二甲
基甲酰胺黑暗浸提４８ｈ后，用分光光度计分别测定
６６４ｎｍ和６４７ｎｍ吸光值，以叶片鲜重每克含有的
叶绿素含量（单位：ｍｇ）来计量（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
最大光量子效率ＰＳＩＩ（Ｆｖ／Ｆｍ）用脉冲调制荧光仪
进行测定 （ＦＭＳ－２，Ｈａｎｓａｔｅｃｈ，Ｋｉｎｇ’ｓ Ｌｙｎｎ，ＵＫ）
（Ｗｉｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
２ 结果与分析
２．１ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 是受叶片衰老诱导的生长素快速
响应基因
叶片衰老过程中，大量基因进行表达，这些基因
的编码产物主要参与细胞内大分子的分解代谢和相
关物质的运输，而部分衰老相关基因则通过细胞信
号途径来调控衰老过程。衰老相关基因的表达随叶
片衰老呈现一定模式。为研究ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在叶
片衰老过程的表达特征，分析了ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在自
然衰老和人工黑暗诱导衰老下转录水平的变化。结
果显示，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 无论在自然发育和人工诱导
衰老中其表达都随衰老进程而逐渐增加（图２，图
３），说明ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 表达受衰老诱导，是衰老相
关基因。在外源生长素处理下，一些基因表达会在
很短时间（１０～３０ｍｉｎ）内就达到稳态水平，这些基
因为生长素原初响应基因，它们的这种上调表达不
依赖于蛋白质的重新合成。我们用生长素ＩＢＡ处
理叶片，在不同时间间隔取样分析，发现 Ｇｍ－
ＭＩＲ１６０Ａ 的转录在２０ｍｉｎ内就显著提高并保持
一定的水平（图４），说明ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 的表达受生
长素的快速诱导且是生长素的原初响应基因。
图２ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在叶片自然衰老进程中表达上调
Ｆｉｇ．２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｉｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｄｕｒｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
图３ 人工黑暗处理诱导ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 的表达
Ｆｉｇ．３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄａｒｋ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
２．２化学诱导ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达
为了探索ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在叶片衰老进程中的
功能，我们构建了可用肾上腺皮质激素（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉ－
ｃｏｉｄ，ＧＲ）类似物地塞米松（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）
诱导的过表达载体（图１）。通过农杆菌介导子叶节
转化方法，我们共获得４个稳定遗传的转基因株系
（３，５，７和８）（图５），并对其中３个株系进行进一步
８８ 广 西 植 物 ３５卷
图４ 外源生长素快速调节ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 的表达
Ｆｉｇ．４ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｐｐｌｉｅｄ ａｕｘｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｑｕｉｃｋｌｙ
分析。对自然生长叶片，我们用１０μｍｏｌ·Ｌ－
１的
ＤＥＸ每隔一天喷洒一次（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）；对离体
叶片，直接在蒸馏水中加入１０μｍｏｌ·Ｌ－
１的ＤＥＸ，
对照组用相应浓度的乙醇溶剂处理。试验表明，
ＤＥＸ处理８ｄ后，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 表达增加１０倍以
上（图６），ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 对应的三个靶基因表达受
到明显的抑制（图７），表明ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 在大豆叶
片中被成功地过表达。
图５ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达转基因植株的ＰＣＲ鉴定
泳道１－１１．不同Ｔ１ 代转基因株系；Ｍ．标准分子量。
Ｆｉｇ．５ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏｖｅｒ－
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ Ｌａｎｅ １－１１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
Ｔ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ；Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ．
２．４过表达ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 延缓叶片衰老
叶片衰老主要表现为叶绿体的崩溃，叶绿素的
降解和相关大分子动员从而导致叶片发黄，最后叶
片脱落死亡。叶片衰老导致叶绿体功能的丧失必然
伴随着ＰＳＩＩ和ＰＳＩ活性的下降，但ＰＳＩＩ比ＰＳＩ对
衰老更敏感，其光化学活性在衰老过程中下降十分
明显（Ｗｉｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。大豆为单次结实衰老
植物，即一旦结实迅速启动叶片衰老进程。营养生
图６ 外源ＤＥＸ诱导ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达 用ＤＥＸ
（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）和对照溶液处理展开２０ｄ的第一复叶，共处理８
ｄ，进行定量分析。ＯＸ－Ｃ／Ｔ－２０ｄ表示处理前叶片；ＯＸ－Ｃ－２８ｄ
表示对照溶液处理８ｄ；ＯＸ－Ｔ－２８ｄ表示ＤＥＸ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）处
理８ｄ。
Ｆｉｇ．６ Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ ｂｙ ｓｐｒａｙｉｎｇ
ＤＥＸ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｅａｖｅｓ Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｌｅａｖｅｓ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ
ｆｏｒ ２０ｄｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ（ＯＸ－３，ＯＸ－７ａｎｄ ＯＸ－８）
ｗｅｒｅ ｓｐａｙｅｄ ｗｉｔｈ ＤＥＸ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＥＸ ｆｏｒ
８ｄａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ．ＯＸ－Ｃ／Ｔ－２０ｄｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｌｅａｖｅｓ ｅｘｐａｎｄ ｆｏｒ ２０ｄｂｅｆｏｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＯＸ－Ｃ－２８ｄ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｓｐｒａｙｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ｆｏｒ ８ｄ；ＯＸ－Ｔ－２８ｄｍｅａｎｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｓｐｒａｙｅｄ ｗｉｔｈ
ＤＥＸ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）ｆｏｒ ８ｄ．
图７ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达抑制其靶基因表达
取样方法同图６。下同。
Ｆｉｇ．７ Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔｓ Ｓａｍｐｌｅｓ ａｒｅ
ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ Ｆｉｇ．６．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
长期第一复叶展开２０ｄ后，叶片已开始出现衰老生
理特征，随大豆进一步发育（２８ｄ），该叶片衰老程度
更为明显，出现叶绿素含量下降和ＰＳＩＩ的降低（图
８，图９），但当用化学诱导ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达后，
这些叶片具有较高的叶绿素含量（图８），较强的最
大光量效率（Ｆｖ／Ｆｍ）（图９）。此外，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
过表达引起大豆叶片衰老标记基因ＧｍＣＹＳＰ１表
９８１期 李小平等：大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 负调控植物叶片衰老进程
达下调（图１０）。这些现象表明ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 直接
参与了大豆叶片衰老过程的调控。
图８ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达对大豆叶片叶绿素含量的影响
Ｆｉｇ．８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
ｏｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｅａｖｅｓ
图９ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达对大豆叶片
最大光量子效率的影响
Ｆｉｇ．９ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｏｎ
ｍａｘｉｍｕｍ ｑｕａｎｔｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｆｖ／Ｆｍ）ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｅａｖｅｓ
３ 讨论与结论
大豆基因组测序已经完成 （Ｓｃｈｍｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，
２０１０），大豆的遗传转化方法比较成熟，如通过子叶
节转化，其转化效率最高可达１０％（Ｐａｚ ｅｔ ａｌ．，
２００４；Ｐａｚ ｅｔ ａｌ．，２００６），这为反向遗传学方法研究
基因功能提供了便捷。由于大豆为古多倍体（Ｐｌａｅ－
ｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ），其基因组含有６个ＧｍＭＩＲ１６０基因，
分别为ＧｍＭＩＲ１６０Ａ－Ｆ，基因功能冗余现象势必存
在，所以利用基因缺失突变方式研究他们的功能较
为困难。过表达可以从基因获得性功能角度来探究
基因的功能 （Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
图１０ ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达抑制叶片
衰老标记基因的表达
Ｆｉｇ．１０ Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＭＩＲ１６０Ａｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ＧｍＣＹＳＰ１ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｅａｖｅｓ
大豆叶片自然衰老和人工诱导衰老中，Ｇｍ－
ＭＩＲ１６０Ａ 表达随衰老进程而逐渐增加，表明其为
衰老相关基因。ＧｍＭＩＲ１６０的靶基因ＧｍＡＲＦｓ是
生长素信号转导重要组分，外源生长素可在２０ｍｉｎ
内诱导ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 的表达，表明ＧｍＭＩＲ１６０Ａ
是生长素的快速响应基因。进一步分析靶基因
ＧｍＡＲＦｓ 的 时 空 表 达 模 式 将 有 助 于 理 解
ＧｍＭＩＲ１６０在叶片发育中的调节功能，这部分工作
目前正在进行中。
大豆营养生长期（Ｖ）第一复叶展开２０～２８ｄ，
叶绿素含量和最大光量子效率都明显下降，叶片衰
老基因表达上调，表明叶片衰老已经启动并进行；相
同时期ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达第一复叶的衰老明显
受到抑制，表现为叶绿素升高、最大光量子效率增强
且衰老标记基因ＧｍＣＹＳＰ１明显抑制，充分证明
Ｇｍａ－ｍｉＲ１６０作为负调节因子直接参与了大豆叶
片衰老进程。此外，ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 过表达直接导致
靶基因ＧｍＡＲＦ１０／１６／１７的表达下调，表明大豆中
ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 通过抑制靶基因的表达参与调控叶
片衰老的发育进程。
过表达ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 延缓了叶片衰老且抑制
ＧｍＡＲＦｓ的表达，可以想象敲减表达ＧｍＡＲＦｓ的
转基因植株将会一定程度地抑制叶片的衰老，而抗
降解表达的转基因植株（ｍＧｍＡＲＦｓ）必将加速叶片
的衰老进程，相关实验正在进行中。
参考文献：
Ａｏｙａｍａ Ｔ，Ｃｈｕａ ＮＨ．１９９７．Ａ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－
ｔｉｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，１１（３）：
０９ 广 西 植 物 ３５卷
６０５－６１２
Ｂｕｃｈａｎａｎ－Ｗｏｌａｓｔｏｎ Ｖ，Ｐａｇｅ Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｃｏｍｐａｒａ－
ｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ
ｄａｒｋ／ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｊ，４２（４）：５６７－５８５
Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ Ｎ，Ｅｓｔｅｌｅ Ｍ．２００４．Ａｕｘｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，９（６）：３０２－３０８
Ｅｌｉｓ ＣＭ，Ｎａｇｐａｌ Ｐ，Ｙｏｕｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ａｕｘｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
Ｆａｃｔｏｒ１ａｎｄ Ａｕｘｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒ２ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ
ｆｌｏｒａｌ ｏｒｇａｎ ａｂｓｃｉｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ［Ｊ］．
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３２（２）：４ ５６３－４ ５７４
Ｆｅｈｒ，ＷＲ，Ｃａｖｉｎｅｓｓ，ＣＥ，Ｂｕｒｍｏｏｄ ＤＴ，ｅｔ ａｌ．１９７１．Ｓｔａｇｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌ－
ｏｐｍｅｎｔ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｏｙｂｅａｎｓ，Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌ［Ｊ］．
Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ，１１（６）：９２９－９３１
Ｇａｎ Ｓ，Ａｍａｓｉｎｏ ＲＭ．１９９７．Ｍａｋｉｎｇ ｓｅｎｓｅ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１３（２）：３１３－３１９
Ｈｏｕ Ｋ，Ｗｕ Ｗ，Ｇａｎ Ｓ．２０１３．ＳＡＵＲ３６，ａ ｓｍａｌ ａｕｘｉｎ ｕｐ ＲＮＡ
ｇｅｎｅ，ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１６１（２）：１ ００２－１ ００９
Ｋｉｍ ＨＪ，Ｒｙｕ Ｈ，Ｈｏｎｇ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｌｅａｆ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｂｙ ＡＨＫ３ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＲＲ２ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１０３（３）：８１４－８１９
Ｋｅｐｉｎｓｋｉ Ｓ，Ｌｅｙｓｅｒ Ｏ．２００５．Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｆ－ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＲｌ
ｉｓ ａｎ ａｕｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，４３５（７０４１）：４４６－４５１
Ｋｕｌｃｈｅｓｋｉ Ｆ，Ｍａｒｃｅｌｉｎｏ－Ｇｕｉｍａｒａｅｓ ＦＣ，Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．２０１０．
Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４０６（２）：
１８５－１９２
Ｌｉ Ｚ，Ｐｅｎｇ Ｊ，Ｗｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ３ｉｓ ａ ｓｅｎｅｓ－
ｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓ－
ｃｅｎｃｅ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｉＲ１６４ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２５（９）：３ ３１１－２８
Ｌｉ ＸＰ，Ｇａｎ Ｒ，Ｌｉ ＰＬ，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ
ｔｈａｔ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，６１（６）：８２９－８４４
Ｌｉｍ ＰＯ，Ｌｅｅ ＩＣ，Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２０１０．Ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ２
（ＡＲＦ２）ｐｌａｙｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｕｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｅａｆ
ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，６１（５）：１ ４１９－１ ４３０
Ｌｅｙｓｅｒ Ｏ．２００６．Ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｓｉｇｎａ－
ｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ，１６（１１）：４２４－４３３
Ｌｉｕ ＰＰ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＴＡ，Ｆａｈｌｇｒｅｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ａｕｘｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒ１０ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ１６０ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｓｅｅｄ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｔ－ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，５２（１）：
１３３－１４６
Ｌａｕｆｓ Ｐ，Ｐｅａｕｃｅｌｅ Ａ，Ｍｏｒｉｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．２００４．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ＣＵＣｇｅｎｅｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１（１７）：４ ３１１－４ ３２２
Ｍａｌｏｒｙ ＡＣ，Ｂａｒｒｅｌ ＤＰ，Ｂａｒｔｅｌ Ｂ．２００５．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｇｕｌａ－
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ａｕｘｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒｌ７ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ
ｐｒｏｐｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ａｕｘｉｎ ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１７（５）：１ ３６０－１ ３７５
Ｎｏｄｉｎｅ ＭＤ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ．２０１０．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎａｂｌｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｅｍｂｒｙｏ－
ｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ ＆Ｄｅｖ，２４（２３）：２ ６７８－２ ６９２
Ｐａｚ ＭＭ，Ｓｈｏｕ ＨＸ，Ｇｕｏ ＺＢ，ｅｔ ａｌ．２００４．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ ｎｏｄｅ ｅｘｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１３６：１６７－１７９
Ｐａｚ ＭＭ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＣ，Ｋａｌｖｉｇ ＡＢ，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ－
ａｒｙ ｎｏｄｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｘｐｌａｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ
ｍａｔｕｒｅ ｓｅｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２５（３）：２０６－２１３
Ｒｅｅｄ ＪＷ．２００１．Ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ａｕｘ／ＩＡＡ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｒａ－
ｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，６（９）：４２０－４２５
Ｓｕｎｋａｒ Ｒ，Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ Ｖ，Ｚｈｕ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｍａｌ ＲＮＡｓ ａｓ ｂｉｇ
ｐｌａｙｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，１２（７）：３０１－３０９
Ｓｃｈｍｕｔｚ Ｊ，Ｃａｎｎｏｎ Ｂ，Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ Ｊ．２０１０．Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｐａｌａｅｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｓｏｙｂｅａｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，４６３（７ ２７８）：１７８－１８３
Ｔｉｗａｒｉ ＳＢ，Ｗａｎｇ ＸＪ，Ｈａｇｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ａｕｘ／ＩＡＡ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ
ａｃｔｉｖｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｒｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ
ａｕｘｉｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１３（１２）：２ ８０９－２ ８２２
Ｔａｎ Ｘ，Ｃａｌｄｅｒｏｎ－Ｖｉｌａｌｏｂｏｓ ＬＩ，Ｓｈａｒｏｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ ａｕｘｉｎ ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＴＩＲ１ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，
４４６（７ １３６）：６４０－６４５
Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｒａａｆｆ Ｅ，Ｓｃｈｗａｃｋｅ Ｒ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ
ｈｏｒｍｏｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓ－
ｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１４１（２），７７６－７９２
Ｖｏｉｎｎｅｔ Ｏ．２００９．Ｏｒｉｇｉｎｅ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏＲ－
ＮＡｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１３６（４）：６６９－６８７
Ｗａｎｇ ＪＷ，Ｗａｎｇ ＬＪ，Ｍａｏ ＹＢ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｏｏｔ ｃａｐ ｆｏｒ－
ｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１７（８）：２ ２０４－２ ２１６
Ｗｉｎｇｌｅｒ Ａ，Ｍａｒｅ ＳＭ，Ｐｏｕｒｔａｕ Ｎ．２００４．Ｓｐａｔｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｍｅｔａ－
ｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓ－
ｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ，１６１：７８１－７８９
Ｗｉｎｇｌｅｒ Ａ，Ｂｒｏｗｎｈｉｌ Ｅ，Ｐｏｕｒｔａｕ Ｎ．２００５．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｌｉｇｈｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅ－
ｌａｙｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，５６（４２１）：２ ８９７－２ ９０５
Ｘｉａｏ Ｓ，Ｄａｉ ＬＹ，Ｌｉｕ ＦＱ，ｅｔ ａｌ．２００４．ＣＯＳ１：Ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｏｒｏ－
ｎａｔｉｎｅ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ１ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｊａｓ－
ｍｏｎａｔｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｆｅｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，
１６（５）：１ １３２－１ １４２
Ｙａｎｇ Ｘ，Ｌｅｅ Ｓ，Ｓｏ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．２００４．ＩＡＡ１ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＡＸＲ５
ａｎｄ ｉｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ＳＣＦＴＲＩｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，４０（５）：７７２－７８２
１９１期 李小平等：大豆ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因ＧｍＭＩＲ１６０Ａ 负调控植物叶片衰老进程