全 文 ：中 国 瓜 菜2016，29（4）：1-4 专题综述
葫芦科（Cucurbitaceae）植物包括 118个属 825
个种，广泛分布于热带和亚热带地区。在我国分布
约有 130个种，且多为人们所喜爱的瓜类蔬菜，如
西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai]、甜
瓜（Cucumis melo L.）、黄瓜（Cucumis sativus L.）和南
瓜（Cucurbita pepo L.）等，他们的复合杂交育种需要
某些具有优良性状的材料。此类材料的制备一般
要经历很长时间的筛选和纯合，单倍体育种技术为
葫芦科育种材料的制备开辟了一条简便快捷的途
径，不但可以获得较多基因型的植株，筛选到符合
目标性状的材料，而且可以大大缩短育种时间，节
省人力和物力。
由于葫芦科蔬菜自然发生单倍体的频率极低，
为了获得较多的单倍体植株，国内外主要通过一些
生物技术途径。花药培养和小孢子培养途径属于
离体雄核发育途径（in vitro androgenesis）[1-4]，将发育
到一定阶段的花药通过无菌操作技术接种到培养
基上，改变发育程序诱导分化出胚状体，形成愈伤
组织，随后使愈伤组织分化成完整植株的过程。利
用该技术可快速获得纯系、缩短育种周期、加速育
种进程[5]。本文侧重综述了影响该技术的一些重要
因素，如基因型、小孢子发育时期、生长环境、接种
密度、培养基、生长调节剂、碳源、活性炭、三十烷
醇、低温预处理、热激处理、倍性鉴定及植株再生
等，为该技术的开展和应用提供可行的理论依据。
1 基因型
不同基因型间愈伤组织诱导率相差很大，选择
合适的基因型是花药培养成功的关键[6-7]。谢淼等[8]
研究发现，所用的不同黄瓜品种花药培养都可以诱
收稿日期：2015-10-15；修回日期：2016-02-22
基金项目：河南省科技开放合作项目（142106000022）
作者简介：董彦琪，男，推广研究员，主要从事西甜瓜及蔬菜生产技术研究与推广。E-mail：yanqi-dong@163.com
通信作者：黄金华，男，助理研究员，主要从事蔬菜生产技术研究与示范推广。E-mail：304568254@qq.com
葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展
——花药和游离小孢子培养技术
董彦琪，黄金华，刘喜存，王文英，王玲燕，朱红彩
（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）
摘 要：花药培养和游离小孢子培养技术是葫芦科作物获得单倍体胚和单倍体植株的一种重要方式。该技术在葫
芦科作物育种上应用广泛，笔者综述了影响该技术的一些重要因素，如基因型、小孢子发育时期、生长环境、接种密
度、培养基、生长调节剂、碳源、活性炭、三十烷醇、低温预处理、热激处理、倍性鉴定及植株再生等，为该技术的开展
和应用提供可行的理论依据。
关键词：葫芦科蔬菜；单倍体育种；离体雄核发育途径；小孢子；甘露醇；三十烷醇
Advances of haploid breeding techniques of cucurbit vegetables：In vitro
anther and isolated microspore culture
DONG Yanqi，HUANG Jinhua，LIU Xicun，WANG Wenying，WANG Lingyan, ZHU Hongcai
（Xinxiang Academy of Agricultrual Science，Xinxiang 453000，Henan，China）
Abstract: The technique of in vitro anther culture and isolated microspore culture is an important tool to obtain haploid em⁃
bryos and plants in cucurbit crop breeding. The technology of in vitro anther culture and isolated microspore culture is ap⁃
plied widely，and we reviews many factors of this technology，such as genotype，the development stage of anther，the envi⁃
ronment of plant growth，inoculation density，medium，growth regulator，carbon source，activated carbon，triacontanol，
low temperature pretreatment and heat shock treatment，ploidy identification and plant regeneration.
Key words: Cucurbit vegetables；Haploid breeding；In vitro androgenesis；Microspore；Mannitol；Triacontanol
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DOI:10.16861/j.cnki.zggc.2016.0060
中 国 瓜 菜 29卷专题综述
导出愈伤组织，但诱导率和质量不一样；詹艳等[9]对
10份黄瓜供试材料进行花药培养，只有 4份试材获
得了胚状体。Song等[10]用 16个不同黄瓜品种进行
花药培养，其中‘Ningjia No. 1’出胚率最高。詹
艳等 [9]在黄瓜游离小孢子培养中也证实基因型是影
响胚诱导的重要因素，不同基因型产胚量差异很
大，最多的为每皿 33.4胚，最少的为每皿 1.5胚。
2 小孢子发育时期
适宜的花粉发育阶段对诱导雄性单性生殖至
关重要，是决定诱导能否成功及诱导频率高低的内
在因素之一。瓜类花药培养中，花粉发育阶段有一
定的差异。西瓜花粉单核中期至晚期花药培养效
果较好 [2]，李娟 [11]运用 DAPI 荧光染色法，镜检观察
横径 0.3~7.0 mm的西瓜雄花花蕾，结果表明花蕾横
径在 2.0~4.0 mm时，小孢子处于单核靠边期。谢淼
等[8]和詹艳等 [9]研究表明黄瓜花药处于单核中后期
（花蕾长度为 0.9~1.5 mm）时较适合培养；Metwally
等[4]研究表明西葫芦小孢子处于单核中期至单核晚
期花药培养效果较好。
3 生长环境
供体植株的生长环境对小孢子活力及培养效
果也有一定影响。Mohamed等[12]报道，西葫芦花药
培养种植材料冬季的出胚率是夏季的 2倍多。谢
淼等[8]研究表明黄瓜花药培养试验中发现由于诱导
率与季节有关，春季（4 月）比秋季（10 月）的效果
好。
4 接种密度
接种密度与诱导率成正相关。接种密度不可
过大，以尽量减轻花药在空间和营养上的竞争；但
也不能过小，否则不利于促进物质的形成，也不利
于愈伤组织的形成。詹艳等 [9]在黄瓜游离小孢子培
养中采用的小孢子密度为 2×105个·mL-1。
5 培养基成分
5.1 基本培养基
一般选用 MS作基本培养基。初期的研究中西
瓜愈伤组织易褐变且诱导率不高 [13]，袁万良等 [14]和
魏瑛等[15]通过改良培养基解决了西瓜愈伤组织褐变
死亡问题；袁万良等[14]将分化阶段西瓜愈伤组织的
诱导率从 0.5%提高到 94.4%，并快速诱导出绿色愈
伤组织。西葫芦花药培养中[4]也选用 MS作为花药
愈伤组织诱导培养基。谢淼等[8]在黄瓜花药培养中
选用 MS和 B5作为基本培养基。
5.2 生长调节剂
基本培养基能保证培养物的生存与最低生理
活动，但只有配合使用适当的激素，才能诱导细胞
分裂、愈伤组织生长以及芽和根的分化等。前人在
瓜类花药培养的研究中表明 [4，10，12，16]，对愈伤组
织诱导率影响最大的是 2，4-D。Kumar等[17]在黄瓜
花药培养中发现，2 个品种对 2，4-D（质量浓度
0.44 mg · L-1）反应不完全一致，‘Calypso’直接发育
成胚，而‘Green Long’经愈伤组织发育成胚。詹艳
等 [9]在黄瓜花药培养中发现低质量浓度的 2，4-D
（0.5 mg·L-1）有利于胚形成；Rakha等[18]研究表明随
着 2，4-D 质量浓度（从 1.0到 5.0 mg·L-1）增加，形
成的愈伤组织越来越少。
耿晨光等[19]认为 6-BA能显著提高愈伤组织的
诱导率，配合 2，4-D 和 KT 使用效果更好。詹
艳等 [9]研究表明低质量浓度的 6-BA（0.2 mg·L-1）有
利于黄瓜胚形成。Kumar 等 [17]研究认为 ABA 能促
进胚发育成熟，并随之发育成正常植株。Song等[10]
研究认为有利于黄瓜胚发育的 BA和 KT最佳质量
浓度为 1.0 mg·L-1和 1.25 mg·L-1。
5.3 碳源
5.3.1 蔗糖 蔗糖一直被认为是植物组织培养的
标准碳源而被广泛应用，他不仅能给外植体提供能
量，而且也能维持一定的渗透压。Metwally等[4]在西
葫芦花药培养中发现当诱导培养基中的蔗糖质量
浓度为 150 g·L-1时的再生植株最多。陶正南[20]在甜瓜愈
伤组织诱导中采用的蔗糖质量浓度为 60 g·L-1，分
化培养基中的质量浓度为 30 g·L-1。Kumar等[21]研
究表明诱导黄瓜胚胎形成的最佳蔗糖质量浓度
为 85 g·L-1，分化时则为 30 g·L-1。羊杏平等[22]研究
表明高质量浓度的蔗糖不利于西瓜小孢子的存活，
‘特大凤’和‘こがね小玉’在质量分数为 13%的蔗
糖处理中的小孢子活性均高于 10%和 16%的蔗糖
处理。
5.3.2 甘露醇 甘露醇通过影响培养基的渗透压
而影响小孢子的发育。羊杏平等[22]研究表明，西瓜
品种‘新小兰’和‘黑美人’对甘露醇的反应不一
致。未添加甘露醇（对照）的‘新小兰’小孢子活性
最高，且随着添加甘露醇浓度的增加‘新小兰’小孢
子活性急剧下降；‘黑美人’小孢子活性则随甘露醇
浓度的增加呈先增加后下降趋势，甘露醇质量浓度
为 10 g·L-1时小孢子活性达到最大值，为 92%。
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4期 等：——花药和游离小孢子培养技术 专题综述胡 军，
5.4 活性炭
在瓜类的花药培养中，有关活性炭对培养过程
的影响报道极少。加入活性炭的目的主要是利用
其吸附性，减少有害物质的不利影响（如活性炭能
吸附一些酚类物质，可以减轻愈伤组织的褐化，吸
收琼脂中的杂质等）。此外，创造暗环境有利于某
些植物生根。但是活性炭也能吸附有益物质，如
NAA、KT、6-BA、Fe-EDTA。喻财铃[24]在丝瓜花药培
养中明确提出活性炭的效果差，有抑制作用。
5.5 三十烷醇
三十烷醇生理活性很强，使用浓度较低，具有
促进生根、发芽等功用，但三十烷醇在花药培养中
的作用尚未清楚。袁万良等[14]发现加入一定浓度的
三十烷醇，西瓜愈伤组织全部变为绿色，并形成深
绿色点状组织，提高了再生植株的诱导率。李娟等[11]的
研究也表明三十烷醇对西瓜愈伤组织的分化至关
重要，在 MS+ 2.0 mg·L-1三十烷醇+ 0.5 mg·L-1 6-BA
培养基上培养 30 d 后，愈伤组织能成功分化出
丛生芽。
羊杏平等[22]在 NLN+0.2 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
2，4-D 的培养基中添加三十烷醇能够促进‘新
小兰’小孢子活性，在培养 3 d时，‘新小兰’小孢子
存活率达到最高值，为 84%，而未加三十烷醇的小
孢子存活率只有 46%。而‘早春红玉’对三十烷醇
的反应与‘新小兰’刚好相反，三十烷醇抑制了‘早
春红玉’的小孢子存活率，且随培养时间的延长，小
孢子活性显著下降。王开冻等[23]研究也表明，三十
烷醇只对诱导和保持绿色愈伤组织有利，对促进不
定芽形成的效果不明显。
6 处理方法
6.1 低温预处理
低温预处理是花药培养中比较常见的培养方
法。4 ℃是较为适宜的预处理温度[4，8，20-26]，但不同蔬
菜作物处理时间不完全一致。
刘林[25]利用显微切片技术研究了低温（4~6 ℃）
条件下西瓜品种‘京欣三号’花药的细胞形态学变
化，结果表明，小孢子母细胞和绒毡层细胞是花药
中对低温最敏感的细胞；小孢子母细胞时期和减数
分裂前期是对低温最敏感的发育阶段。魏瑛[26]研究
表明 4 ℃低温条件下西瓜花药处理 72 h效果较佳；
羊杏平等 [22]研究表明西瓜‘金玉玲珑’和‘拿比特’
4 ℃低温处理 2 d的小孢子存活率高于对照，但 4 ℃
处理 4 d后 2品种的小孢子存活率均较对照显著下
降，其原因可能是处理时间过长，影响了小孢子继
续发育，致使单核靠边期的小孢子数量减少；而朱
迎春等[27]研究认为 4 ℃低温处理 48 h和 72 h时，西
瓜花药培养愈伤组织诱导率均较高。
Kumar等[21]研究表明黄瓜花蕾在 4 ℃条件下处
理 2 d的效果最佳；谢淼等[8]认为黄瓜适宜处理时间
是 48~72 h。Metwally等[4]研究表明西葫芦处理时间
4 d效果较好。喻财铃[24]研究表明 4~7 ℃的低温处
理可以显著地提高丝瓜愈伤组织的诱导率，且在 4~
8 d内随着处理时间的延长，愈伤组织诱导率增高。
6.2 热激处理
热激处理温度对愈伤组织或胚状体的形成以
及促进其生长都有重要作用。李娟等 [11]研究表明
36 ℃热激 4 d时，西瓜小孢子的脱分化效果好。其
中，‘271’小孢子脱分化率最高，达 4.01%。羊杏平
等[22]研究表明西瓜小孢子活性随热激处理时间的增
加呈先上升后下降的趋势，35 ℃热激 4 d时‘金玉玲
珑’和‘拿比特’小孢子存活率均最高，分别为
68.33%和 66.00%。
7 倍性鉴定与植株再生
7.1 倍性鉴定
Dryanovska等[3]发现了自然加倍现象。然而大
多学者研究证明，瓜类花药培养中，单倍体、多倍体
或与非整倍体现象并存。如 Metwally等[4]在西葫芦
花药培养中的研究表明，单倍体植株和二倍体植株
各占 50%；Mohamed等[12]在西葫芦花药培养中发现
60%植株是单倍体、23%植株是二倍体、17%植株是
非整倍体，用秋水仙碱处理得到的二倍体植株能正
常开花结果；薛光荣等[13]对生根植株随机取样，用铁
矾苏木精染色法，多次检定根尖细胞染色体数，均
可见单倍体植株细胞 2n=x=11 和具有一定数量的
非整倍体细胞；Kumar等[21]在西葫芦花药培养中的
研究表明，‘Calypso’单倍体植株和二倍体植株分别
是 80%和 20%；‘Green Long’单倍体植株和二倍体
植株分别是 60%和 40%。
7.2 植株再生
薛光荣等[13]将诱导的西瓜花药愈伤组织转移到
MS+2.0~4.0 mg·L-1三十烷醇的分化培养基上分化
出发育正常、叶色浓绿的植株；再将分化出的植株
转入 1/2 MS+0.2 mg·L-1 IBA+1.0 mg·L-1 IAA或转入
1/2MS+1.5 mg·L-1 IAA 生根培养基上，10 d 左右生
根。刘林[25]研究表明，西瓜花药愈伤组织诱导最佳
培养基为MS+0.5mg·L-1KT+1.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1
董彦琪，等：葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——花药和游离小孢子培养技术
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中 国 瓜 菜 29卷专题综述
NAA 和 MS + 1.5 mg·L-1 KT + 1.0 mg·L-1 6-BA +
1.5mg·L-1NAA，增殖分化最佳培养基为MS+1.0mg·L-1
NAA+0.25 mg·L-1 6-BA，但最终未能诱导出不定
芽。朱迎春等[27]在西瓜花药培养中发现，野生西瓜
在 3种诱导培养基和 2种分化培养基上诱导率均
较高，在大量元素 NH4+减半的 MS+0.5 mg·L-1 IBA+
3.0%蔗糖+0.7%琼脂的生根培养基上生根率达 80%
以上，且根系健壮。
8 问题与展望
利用瓜类花药培养和游离小孢子培养技术获
得单倍体植株是一个较为成功的途径，众多国内外
学者研究了一些影响因素，在基因型、小孢子发育
时期、生长环境、接种密度、培养基、生长调节剂、碳
源、活性炭、三十烷醇、低温预处理、热激处理、倍性
鉴定及植株再生等方面并取得了一些重要进展。
如处于中期至单核靠边期的花粉最易诱导胚胎发
生，而其他时期的小孢子则不宜诱导成胚，因此小
孢子发育时期是影响诱导成胚的关键因素；由西瓜
花药愈伤组织分化形成不定芽是比较困难的，外界
激素起着重要作用，如 2，4-D、6-BA、KT、三十烷醇
等对愈伤组织诱导起很大的促进作用，但还存在愈
伤组织褐化和不定芽玻璃化现象，使用激素时应考
虑外植体内源激素水平和激素间相互配合作用等
因素；4 ℃低温预处理是保存花蕾的一种有效方式，
热激处理（35 ℃或 36 ℃）促进愈伤组织的形成，但
低温预处理和热激处理对小孢子发育途径的影响
机制尚未见报道。
利用花药培养和游离小孢子培养技术已在黄
瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、丝瓜等瓜类作物上获得了
单倍体胚和单倍体植株，该技术为研究离体雄核发
育机制、开展更广泛的雄核（花药和游离小孢子）单
倍体培养奠定了基础。游离小孢子培养技术是一
种更高效的单倍体胚诱导和植株再生技术，然而在
瓜类作物单倍体育种中报道较少。深入探索瓜类
游离小孢子培养技术、建立高频小孢子胚诱导和植
株再生体系是今后育种工作者研究的重要方向。
参考文献
[1] Lazarte J E，Sasser C C. Asexual embryogenesis and plantlet
development in anther culture of Cucumis sativus L.[J]. Hort
Science，1982，17（1）: 88.
[2] Xue G R，Yu W Y，Fei K W. Watermelon plants derived by
in vitro anther culture[J]. Plant Physiol Commun（CHN），1983，
4: 40-42.
[3] Dryanovska O A，Ilieva I N. In vitro anther and ovule cul⁃
tures in muskmelon （Cucumis melo L.）[J]. C R Acad Bul⁃
gare Sci，1983，36: 1107-1110.
[4] Metwally E I，Moustafa S A，EI Sawy B I，et al. Haploid plant⁃
lets derived by anther culture of Cucurbita pepo[J].Plant Gell
Tiss.Org.Cult.，1998，52（3）: 171-176.
[5] Bajaj Y P S. In vitro production of haploids and their use in
cell genetics and plant breeding[J].Biotechnology in Agricul⁃
ture and Forestry，1990（12）: 344.
[6] Shail J W，Robinson R W. Anther and ovule culture of Cucur⁃
bita[J]. Cucurbit Genetics Coop,1987，10: 92.
[7] Ficcadenti N，Sestili S，Annibali S，et al. In vitro gynogenesis
to induce haploid plants in Cucumis melo L.[J]. J Genet＆
Breed，1999，53: 255-257.
[8] 谢淼，秦丽颖，潘俊松，等 .黄瓜花器形态发生、小孢子发育与花
药培养[J].西北植物学报，2005，25（6）: 1096-1100.
[9] 詹艳，陈劲枫 .黄瓜游离小孢子培养诱导成胚和植株再生[J].园
艺学报，2009，36（2）: 221-226.
[10] Song H，Lou Q F，Luo X D，et al. Regeneration of doubled
haploid plants by androgenesis of cucumber（Cucumis sativus
L.）[J]. Plant Cell，Tiss Org Cult，2007，90（3）: 245-254.
[11] 李娟，张丽，李焕秀，等 .西瓜花药培养技术研究[J].中国瓜菜，
2008，21（4）: 4-8.
[12] Mohamed M F，Refae i E F S. Enhanced haploids regenera⁃
tion in anther culture of summer squash（Cucurbita pepo L.）
[J]. Cucurbit Genetics Coop Rep，2004，27: 57-60.
[13] 薛光荣，余文炎，杨振英 .西瓜花粉植株的诱导及其后代初步观
察[J].遗传，1988，10（2）: 5-8.
[14] 袁万良，付润民，雷保林，等 .西瓜花培试验初报[J].陕西农业科
学，1995（1）: 29-30.
[15] 魏瑛，张俊莲，陈年来，等 .西瓜花药愈伤组织的诱导[J].甘肃农
业大学学报，1998，33（专辑）: 127-130.
[16] 苏华，金定燕，任华中 .黄瓜花药培养中若干影响因素的研究
[J].沈阳农业大学学报，2006，37（3）: 470-472.
[17] Ashok Kumar H G，Murthy H N，Paek K Y. Embryogenesis
and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sati⁃
vus L.[J]. Scientia Horticulturae，2003，98: 213-222.
[18] Rakha M T，Metwally E I，Moustafa S A，et al. Evaluation of
regenerated strains from six Cucurbita interspecific hybrids ob⁃
tained through anther and ovule in vitro cultures[J]. AJCS，
2012，6（1）: 23-30.
[19] 耿晨光，何刚 . 瓜类花药培养中激素和碳源的应用研究进展
[J] .长江蔬菜，2008（14）: 5-9.
[20] 陶正南 . 甜瓜花药培养诱导成植株[J]. 植物生理学通讯，1987
（5）: 43.
[21] Ashok Kumar H G，Murthy H N. Effect of sugars and amino
acids in vitro androgenesis of Cucumis sativus[J]. Plant Cell，
Tissue and Organ Culture，2004，78: 201-208.
[22] 羊杏平，陈学好，周峰 .不同预处理对西瓜小孢子存活率的影响
[J].江苏农业学报，2012，28（5）: 1104-1108.
[23] 王开冻，魏跃 .西瓜花药培养中不定芽的诱导与增殖[J].安徽农
业科学，2008，36（16）: 6826-6827.
[24] 喻财铃 .丝瓜小孢子囊与雄配子体发育的研究和花药离体培养
初探[D].广州: 华南农业大学，2001.
[25] 刘林 . 低温对西瓜花药发育的影响 [J]. 北方园艺，2007（4）:
16-17.
[26] 魏瑛 .低温预处理对西瓜花药愈伤组织诱导的影响[J].甘肃农
业科技，1999（9）: 34-36.
[27] 朱迎春，孙德玺，邓云，等 .前期处理对西瓜花药培养愈伤组织
诱导的影响[J].中国瓜菜，2012，25（5）：17-19.
·· 4