全 文 :中 国 瓜 菜2016,29(5):1-4 专题综述
未授粉子房/胚珠离体培养技术属于离体雌核
发育途径(in vitro gynogenesis)[1-5],是将未授粉子房/
胚珠从母体上分离出来,在无菌的人工环境条件下
诱导雌核发育,使其生长发育形成单倍体胚和植株
的过程。利用该技术可快速获得纯系,缩短育种周
期,加速育种进程。笔者侧重综述了该技术的一些
重要影响因素,如基因型、胚囊发育时期、接种方
式、植株生长环境、植物生长调节剂、碳源、硝酸银、
低温预处理、热激处理、倍性鉴定以及植株再生等,
为该技术的开展和应用提供可行的理论依据。
1 基因型
基因型是影响未授粉子房胚胎发生的重要因
素之一,选择合适的基因型是植物未授粉子房离体
培养成功的关键。Shalaby[2]对 12种不同基因型西
葫芦品种的未授粉子房培养发现,‘Raad’F1材料表
现最佳,胚诱导率为 48.4%,每皿成苗 15株。谢冰
等[6-7]和刘栓桃等[8]研究也表明西葫芦雌核离体培养
存在明显的基因型差异。刘栓桃等[8]对 9个不同基
因型西葫芦材料的未授粉胚珠诱导培养发现,再生
植株率最高的能达到 33.33%,最低的仅为 2.67%。
杜胜利等[9]研究发现‘津春 3号’的胚芽和愈伤组织
诱导率均高于‘津杂 2号’;陈小鹏等[10]也认为黄瓜
基因型对雌核发育有着重要的影响。裴晓利等[11]研
究表明,不同基因型黄瓜的未授粉子房对离体诱导
培养的敏感度不同,9个品种单倍体诱导率变化幅
度为 65.52%~93.33%。Ficcadenti等[5]对 2个甜瓜品
种(‘Reticulatus’‘Inodorus’)及其杂交种进行了未授
粉子房培养,结果显示,‘Reticulatus’出胚率最高。
韩丽华等[12]研究发现甜瓜不同的正反交组合对单倍
葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展
——未授粉子房离体培养技术
黄金华,董彦琪,王文英,刘喜存,马晓红
(河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000)
摘 要:未授粉子房离体培养技术是葫芦科作物获得单倍体胚和单倍体植株的一种重要方式。该技术在葫芦科作
物育种上应用广泛,笔者综述了影响该技术的一些重要因素,如基因型、胚囊发育时期、接种方式、植株生长环境、植
物生长调节剂、碳源、硝酸银、低温预处理、热激处理、倍性鉴定以及植株再生等,为该技术的开展和应用提供可行的
理论依据。
关键词:葫芦科作物;单倍体育种;离体雌核发育;胚囊;硝酸银
Advances of haploid breeding techniques of cucurbit vegetables:In vitro
culture of unpollinated ovary
HUANG Jinhua,DONG Yanqi,WANG Wenying,LIU Xicun,MA Xiaohong
(Xinxiang Academy of Agricultural Science,Xinxiang 453000,Henan,China)
Abstract:The technique of in vitro unpollinated ovary culture is an important tool in cucurbit crop breeding. This technolo⁃
gy is applied widely,and we review many factors such as genotype,the development stage of ovary,inoculation methods,
the environment of plant growth,plant growth regulator,carbon source,silver nitrate,low temperature pretreatment and
heat shock treatment,ploidy identification and plant regeneration.
Key words:Cucurbit vegetables;Haploid breeding;In vitro gynogenesis;Embryo sac;Silver nitrate
收稿日期:2015-10-15;修回日期:2016-02-22
基金项目:河南省科技开放合作项目(项目编号:142106000022)
作者简介:黄金华,男,助理研究员,主要从事蔬菜遗传育种和示范推广。E-mail:304568254@qq.com
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DOI:10.16861/j.cnki.zggc.2016.0080
中 国 瓜 菜 29卷专题综述
体的诱导有显著影响。
2 胚囊发育时期
胚囊发育时期对胚状体的诱导至关重要。谢
冰等[6-7]研究表明开花前 1 d和开花当日西葫芦胚珠
诱导频最高;刘栓桃等 [8]对 9个西葫芦材料进行不
同开花时期取材试验,结果表明除 1个材料没能得
到再生植株外,其他均表现为开花当天的胚珠最适
合诱导培养,再生植株率最高;陈学军等[13]研究表明
处于成熟胚囊期即开花当天的西葫芦未授粉子房
的胚状体诱导率、成苗率均最高。Gémesné等[14]发现
黄瓜雌花开放前 6 h 胚囊刚好形成,胚诱导率最
高。刁卫平等 [15]发现,开花前 1~4 d的黄瓜子房均
可诱导获得胚芽,但以开花前 2~3 d的子房诱导率
最高。Shalaby[2]对南瓜‘Giad’‘Raad’F1代的第一节
雌花、第二节雌花和第三节雌花分别进行未授粉胚
珠离体培养,发现第二节雌花胚诱导和成苗效果最
佳。孙守如等[16]发现开花前 1 d的南瓜胚珠已成熟
或接近成熟,易于诱导。
3 接种方式
接种方式直接影响雌核发育的营养吸收,从而
影响雌核发育的途径。陈学军等[13]比较 4种接种方
法对愈伤组织的影响,结果表明横切分法接种的胚
珠最先从切口处长出愈伤组织,且愈伤组织诱导率
最高可达 28%;其次为啄切、纵切而以完整胚珠法
所得愈伤组织诱导率最低,为 6%。究其原因可能
是横切、啄切和纵切给外植体以较大的创伤面而激
发了愈伤组织的形成,也可能是创伤面增强了未授
粉胚珠对养分的吸收能力。
4 生长环境
季节对未授粉子房离体培养的影响是显著的,
这可能与植物的生理生长特性有关。Przyborowski
等[17]在黄瓜单倍体诱导中发现,春季材料的诱导率
很低,仅是夏季材料诱导率的 1/4。魏爱民等[18]研究
表明黄瓜离体雌核发育的单倍体胚胎发生率和植
株再生率在温度相对较高的 6月下旬、7月上旬以
及 9月份明显高于其他季节;生长发育前期的供体
植株单倍体再生率相对较高且稳定;随着供体植株
逐渐衰老,其未授粉子房培养的污染率不断上升;
种植于塑料大棚内的供体材料比种植在露地中的
供体材料具有更高的单倍体胚胎发生率和成苗
率。盛慧[19]试验结果表明,秋季生长的黄瓜材料诱
导率要高于春季,且不易污染,冬季的诱导效果一
般。
此外,谢冰等 [7]证实不同播期的西葫芦材料胚
状体发生率存在极显著差异,秋播材料的诱导率最
高,夏播与春播都很低;孙守如等[16]在南瓜上也发现
胚状体发生和小苗的诱导集中在 7月中旬和 8月
中旬。
5 培养基
5.1 基本培养基
黄瓜未授粉子房的离体培养一般采用 MS培养
基或是在 MS培养基的基础上对某些成分作一些调
整[14],也有使用专门针对黄瓜离体雌核诱导的 CBM
作为基本培养基的[9]。谢冰[6-7]和陈学军等[13]在西葫
芦未授粉胚珠离体培养中分别采用的是 N6培养基
和 MS培养基。谢冰等[7]研究认为培养基对西葫芦
胚状体诱导率影响较大,筛选的 M3、M2培养基有较
高的利用价值。厚皮甜瓜的离体雌核诱导也是在
MS培养基上诱导胚状体发育成苗的[12]。
5.2 激素
激素对胚发生有着重要作用。Metwally等[4]在
诱导西葫芦未授粉胚胎分化时分别使用质量浓度
为 0.1、1.0、5.0、10.0 mg·L-1的 2,4-D,结果发现 1.0
和 5.0 mg·L-12,4-D处理的胚诱导率较高。谢冰等[7]筛
选出 2组适合西葫芦胚状体诱导的培养基,分别是
N6+2.00 mg·L-12,4-D + 0.5 mg·L-1 NAA +1.00 mg·L-1
BA 和 N6+ 4.00 mg·L-1 2,4-D+0.25 mg·L-1 NAA +
1.00 mg·L-1 6-BA。陈学军等 [13]在西葫芦未授粉胚
珠培养过程中用MS+ 1.00 mg·L-12,4-D + 0.50 mg·L-1
NAA + 1.00 mg·L-1 BA诱导出愈伤组织。
陈小鹏等[10]在黄瓜未授粉子房的胚状体诱导试
验中发现,TDZ明显促进胚状体的生长和膨大,质
量浓度为 0.06和 0.08 mg·L-1时胚状体诱导率(分别
为 66.7%和 64.9%)都极显著高于其他处理,并且两
者之间没有显著差异。Diao等[20]认为,TDZ能促进
黄瓜胚胎形成,以 0.04 mg·L-1效果最佳。Malik等[21]
研究发现,诱导培养基中添加 0.04和 0.02 mg·L-1的
TDZ 能有效促进甜瓜未授粉子房胚珠愈伤产
生,胚诱导率分别为 46.60%和 65.83%,而质量浓
度为 0.60 mg·L-1的 6-BA激素可显著提高外植体再
生率。
此外,Kwack等[22]研究认为,植物激素对南瓜的
胚发生有着重要作用。韩丽华等 [12]用细胞分裂
素 Zip、BA和 IBA成功地诱导出厚皮甜瓜的胚状体
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5期 等:——未授粉子房离体培养技术 专题综述胡 军,董彦琪,等:葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——未授粉子房离体培养技术
植株。
5.3 碳源
一般采用蔗糖作为碳源。谢冰等[6]关于西葫芦
离体雌核培养诱导胚状体的试验表明,30 g·L-1蔗糖
对胚状体的发生是有利的,诱导率较高。陈小
鹏等 [10]试验表明蔗糖质量浓度为 40 g·L-1时黄瓜胚
状体诱导效果最好。Shalaby[2]在西葫芦品种‘Eskan⁃
drani’胚珠诱导时使用 30、60、90 g·L-1的蔗糖质量
浓度梯度比较发现,30 g·L-1时胚珠诱导效率最佳,
而 90 g·L-1时胚珠完全不能生长。这些结果表明,
在愈伤组织芽分化时可能需要较低的渗透压。韩
丽华等[12]研究表明甜瓜胚状体诱导适宜蔗糖质量浓
度为 30 g·L-1。
5.4 AgNO3
AgNO3是乙烯合成的抑制剂。Mohiuddin 等 [23]
认为 AgNO3影响愈伤组织的内源激素代谢从而有
利于瓜类作物植株的再生。韩丽华等 [12]研究表明
AgNO3有利于甜瓜胚状体的诱导,当质量浓度
为 80 mg·L-1时出胚率最高,为 0.74%。这可能是由
于 NO3-影响了离体培养过程中的某种激素的代谢,
从而间接影响了胚状体的形成与生长。而Diao等[20]研
究发现 AgNO3对胚诱导并没有显著影响,但会缩短
胚胎萌芽期和提高胚胎形成数目,且选用的材料之
间出胚率并无显著差异。
6 处理方式
6.1 低温预处理
低温预处理极有可能改变雌核发育途径,从而
导致单倍体胚形成。Kwack等[22]研究表明,南瓜在
5℃条件下预处理 2 d能提高胚胎的发生率。Shalaby[2]
研究表明西葫芦品种‘Queen’F1在 4 ℃预处理 4 d
时效果最佳。Metwally 等 [4]将开花前 1 d的西葫芦
品种‘Eskandarani’在 4℃条件下分别进行 0、2、4、8 d预
处理,结果发现不进行预处理的的材料具有最高的
胚诱导率。
6.2 热激处理
Gémesné等[14]对黄瓜离体雌核进行热激处理,结
果表明,在诱导培养时 35 ℃热激处理 2~4 d获得的
胚状体诱导率和植株再生诱导率最高。Diao等[20]进
一步对黄瓜热激处理,在 35 ℃条件下热激 3 d的效
果较 2 d和 4 d的好。陈小鹏等[10]认为 35 ℃热激处
理是黄瓜未授粉子房胚状体诱导的最佳预处理温
度。Shalaby[2]研究表明西葫芦品种‘Queen’F1在
32 ℃热激处理 4 d时效果最佳。
7 倍性鉴定与植株再生
7.1 倍性鉴定
瓜类二倍体植株与单倍体、三倍体、四倍体在
形态上有比较明显的差别 [24],主要表现在子叶、真
叶、花的形状和颜色,果实形状以及种子的形态。
这些形态差异是从外观上用目测法鉴别瓜类多倍
体较为可靠的指标。谢冰等[6]用西葫芦未授粉胚珠
诱导出 120株再生植株,其中 42株性状表现符合
二倍体植株(2n = 2x = 40)特征且育性正常,并获得
自交果实及种子。
对获得的植株细胞染色体计数是最有效的方
法,但染色体制片需要较高的细胞学水平,且费时、
费力。Metwally等[4]对由西葫芦未授粉子房离体诱
导的 20株再生植株的根尖染色体进行观察,结果
表明,有 5株单倍体植株(2n = x = 20)、15株二倍体
植株(2n = 2x = 40)。Diao等[20]对 40株再生黄瓜植
株的卷须染色体染色进行观察,结果表明,有 2株
单倍体植株(2n = x = 7)、33株二倍体植株(2n = x =
14)、5株四倍体植株(2n = 4x = 28)。
叶绿体数目随染色体倍数的升高而增加,因而
可采用气孔保卫细胞叶绿体计数法来间接鉴别
再生植株的倍性。刘栓桃等 [8]将西葫芦未授粉
胚珠诱导的 20 株再生植株经气孔保卫细胞叶
绿体计数法鉴定,结果为 8株单倍体植株,12株二
倍体植株。
7.2 植株再生
谢冰等 [6]在西葫芦未授粉胚珠离体培养中,以
20 g·L-1蔗糖或葡萄糖作碳源的无激素 N6植株再
生培养基上培养出健全胚状体的成苗。刘栓桃等[8]
对 4个西葫芦品种未授粉子房培养,在质量浓度为
0.5 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 2,4-D的培养基上再生
植株产率最高,达 28.33%。陈学军等[13]在西葫芦未
授粉胚珠离体培养中,诱导的愈伤组织在 MS+
0.5 mg·L-1 NAA +1.0 mg·L-1 BA+2.0%蔗糖+0.8%琼
脂培养基上芽诱导率最高,为 15.6%;高浓度的
NO3-有利于不定芽根的形成,但其作用机制尚不清
楚。孙守如等[16]研究发现观赏南瓜未授粉胚珠诱导
胚状体的效果以 MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.25 mg·L-1
NAA+1.0 mg·L-1 6-BA+30.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼
脂处理较好,分化、再生培养基分别以MS+30.0 g·L-1蔗
糖+6.0 g·L-1琼脂、MS+30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂+
1.0 g·L-1活性炭效果最佳,其胚状体发育成正常植
株率达 70%以上。
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中 国 瓜 菜 29卷专题综述
8 问题与展望
利用未授粉子房培养技术获得瓜类单倍体植
株是一个较为成功的途径,众多国内外学者研究了
一些影响因素,如基因型、胚囊发育时期、接种方
式、植株生长环境、植物生长调节剂、碳源、硝酸银、
低温预处理、热激处理、倍性鉴定以及植株再生等,
并取得了一些重要进展,如 2,4-D 与 NAA、6-BA
配合使用虽然对胚状体的诱导率有利,但畸形胚状
体的比例较高,主要在诱导过程中出现畸形胚状体
或健全胚状体转接后表现出发育异常;诱导温度高
于 35 ℃时接种组织的褐化和玻璃化情况较严重,生
长培养基中加入 0.05 mg·L-1抗坏血酸针剂可有效
防止胚状体再生长过程中的氧化;未授粉胚珠的取
样部位对胚状体的形态建成及后续的成苗有显著
影响,子房中部的胚珠发育充分有利于诱导出健全
胚状体;叶片保卫细胞叶绿体计数鉴定法与再生植
株自交后代田间性状整齐度观察相结合,不仅可鉴
定再生植株的起源和倍性,而且还可对再生植株的
农艺性状进行调查研究。
未授粉子房培养技术已在黄瓜、西葫芦、甜瓜、
南瓜等瓜类作物取得了单倍体胚和单倍体植株,该
技术为研究离体雌核发育机制、开展更广泛的未授
粉胚珠(双)单倍体培养方法奠定了基础。离体培
养能够引起各种类型的突变,影响培养物的遗传稳
定性,这已是不争的结论。瓜类离体雌核发育胚状
体的形成及成苗过程涉及的影响因素更为复杂,如
需全面地了解再生植株成苗的机制,尚需进行更加
深入的研究。
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