全 文 :广 西 植 物 Guihaia Sept.2013,33 (5):674-678 http://journal.gxzw.gxib.cn
DOI:10.3969/j.issn.1000-3142.2013.05.016
陈慧泽,韩榕.增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响 [J].广西植物,2013,33 (5):674-678
Chen HZ,Han R.Influence of enhanced UV-B radiation on F-actin of wheat mesophyl nucleus[J].Guihaia,2013,33 (5):674-678
增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响
陈慧泽,韩 榕*
(山西师范大学 生命科学学院,山西 临汾041004)
摘 要:以增强紫外线B (UV-B)处理的小麦幼苗叶肉细胞核为材料,以异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽
(FITC-Ph)荧光标记后,利用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜,对核内肌动蛋白丝 (F-actin)进行研
究。结果表明:小麦细胞核内确实存在F-actin;以FITC-Ph标记后用流式细胞仪检测显示,以10.08kJ
·m-2·d-1增强的UV-B处理后的小麦叶片细胞核内F-actin的含量升高;激光共聚焦技术显示细胞核内F-
actin的分布,发现小麦叶肉细胞核核仁处F-actin含量较高。推测可能是增强 UV-B辐射导致细胞质内F-
actin骨架断裂进入细胞核。究其具体作用还待进一步研究,该研究推测其与 “分束分裂”有关。
关键词:增强UV-B;小麦;原生质体;细胞核内F-actin;
中图分类号:Q942.4 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2013)05-0674-05
Influence of enhanced UV-B radiation on
F-actin of wheat mesophyl nucleus
CHEN Hui-Ze,HAN Rong*
(College of Life Sciences,Shanxi Normal University,Linfen 041004,China)
Abstract:Nuclei which were treated after enhanced UV-B radiation were taken as materials in this research.The nu-
cleus actin of wheat mesophyl was researched by fluorescent with FITC-ph and flow cytometry.The results showed
that F-actin truly existed in the wheat mesophyl nucleus,which increased in its content after treated with the en-
hanced UV-B radiation.The FITC-ph fluorescent labeling displayed that the distribution and the content of the nu-
cleus F-actin.We found that F-actin in the nucleolar was higher than the other areas in the wheat mesophyl nucleus.
We speculated these were closely with“partition-bundle division”.
Key words:enhanced UV-B radiation;wheat;protoplast;nucleus F-actin
大气臭氧层减薄造成太阳光中到达地面的
UV-B (280~320nm)辐射的增强。增强的UV-B
辐射直接影响生物的生活和生存,导致许多动植物
在形态结构、生理代谢、遗传特性和生长周期等方
面发生改变,进而对人类构成威胁 (韩榕,2002)。
一些理化因子能引起植物染色体畸变和细胞分裂的
异常。王晶等 (2009)研究表明,UV-B辐射延缓
了拟 南 芥 根 尖 细 胞 G1/S 期 的 转 变。韩 榕 等
(2002)在细胞水平的研究中,首次发现增强 UV-
B辐射会引起细胞发生异常有丝分裂现象,并将其
称为 “两极分束分裂”。Lenart et al. (2005)研
究表明,细胞核内的肌动蛋白丝涉及染色体的凝集
及细胞分裂过程。Koszul et al.(2008)的研究也
表明了细胞核内肌动蛋白参与了细胞周期的活动。
细胞核内染色体的集缩包装、DNA 转录成 RNA
和RNA向细胞质的运输等生命过程可能都需要收
收稿日期:2012-11-05 修回日期:2013-01-27
基金项目:国家自然科学基金 (30671061);山西省自然科学基金 (200811059)
作者简介:陈慧泽 (1986-),男,山西临汾人,在读博士,主要从事于植物细胞骨架方面的研究,(E-mail)michael3m@163.com。
*通讯作者:韩榕,博士,教授,主要从事于环境与植物的研究,(E-mail)hanrong@dns.sxnu.edu.cn。
缩蛋白的参加。人们推测肌动蛋白在细胞核中的存
在是起着马达分子的作用,参与染色体的集缩包装
和RNA的转录和运输 (金萍,2001)。
近年来,许多研究者相继报道肌动蛋白是细胞
核骨架的一种重要的组成成分 (李璟等,2001;王
华等,2001),Nickola et al.(1997)利用免疫胶
体金技术和放射免疫检测技术观察到核内存在肌动
蛋白,而且核内肌动蛋白与核骨架 DNA 紧密结
合。Kosta & Umberto(1993)利用胶体金技术结
合共聚焦显微镜观察,发现在CD-1鼠背根神经节
的神经元和PC12细胞核中含有肌动蛋白。在整个
核质中核肌动蛋白大量聚集在核仁外周,通过免疫
荧光技术可见在核仁周边聚集的是F-actin。另有
研究表明snRNP与肌动蛋白间的关系比未分化细
胞中的更为紧密。他们推测核内肌动蛋白能够捕获
新转录的 RNA,参与新转录的 RNA的转运。同
时,作者认为snRNP与核内肌动蛋白共同参与新
转录的RNA的转运,两者的关系是一个动态变化
的过程 (陈婷等,2001)。这些研究结果都表明了
核内肌动蛋白参与了细胞一系列的活动。
本研究以小麦叶肉细胞原生质体中分离的细胞
核为材料,通过研究正常对照组和增强UV-B辐射
处理组细胞核内F-actin的含量及荧光分布的变化,
为进一步揭示 “分束分裂”现象,阐明细胞分裂的
生物学机制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1材料
晋麦8号 (Triticum aestivum),由山西省农
科院小麦研究所提供。
1.2方法
1.2.1种子的萌发 选取籽粒饱满,大小均一的
小麦种子,5%次氯酸钠消毒30min,清水漂洗,
培养于盛有湿滤纸的培养皿内,25℃培养,每皿
50粒,每组3次重复。
1.2.2处理设置 实验共设对照 (CK)和UV-B
(B)两组处理。处理程序见表1。
1.2.3UV-B辐射处理 UV-B发生用 UV-B灯
(南京华强),将其垂直悬于培养皿的上方,通过调
整UV-B灯与植物培养皿之间的距离来控制并同时
测量UV-B辐射的强度。剂量采用10.08kJ·m-2
·d-1,相当于臭氧下降20%、UV-B增强40%的强
度 (RAF=2.0)。
表1 各处理组的设置及处理程序
Table 1 Estabishment and treatment
procedure of different groups
处理组
Treatment
光照 (h)
Light
增强UV-B辐射 (h)
Enhanced UV-B radiation
暗培养 (h)
Dark culture
CK 8 - 16
B 8 8 16
1.2.4小麦叶肉细胞原生质体的制备 参考刘炜
等 (2001)的方法略加修改,制得的原生质体常温
静置备用。具体步骤:取5日龄小麦幼苗第一片真
叶,蒸馏水冲洗干净,以标准液浸湿叶片平铺于洁
净的玻璃板上,用双面刀片迅速将其切成1~2
mm小细条,置于酶解液中在 (23±1)℃中暗解
3.5h。材料与酶解液之比为110 (W/V)。酶
解液组成为1.4%纤维素酶 R-10 (Celulase R-
10,Japan),0.15%果胶酶 Y-23 (99%Japan)
溶于标准液 (5 mmol/L CaCl2 ·2H2O,0.5
mol/L甘露醇,0.5mmol/L KH2PO4,2mmol/
L MgSO4,3mmol/L 2-氮吗啉乙烷磺酸 (MES,
Sigma),调pH至5.6配置而成。
1.2.5原生质体活力的鉴定 以终浓度为25
μmol/L的FDA (荧光素二乙酸酯)室温处理原生
质体10min,在激光共聚焦扫描显微镜下镜检,鉴
定原生质体的生活力。
1.2.6细胞核的提取 细胞核的提取以提取到的
小麦叶肉细胞原生质体为材料,经CSK缓冲液 [100
mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA
(pH 8.0),10 mmol/L PIPES (pH 6.8),300
mmol/L sucrose,1.2mmol/L PMSF,20mmol/L
DTT]破裂细胞膜,再经不连续的蔗糖密度梯度离心
法 (日立CP80MX离心机)收集纯化细胞核。
1.2.7细胞核的DAPI及FITC-Ph双重荧光标记
参考翟菁如等 (2010)的方法,略加优化,先将
纯化后的细胞核与FITC-Ph 37℃处理1h后,以
PBS (pH 7.4)冲洗2次,后加入DAPI标记液,
37℃暗孵育15min后进行观察。
1.2.8流式细胞仪检测样品处理 将纯化的细胞
核与FITC-Ph 37℃孵育1h,以 OTTO I缓冲液
(0.1mol/L柠檬酸,0.5% 吐温-20)稀释,各
处理组加50μl FITC-Ph,37℃避光孵育1h后,
轻微摇匀,上机检测。
1.2.9图象的观察及处理 采用激光共聚焦扫描显
微镜 (Olympus FV1000)观察,图象采集选用512×
512像素,图象的后期排版用Photoshop CS5软件。
5765期 陈慧泽等:增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响
2 结果与分析
2.1原生质体活力的检测
酶解产生的原生质体为表面十分光滑的球状体
(图版Ⅰ:1)。对原生质体活力的鉴定采用荧光指
示剂FDA标记法,结果发现,在488nm激发下,
酶解后10h大部分原生质体仍显示绿色荧光,表
明原生质体保持了很高的活性 (图版Ⅰ:2),可以
进行后续试验。
2.2提取到的细胞核
以蔗糖密度梯度离心法提取到大量完整的细胞
核。用DAPI染色后在共聚焦下观察到细胞核圆
润,杂质较少 (图版Ⅰ:3-6分别显示了在共聚焦
显微镜下观察到的 DAPI单通道图像及透射 DIC
图像)。
2.3流式细胞仪检测
以FITC-Ph标记后的细胞核经纯化后,用
OTTO I缓冲液稀释后,上流式细胞仪检测。设定
检测的细胞总数为30 000个,检测结果如图版Ⅰ:
17、18。
表2 流式细胞仪检测不同处理组细胞核荧光强度
Table 2 Different treatment groups by flow
cytometry nucleus fluorescence intensity
分组Groups
设定区域 (101~103)
细胞核百分比 (%)
Percentage of nucleus area
平均荧光强度
Mean fluorescence
intensity
CK 77.19 59.5
B 77.21 71.74
在101~103 的区域内,CK组与B组细胞核数
量约占总细胞核的77%,但CK组平均荧光强度
为59.5,明显低于B组的平均荧光强度。表明相
同数量的细胞核经增强UV-B辐射处理后,其内的
F-actin含量升高。
2.4细胞核内F-actin的荧光标记
以DAPI和FITC-Ph对细胞核进行双重荧光
标记,细胞核内大范围显示绿色荧光,且核仁处较
亮,表明细胞核内F-actin分布较广,核仁处含量
相对较高 (图版Ⅰ:7-14)。以 Olympus FV软件
分析得到,B组小麦叶肉细胞核内绿色荧光强度较
CK组强 (图版Ⅰ:15、16)。通过对标记得到的
图像进行单位面积光积分分析 (表3)可知,增强
UV-B辐射处理组小麦细胞核内聚合态的肌动蛋白
丝含量高,与流式细胞仪检测结果一致。
表3 不同处理组细胞核进行荧光标记后,第二通道
(特异显示F-actin)图像的单位面积光积分量
Table 3 The integration of the pure area of CHS2
(especialy show the F-actin)after different treatment
groups were given fluorescent labeling
分组
Groups
通道2的范围
CHS2range
通道2的荧光强度
CHS2integration
平均荧光强度
Integration/Range
CK 3983.00 25662381.00 6442.978
B 1639.00 14025500.00 8557.352
3 结论与讨论
韩榕 (2002)首次发现增强UV-B辐射后的小
麦体细胞内存在 “分束分裂”的现象,并对此进行
了多方位的研究。有关细胞核内肌动蛋白的研究近
年来取得了很大进展,证明肌动蛋白在细胞核内发
挥了重要作用 (郭爱华等,2010;张娟等,2008)。
本研究结果显示,经增强UV-B辐射处理后的
小麦叶肉细胞核内F-actin含量升高,推测聚合态
的肌动蛋白纤丝作为一种动力蛋白,可能参与了染
色质凝缩及染色体移动的过程。韩榕等 (2002)的
研究表明,在出现 “分束分裂”的细胞中,细胞能
够把染色体拉向两极,说明纺锤体没有受到破坏。
Lenart et al.(2005)的研究表明,在核膜破裂的
瞬间,核区肌动蛋白浓度显著增大,且核内单体的
肌动蛋白在核内已经聚集为具有收缩功能的丝状结
构。陈颖等 (2003)报道,在网球花有丝分裂的过
程中,肌动蛋白丝将纺锤丝和染色体包裹在其内。
结合本研究,我们推测,在染色质凝缩成染色体的
过程中,肌动蛋白在核区广泛聚集,将染色质包裹
后进入细胞分裂周期。由于受到增强UV-B辐射的
影响,细胞质内肌动蛋白丝断裂后进入细胞核,核
区F-actin含量升高,可能将凝缩的染色体 “分团”
包裹。这种作用可能会使细胞逃过周期检验点的检
查而进入到分裂后期,这可能是造成 “分束分裂”
的原因之一。
本研究还发现,增强UV-B辐射处理的小麦叶
肉细胞的细胞核通常具有多个核仁。通过对细胞核
进行DAPI和ph-FITC双重标记,用激光共聚焦
采集图像发现,细胞核仁处绿色荧光较强,由于
phFITC是F型肌动蛋白的特异性标记物,说明核
仁处存在浓度较高的聚合态的肌动蛋白丝。翁朝红
等通过银染法表明大黄鱼的倍性和核仁具有良好的对
应关系。结合本研究推测,多核仁现象是不是 “分
676 广 西 植 物 33卷
图版Ⅰ 1.酶解法制的的小麦叶肉细胞的原生质体 (bar=30μm);2.以FDA染色法检测原生质体活力 (bar=30μm);3,4.通过密度梯
度离心得到的小麦叶肉细胞细胞核 (3所示以DAPI标记的细胞核;4显示细胞核在透射DIC通道下所成的图像)(bar=12μm);5,6.单个
细胞核所成的像 (5显示以DAPI标记的单个细胞核在CLSM下成的像,bar=10μm;6显示单个细胞核在透射DIC通道下成的像,bar=10
μm);7-10.以DAPI和ph-FITC双重标记的正常CK组的细胞核 (图像分别为在以下通道所成的像:DAPI通道、ph-FITC通道、DAPI+
ph-FITC通道、DAPI+ph-FITC+透射DIC通道)(bar=10μm);11-14.以DAPI和ph-FITC双重标记的UV-B处理组的细胞核 (图像分别
为在以下通道所成的像:DAPI通道、ph-FITC通道、DAPI+ph-FITC通道、DAPI+ph-FITC+透射DIC通道)(bar=10μm);15-16.不同
处理组细胞核内F-actin含量 (15显示的是CK组;16显示的是B组);17-18.不同处理组细胞核经流式细胞仪检测得到的结果 (17为CK
组;18为B组;横轴表示荧光强度,纵轴表示细胞核数量)。
PlateⅠ 1.Wheat mesophyl protoplasts were obtained by enzymatic method(bar=30μm);2.Testing the protoplast viability by FDA staining
(bar=30μm);3,4.Wheat diachyma cel nuclei obtained by density gradient centrifugation(3 shows nucleus labeled by DAPI;4 shows nucleus
image under the DIC channel)(bar=12μm);5,6.Images of single nucleus(5shows nucleus labeled by DAPI,bar=10μm;6shows the single
nucleus image under the DIC channel,bar=10μm);7-10.Nuclei of Group CK were doubly labeled by DAPI and ph-FITC(images from the sepa-
rately channel:channel of DAPI,channel of ph-FITC,channel of DAPI+ph-FITC,channel of DAPI+ph-FITC+DIC)(bar=10μm);11-14.
Nuclei of Group B were doubly labeled by DAPI and ph-FITC(images from the separately channel:channel of DAPI,channel of ph-FITC,chan-
nel of DAPI+ph-FITC,channel of DAPI+ph-FITC+DIC)(bar=10μm);15-16.Contents of F-actin in diferent groups(15shows Group CK;
16shows Group B).17-18.Diferent treatment groups by flow cytometry nucleus fluorescence intensity(17 shows Group CK;18 shows Group B;
the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of the vertical axis shows the number of nuclei).
7765期 陈慧泽等:增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响
束分裂”现象的一种早前期表现形式?这些都需要
引起重视,进行进一步的研究与探讨。
致谢 感谢韩榕教授的指导,感谢山西师范大
学分子细胞研究室提供的便利条件。
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