全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｊｕｌ. ２０１６ꎬ ３６(７):８０６－８１１
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５０２００２
张恩慧ꎬ王晓云ꎬ覃子海ꎬ等. 广西普通油茶种质资源遗传多样性的 ＳＳＲ分析[Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(７):８０６－８１１
ＺＨＡＮＧ ＥＨꎬＷＡＮＧ ＸＹꎬＱＩＮ ＺＨꎬｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(７):８０６－８１１
广西普通油茶种质资源遗传多样性的 ＳＳＲ分析
张恩慧１ꎬ 王晓云１ꎬ 覃子海２ꎬ 赵文东３ꎬ 韦长江３ꎬ 王鹏良２∗
( １. 江西中医药大学 江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心ꎬ 南昌 ３３０００４ꎻ ２. 广西林业科学研究院 广西优良用材林
资源培育重点实验室ꎬ 广西特色经济林开发和利用重点实验室ꎬ 南宁 ５３０００２ꎻ ３. 广西国有三门江林场ꎬ 广西 柳州 ５４５００６ )
摘　 要: 普通油茶(Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ)是我国分布最广、产量最多的山茶属中一个重要油料树种ꎮ 广西是普通
油茶的重要分布区ꎬ种质资源十分丰富ꎮ 为深入了解广西普通油茶种质资源的遗传变异ꎬ服务于种质保存和
品种选育ꎬ该研究首先对已开发的 ＳＳＲ分子标记进行多态性筛选和评价ꎬ在此基础上利用多态性较高的引物ꎬ
对 ９７份广西有代表性的普通油茶种质资源进行遗传多样性分析ꎮ 结果表明:(１) 在已开发的 １０对油茶 ＳＳＲ
分子标记中ꎬ７对能稳定扩增且表现为共显性ꎬ２ 对扩增不稳定ꎬ另外 １ 对无法扩增出产物ꎮ (２) ７ 对共显性
ＳＳＲ标记总共检测到 ３３个等位基因ꎬ每对标记检测到等位基因数目的变化范围为 ３~６个ꎬ平均每个位点等位
基因数为 ４.７１４ ３个ꎬ有效等位基因数目的变化范围为 ２.０８４ ２~４.３１４ ８ꎬ平均有效等位基因数为 ２.８２８ ８ꎻ基因
多样性变化范围为 ０.５２０ ２~０.７６８ ２ꎬ平均每个位点基因多样性为 ０.６２８ １ꎮ (３) 参试群体中绝大多数位点未处
于 Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡ꎬ存在遗传结构ꎻ观测杂合度和期望杂合度的变化范围分别为 ０.４１３ ０ ~ ０.６７０ １ 和
０.５２３ ３~０.７７２ ４ꎬ其平均值分别为 ０.５６９ ８和 ０.６３１ ６ꎮ (４) 种质资源间遗传距离变化范围为 ０.０５~ ０.７９１ ７ꎬ平
均遗传距离为 ０.３５４ ５ꎻＵＰＧＭＡ聚类显示相同来源的种质资源无法聚成一类ꎬ在同一聚类分支上混有不同来
源的种质资源ꎮ 这表明已开发的油茶 ＳＳＲ分子标记适用于广西普通油茶ꎬ广西普通油茶种质资源拥有较丰富
的遗传多样性ꎮ 该研究结果为广西普通油茶资源的深度开发和高效利用提供了科学依据ꎮ
关键词: 普通油茶ꎬ ＳＳＲ标记ꎬ 遗传多样性ꎬ 遗传结构ꎬ 复等位基因
中图分类号: Ｑ９４９　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０７￣０８０６￣０６
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ
ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ
ＺＨＡＮＧ Ｅｎ￣Ｈｕｉ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ￣Ｙｕｎ１ꎬ ＱＩＮ Ｚｉ￣Ｈａｉ２ꎬ ＺＨＡＯ Ｗｅｎ￣Ｄｏｎｇ３ꎬ
ＷＥＩ Ｃｈａｎｇ￣Ｊｉａｎｇ３ꎬ ＷＡＮＧ Ｐｅｎｇ￣Ｌｉａｎｇ２∗
( １. Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｍｉｎｏｒｉｔｙ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ
Ｊｉａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｔｉｍｂｅｒ Ｔｒｅｅｓ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｎｏｎ￣ｗｏｏｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ＆ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｓｔａｔｅ￣ｏｗｎｅｄ Ｓａｎｍｅｎｊｉａｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｆａｒｍꎬ Ｌｉｕｚｈｏｕ ５４５００６ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｏｉｌ ｔｅａ (Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ) ｉｓ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｉｌｔｒｅｅ ｉｎ ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖａｓｔｅｓｔ ａｒｅａ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｒｅａ ｏｆ ｏｉｌ ｔｅａꎬ
ａｂｏｕｎｄｓ ｉｎ ｏｉｌ ｔｅａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｏｉｌ ｔｅａ ｉｎ Ｇｕａｎ￣
ｇｘｉ ｆｏｒ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎꎬ １０ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ
收稿日期: ２０１５￣０５￣０２　 　 修回日期: ２０１５￣０７￣１８
基金项目: 国家自然科学基金(３１４６０２０８)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ(３１４６０２０８)]ꎮ
作者简介: 张恩慧 (１９９０￣)ꎬ女ꎬ河南宝丰人ꎬ在读硕士研究生ꎬ主要研究方向为药用植物分子生物学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)９９３５８７０２８＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 王鹏良ꎬ博士ꎬ高级工程师ꎬ研究方向为植物分子育种ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｐｅｎｇｌｉａｎｇ＿ｗａｎｇ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ９７ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｖｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｏｉｌ ｔｅａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ. Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: Ｆｉｒｓｔｌｙꎬ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓꎬ ｓｅｖｅｎ ｃｏｄｏ￣
ｍｉｎａｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｓｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｃｏｎｓꎬ ａｎｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｃｏｎｓꎻ ｔｈｅ
ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｏｎｅ ｙｉｅｌｄｅｄ ｎｏ ｂａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｌ. Ｓｅｃｏｎｄｌｙꎬ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ３３ ａｌｌｅｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ９７ ｏｉｌ ｔｅａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅ￣
ｓｏｕｒｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｖｅｎ ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ ＳＳＲｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ｗａｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｓｉｘ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ４.７１４ ３ ｆｏｒ ｅｖ￣
ｅｒｙ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓꎻ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ２.０８４ ２ ｔｏ ４.３１４ ８ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ２.８２８ ８ꎬ ａｎｄ ｔｈｅ
ｇｅｎｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０.５２０ ２ ｔｏ ０.７６８ ２ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ０.６２８ １. Ｔｈｉｒｄｌｙꎬ ａｌｍｏｓｔ ｌｏｃｉ ｏｕｔ ｏｆ Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｑｕｉ￣
ｌｉｂｒｉｕｍ ｍｅａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ０.４１３ ０－
０.６７０ １ ａｎｄ ０.５２３ ３－０.７７２ ４ꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅｓ ｏｆ ０.５６９ ８ ａｎｄ ０.６３１ ６. Ｆｉｎａｌｌｙꎬ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｗａｓ ０.０５－０.７９１ ７ꎬ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ０.３５４ ５. Ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＵＰＧＭＡ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅ￣
ｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｃｅｓ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｒａｎｃｈꎬ ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄꎬ ｔｈｅ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ ｏｎｅ ｂｒａｎｃｈ ｃａｍｅ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｃｅｓ. Ｔｈｅ ｆｏｒｅｇｏｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｖｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＳＳＲｓ ｏｆ
ｏｉｌ ｔｅａ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏ ｗｏｒｋ ｉｎ ｔｈｅ ｏｉｌ ｔｅａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ｗａｓ
ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ. Ｔｈｏｓｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｅｐ ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｏｉｌ ｔｅａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｏｉｌ ｔｅａ (Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ)ꎬ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒꎬ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｌｅｌｅｓ
　 　 油茶是山茶属种子含油量高、有栽培价值物种
的统称 (陈永忠等ꎬ ２００５ａ)ꎮ 普通油茶 (Ｃａｍｅｌｌｉａ
ｏｌｅｉｆｅｒａ)是油茶中分布面积最广、 总产量最多的一
个物种ꎬ常用于榨取高质量的食用茶油ꎻ此外ꎬ榨油
剩余物可进一步加工ꎬ用作化工、纺织和农药等行业
的原材料ꎮ 其用途广、价值高(姚小华等ꎬ ２０１２)ꎮ
油茶是我国特有的重要油料树种ꎬ主要分布于我国
南方 １８个省市区(庄瑞林ꎬ ２００７)ꎮ 目前ꎬ普通油茶
的遗传多样性研究逐渐开展ꎮ 陈永忠等(２００５ｂ)利
用 ＲＡＰＤ (Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ)标记
鉴定油茶湘林系列的优良无性系ꎻ林萍等(２０１０)和
彭绍峰等(２０１１)分别利用 ＳＲＡＰ (Ｓｅｑｕｅｎｃｅ￣Ｒｅｌａｔｅｄ
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)标记对长林系列 １２ 个优良
无性系和 １４ 个高产良种开展分子鉴定ꎻ黄永芳等
(２００６)利用 ＲＡＰＤ 技术对湖南、广东和广西三省
(区)的部分油茶种质资源进行遗传多样性分析ꎻ王
保明等(２００８)和于小玉等(２０１３)分别利用 ＩＳＳＲ
(Ｉｎｔｅｒ￣Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ)技术对湖南和湖北
等部分品种开展遗传多样性分析ꎻ张婷等(２０１１ａꎬ
ｂ) 分别利用 ＳＲＡＰ 和 ＡＦＬＰ ( Ａｍｐｌｉｆｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)两种标记分别对湖北野生油
茶资源开展遗传多样性研究ꎬ这为普通油茶遗传资
源的开发奠定了坚实基础ꎮ
广西是油茶的最重要产区之一ꎬ种质资源十分
丰富(张乃燕ꎬ ２００３)ꎮ 然而ꎬ到目前为止ꎬ仅见王鹏
良等(２０１４)利用 ＳＲＡＰ 分子标记对广西普通油茶的
遗传多样性开展初步分析ꎮ ＳＲＡＰ 标记是显性分子
标记ꎮ 与 ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ 和 ＡＦＬＰ４ 种显性分子
标记相比ꎬＳＳＲ为共显性标记ꎬ能区分纯合子和杂合
子ꎬ而且能检测复等位基因ꎬ在遗传多样性检测中更
具优势ꎮ 为了更加深入地了解广西普通油茶的遗传
变异ꎬ本研究采用已开发的油茶 ＳＳＲ 分子标记对广
西普通油茶种质资源的遗传多样性开展研究ꎬ为广
西普通油茶种质资源更加合理、高效地开发利用提
供了可靠的科学依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
从广西各地搜集的具有代表性的 ９７ 份普通油
茶种质资源ꎬ均种植于柳州市城中区柳东乡广西国
有三门江林场三门江分场的湖广坪林区ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 普通油茶基因组 ＤＮＡ 提取 　 以 ９７ 份种质资
源的嫩叶为材料ꎬ利用改良的 ＣＴＡＢ￣ＳＤＳ法(何卫龙
等ꎬ ２０１３)提取普通油茶基因组 ＤＮＡꎬ并稀释成 ２０
ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ保存于－２０ ℃冰箱ꎬ待用ꎮ
１.２.２ ＰＣＲ反应及产物检测　 ＰＣＲ 反应体系参照王
鹏良等 ( ２０１４):模板 ＤＮＡ １ μＬꎬ ２. ５ ｍｍｏｌ 􀅰 Ｌ￣１
ｄＮＴＰｓ １ μＬꎬ１０ × Ｂｕｆｆｅｒ １ μＬꎬ１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１上下游
引物各 ０.４ μＬꎬＴａｑ 聚合酶 １.５ Ｕꎬ用 ｄｄＨ２Ｏ 补足到
１０ μＬ体系ꎮ ＳＳＲ 反应程序参照彭婵等(２０１３):预
变性 ９４ ℃ ４ ｍｉｎꎻ变性 ９４ ℃ ３０ ｓꎬ退火 ５９ ℃ ３０ ｓ
(Δ ℃ ＝－１ ℃)ꎬ延伸 ７２ ℃ ４５ ｓꎬ９ 个循环ꎻ变性 ９４
７０８７期　 　 　 　 　 　 　 　 张恩慧等: 广西普通油茶种质资源遗传多样性的 ＳＳＲ分析
℃ ３０ ｓꎬ退火 ５５ ℃ ３０ ｓꎬ 延伸 ７２ ℃ ３０ ｓꎬ２１ 个循
环ꎬ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎬ４ ℃保存ꎮ ＰＣＲ反应结束后ꎬ
在 ｅｆｆｅｎｄｏｒｆ管中加入 ６×Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬꎬ混合均
匀ꎬ吸取 ２ μＬ 在 ８.０％聚丙烯胺凝胶上 １８０ Ｖ 电压
下电泳 １.５ ｈꎬ再进行快速银染ꎬ显影ꎬ照相ꎮ
１.２.３ ＳＳＲ引物多态筛选及群体扩增　 从 ９７ 个参试
样本中随机抽取 ８ 个样本作为模板ꎬ对彭婵等
(２０１３)的 １０对引物(表 １)进行多态性筛选ꎮ 在此
基础上ꎬ将筛选到的多态引物用于群体的扩增ꎮ
１.３ 谱带记录和数据分析
同一引物扩增的迁移率相同的为同一等位基
因ꎬ据此原则ꎬ对所得图片进行人工读带ꎬ从小到大
按照 ＡꎬＢꎬＣꎬＤꎬＥ􀆺􀆺进行记录ꎬ将扩增所得的纯合
子用相同字母表示ꎬ例如记为“ＡＡ”或“ＢＢ”ꎬ将杂合
子用不同字母表示ꎬ例如记为“ＡＢ”ꎮ 利用 ＰｏｐＧｅｎｅ
１.３２软件分析等位基因变异总数(Ａ)ꎬ有效等位基
因数(Ｎｅ)ꎬ观测杂合度(Ｈｏ)ꎬ 期望杂合度(Ｈｅ)ꎬ
固定指数 ( Ｆ)及 Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 平衡检测ꎻ利用
ＰｏｗｅｒＭａｒｋｅｒ Ｖ３.２５软件(Ｌｉｕ ＆ Ｍｕｓｅꎬ ２００５)计算基
因多样性(Ｈ)ꎬ多态信息含量指数 ( Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ＰＩＣ)ꎬ样本间的遗传距离ꎬ按照
非加权类平均法(ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ￣ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ
ａｒｉｔｈｅｍｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅꎬ ＵＰＧＭＡ)进行样本间的聚类分
析ꎬ利用 ＭＥＧＡ６.０ (Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ａｎａｌｙｓｉｓ)软件生成聚类图ꎮ
２　 结果与分析
２.１ ＳＳＲ引物筛选和评价
本研究根据彭婵等(２０１３)已发表的 １０ 对油茶
ＳＳＲ序列信息合成引物ꎬ在参试群体中随机抽取 ８
个样本作为模板开展多态引物筛选ꎮ 结果表明 ７ 对
引物能稳定扩增出产物ꎬ且呈多态性ꎬ表现为共显
性ꎬ另 ２对(ＮＪＦＵＣ５７和 ＮＪＦＵＣ１２９)扩增不稳定(表
１)ꎬ仅有 １对引物(ＮＪＦＵＣ６９)无法扩增出产物ꎮ
２.２ 遗传多样性分析
从表 ２可以看出ꎬ７对引物总共检测到 ３３ 个等
位基因ꎬ每个位点等位基因数目变化范围为 ３~６ꎬ其
中 ＮＪＦＵＣ５３、ＮＪＦＵＣ１５７和 ＮＪＦＵＣ８３３为 ６ 个等位基
因ꎬＮＪＦＵＣ７８７ 为 ３ 个等位基因ꎬ平均每个位点等位
基因数目为 ４.７１４ ３ꎻ有效等位基因数最高为 ４.３１４ ８
(ＮＪＦＵＣ１５７)ꎬ最低值为 ２.０８４ ２(ＮＪＦＵＣ２７３)ꎬ平均
有效等位基因数为２.８２８ ８ꎻ基因多样性的变化范围
为 ０.５２０ ２~０.７６８ ２ꎬ平均每个位点的基因多样性为
０.６２８ １ꎻ多态信息含量(ＰＩＣ)的变化范围为 ０.４７５ １~
０.７３１ ８ꎬ平均每个位点的多态信息含量为 ０.５７３ ７ꎮ
２.３ 遗传结构和杂合度分析
表 ３结果表明ꎬ７个位点中ꎬ ６个 ＳＳＲ位点不处
于 Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 平衡ꎬ仅 １ 个位点处于 Ｈａｒｄｙ￣
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡ꎬ这表明参试群体存在遗传结构ꎮ 同
时利用 ＳＳＲ标记检测了观测杂合度和期望杂合度ꎬ
它们的变化范围分别为 ０.４１３ ０~０.６７０ １和 ０.５２３ ３~
０.７７２ ４ꎬ平均每个位点的观测杂合度和期望杂合度
分别为 ０.５６９ ８和 ０.６３１ ６ꎮ 通过对固定指数分析发
现ꎬＮＪＦＵＣ５３、ＮＪＦＵＣ２７３、ＮＪＦＵＣ７８７和 ＮＪＦＵＣ８３３ 四
个位点的固定指数 Ｆ 值为负数ꎬ其余 ３ 个位点的固
定指数 Ｆ 值为正数ꎮ 其中ꎬＮＪＦＵＣ５３、ＮＪＦＵＣ１５７、
ＮＪＦＵＣ６０１ ３个位点的数值较大ꎮ ＮＪＦＵＣ５３ 的固定
指数 Ｆ 值 (表 ３ ) 表明ꎬ 该位点杂合子过多ꎻ
ＮＪＦＵＣ１５７和 ＮＪＦＵＣ６０１ 表明这 ２ 个位点纯合子过
多ꎻ其余 ４个位点纯合子和杂合子比例与期望比例
接近ꎮ 固定指数的平均值为 ０.０７６ ４ꎬ说明纯合子略
多ꎬ但接近 Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡ꎮ
２.４ 遗传距离和聚类分析
根据 ７对 ＳＳＲ标记扩增得到的遗传信息ꎬ采用
ＰｏｗｅｒＭａｒｋｅｒ Ｖ３.２５ 计算研究种质资源之间的遗传
距离ꎬ种质资源间最大的遗传距离为 ０.７９１ ７ꎬ最小
的遗传距离为 ０.０５ꎬ平均遗传距离为 ０.３５４ ５ꎮ 在种
质资源间遗传距离最大的有 ３ 对ꎬ分别是 ５６(ＦＭ)
与 １１１(ＢＳ)、５６( ＦＭ)与 １４６(Ｇ)、９３( ＳＢＬ)与 １５５
(ＢＳ)ꎻ距离最小遗传的为 ３３(ＬＮ)与 １６４(ＱＳ)ꎮ 在
对 ９７份种质资源遗传距离计算的基础上ꎬ按照 ＵＰ￣
ＧＭＡ 方法对参试种质资源开展聚类分析ꎬ再利用
ＭＥＧＡ６.０软件生成聚类图ꎮ 从图 １ 可以看出ꎬ相同
来源的种质资源不能很好地聚类成一个分支ꎬ同时
在同一聚类分支上还混有一个或多个不同来源的种
质资源ꎬ从而形成了复杂的遗传关系ꎮ
３　 讨论
ＳＳＲ分子标记重复性好、呈共显性、分布均匀且
能检测复等位基因(Ｖａｒｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌꎬ ２００５)ꎮ 但油茶
中 ＳＳＲ分子标记开发和应用的研究进展缓慢ꎬ范小
宁等(２０１１)建立了油茶 ＳＳＲ 的反应体系ꎬ史洁等
(２０１２)和温强等(２０１３)分别分析油茶不同转录组
的 ＳＳＲ分布特征ꎬ但未开发 ＳＳＲ分子标记ꎮ 目前ꎬ
８０８ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 １　 本研究所用引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
序号
Ｎｏ.
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
正向引物序列(５′￣３′)
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
反向引物序列(５′￣３′)
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
１ ＮＪＦＵＣ５３ ＴＧＣＣＣＴＡＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴ
２ ＮＪＦＵＣ５７ ＡＴＡＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＴ ＡＴＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡ
３ ＮＪＦＵＣ６９ ＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＡＧＴ ＡＡＴＡＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡ
４ ＮＪＦＵＣ１２９ ＴＡＡＣＴＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＴＡ ＧＡＴＧＧＴＴＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡ
５ ＮＪＦＵＣ１５７ ＧＴＴＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧ ＡＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧ
６ ＮＪＦＵＣ２４３ ＴＧＴＡＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＣＧ ＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧＡ
７ ＮＪＦＵＣ２７３ ＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧ ＡＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴ
８ ＮＪＦＵＣ６０１ ＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＴＡＴＧＧ ＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＧＣ
９ ＮＪＦＵＣ７８７ ＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴ ＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＡＧＧＡＴ
１０ ＮＪＦＵＣ８３３ ＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴ ＧＴＧＧＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＡ
表 ２　 遗传多样性信息
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
标记名称
Ｍａｒｋｅｒ
ｎａｍｅ
等位基因
数目
Ａｌｌｅｌｅ
ｎｕｍｂｅｒ
(Ａ)
有效等位
基因数
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅ
ｎｕｍｂｅｒ
(Ｎｅ)
基因
多样性
Ｇｅｎｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
(Ｈ)
多态信息
含量
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ
(ＰＩＣ)
ＮＪＦＵＣ５３ ６ ２.５１３ １ ０.６０２ １ ０.５５９ ７
ＮＪＦＵＣ１５７ ６ ４.３１４ ８ ０.７６８ ２ ０.７３１ ８
ＮＪＦＵＣ２４３ ４ ３.１０８ ４ ０.６７８ ３ ０.６１３ ２
ＮＪＦＵＣ２７３ ４ ２.０８４ ２ ０.５２０ ２ ０.４７５ １
ＮＪＦＵＣ６０１ ４ ２.９９０ ８ ０.６６５ ６ ０.５９５ ０
ＮＪＦＵＣ７８７ ３ ２.５３５ １ ０.６０５ ５ ０.５２１ ８
ＮＪＦＵＣ８３３ ６ ２.２５５ １ ０.５５６ ６ ０.５１９ ６
平均 Ｍｅａｎ ４.７１４ ３±
１.２５３ ６
２.８２８ ８±
０.７５０ ８
０.６２８ １±
０.０８３
０.５７３ ７±
０.０８４ ２
仅彭婵等(２０１３)实质上利用 ＳＳＲ 对湖北油茶种质
的遗传多样性开展了研究ꎮ 将彭婵等(２０１３)报道
的 ＳＳＲ标记用于本研究ꎬ发现 １０ 对 ＳＳＲ 引物中ꎬ２
对扩增不稳定ꎬ１ 对无法扩增出产物ꎮ 这可能由于
引物结合位点的缺失、插入、替换等突变或不同引物
扩增效率不同造成的(Ｓａｈａ ｅｔ ａｌꎬ ２００４)ꎮ
７对稳定、多态的共显性 ＳＳＲ 标记总共检测到
３３个等位基因ꎬ每个位点等位基因数目为 ３ ~ ６ 个ꎬ
平均等位基因数目为 ４.７１４ ３ꎬ存在较丰富的遗传多
样性ꎻ但与陈赢男等(２０１４)和彭婵等(２０１３)的报道
表 ３　 遗传结构和杂合度信息
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ
ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
标记名称
Ｍａｒｋｅｒ
ｎａｍｅ
Ｈａｒｄｙ￣
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
平衡检测
Ｈａｒｄｙ￣
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
ｅｑｕｉｌｂｒｉｕｍ ｔｅｓｔ
观测杂合度
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ
Ｈｅｔｅｒｏｚｙ￣
ｇｏｓｉｔｙ
(Ｈｏ)
期望杂合度
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ
Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ
(Ｈｅ)
固定指数
Ｆｉｘａｔｉｏｎ
Ｉｎｄｅｘ
(Ｆ)
ＮＪＦＵＣ５３ ２７.６４５ １∗ ０.６６３ ０ ０.６０５ ４ ￣０.１０１ ３
ＮＪＦＵＣ１５７ ５４.３８２ ６∗∗ ０.５０５ ４ ０.７７２ ４ ０.３４２ ２
ＮＪＦＵＣ２４３ １４.７５５ ３∗ ０.６７０ １ ０.６８１ ８ ０.０１２ １
ＮＪＦＵＣ２７３ １９.５５５ ３∗∗ ０.５３５ ７ ０.５２３ ３ －０.０２９ ８
ＮＪＦＵＣ６０１ ４１.４０６ ０∗∗ ０.４１３ ０ ０.６６９ ３ ０.３７９ ５
ＮＪＦＵＣ７８７ ０.６８４ １ ０.６２６ ５ ０.６０９ ２ －０.０３４ ６
ＮＪＦＵＣ８３３ ２６.１５８ ３∗ ０.５７５ ０ ０.５６０ １ －０.０３３ １
平均 Ｍｅａｎ － ０.５６９ ８±
０.０９３ ０
０.６３１ ６±
０.０８３ ５
０.０７６ ４±
０.１９７ ４
　 注: ∗∗表示似然比检测达极显著水平ꎬ∗表示似然比检测达显著水平ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: ∗∗ｄｅｎｏｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｅｖｅｌ ａｔ ０.０１ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙꎻ ∗ｄｅｎｏｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｅｖｅｌ
ａｔ ０.０５ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ.
相比ꎬ本研究等位基因数目相对略少ꎬ这可能由于所
研究材料来自多个省ꎬ遗传基础较宽所致ꎮ
通过对本研究参试的种质资源开展 Ｈａｒｄｙ￣
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡检测ꎬ发现 ＮＪＦＵＣ７８７ 位点处于平衡
状态ꎬ而其余 ６ 位点均处于不平衡状态ꎮ 这说明参
试群体总体上存在遗传结构ꎬ很可能是由于在种质
资源收集过程的选择因素造成的ꎮ 本研究的平均观
测杂合度为 ０.５７３ ７ꎬ期望杂合度为 ０.６３１ ６ꎬ 尽管比
９０８７期　 　 　 　 　 　 　 　 张恩慧等: 广西普通油茶种质资源遗传多样性的 ＳＳＲ分析
图 １　 参试材料的聚类图　 ＬＮ. 立农ꎻ ＤＹ. 都阳ꎻ ＦＬ. 富林ꎻ ＨＢ. 黄宝ꎻ ＺＰ. 古袍ꎻ ＦＭ. 枫木ꎻ ＴＭ. 铁帽ꎻ ＰＬ. 平乐ꎻ ＲＹ. 仁勇ꎻ
ＢＹ. 半月ꎻ ＱＴ. 七团ꎻ ＳＢＬ. 三伯岭ꎻ ＳＤ. 三道ꎻ ＢＳ. 百色ꎻ ＴＹ. 田阳ꎻ Ｇ. 桂ꎻ Ｌ. 龙ꎻ ＳＭＪ. 三门江ꎻ ＱＳ. 区所ꎻ ＷＭ. 武鸣ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ 　 ＬＮ. Ｌｉｎｏｎｇꎻ ＤＹ. Ｄｕｙａｎｇꎻ ＦＬ. Ｆｕｌｉｎꎻ ＨＢ. Ｈｕａｎｇｂａｏꎻ ＺＰ. Ｚｕｏｐａｏꎻ ＦＭ. Ｆｅｎｇｍｕꎻ
ＴＭ. Ｔｉｅｍａｏꎻ ＰＬ. Ｐｉｎｇｌｅꎻ ＲＹ. Ｒｅｎｙｏｎｇꎻ ＢＹ. Ｂａｎｙｕｅꎻ ＱＴ. Ｑｉｔｕａｎꎻ ＳＢＬ. Ｓａｎｂｏｌｉｎｇꎻ ＳＤ. Ｓａｎｄａｏꎻ ＢＳ. Ｂａｉｓｅꎻ ＴＹ. Ｔｉａｎｙａｎｇꎻ Ｇ. Ｇｕｉꎻ Ｌ. Ｌｏｎｇꎻ
ＳＭＪ. Ｓａｎｍｅｎｊｉａｎｇꎻ ＱＳ. Ｑｕｓｕｏꎻ ＷＭ. Ｗｕｍｉｎｇ.
之前的报道(彭婵等ꎬ ２０１３)略低ꎬ也反映出了普通
油茶的杂合度较高ꎮ 这与油茶异交的交配特性相吻
合(向晖等ꎬ ２０１３ꎻ 庄瑞林ꎬ ２００７)ꎬ也是普通油茶杂
种优势产生的基础ꎮ 同时ꎬ不同位点间的观测杂合
度、期望杂合度及固定指数 Ｆ 都表明ꎬ位点间存在
不同的选择压力ꎮ 在不同的选择压力下ꎬ位点的进
化速度也不相同ꎮ 因此ꎬ尽管本研究所用的材料基
本一致ꎬ但聚类结果与 ＳＲＡＰ 标记 (王鹏良等ꎬ
２０１４)有较大差异ꎬ这可能与 ＳＳＲ 分子标记有关ꎬ
ＳＳＲ标记的多态是由滑动和重组两个主要原因产生
的ꎬ另外伴随突变ꎬＳＳＲ 的进化比较复杂ꎬ因此不一
定能很好地反映出油茶的亲缘关系 ( Ｅｌｌｅｇｒｅｎꎬ
２００４ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌꎬ ２００２)ꎮ 但仍然有一点与 ＳＲＡＰ 标记
结果一致ꎬ即种质资源聚类结果无法与种源相匹配ꎮ
此外ꎬ在本研究中发现最大遗传距离有 ３对ꎬ这
可能是由于采用的分子标记区分度不足所致ꎮ 为了
更好地服务于普通油茶基因组研究和分子标记辅助
育种ꎬ高质量的 ＳＳＲ分子标记亟待大量开发ꎮ
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１１８７期　 　 　 　 　 　 　 　 张恩慧等: 广西普通油茶种质资源遗传多样性的 ＳＳＲ分析