全 文 ：空心瓜[Praecitrullus fistulosus(Stocks)Pangalo，
2n＝2x＝24]是葫芦科一年生草本植物， 起源于印
度西北部， 目前在印度、 巴基斯坦等地广泛种植。
在印度， 空心瓜被称为 “tinda”， 以幼嫩果实为食
用器官 ， 也被称为印度圆葫芦(Indian Round
Gourd)、 苹果葫芦(Apple Gourd)和印度宝贝南瓜
基于 ITS序列探讨空心瓜在葫芦科中
的系统分类①
江 彪② 刘文睿 何晓明 彭庆务 林毓娥 梁肇均 谢大森③
(广东省农业科学院蔬菜研究所/
广东省蔬菜新技术研究重点实验室 广东广州 510640)
摘 要 空心瓜是葫芦科一年生草本植物， 是葫芦科重要的抗性资源。 然而， 长期以来其系统分类不清， 严重
影响空心瓜的利用。 空心瓜形态学观察结果发现， 与冬瓜具有许多相似之处。 随后克隆其 ITS序列， 并与葫芦
科其他作物进行系统进化分析， 结果发现， 空心瓜与冬瓜的遗传距离仅为 0.03， 位于进化树同一个分支末端，
这表明空心瓜归属于冬瓜属。 本研究不仅为空心瓜的系统分类提供直接的分子证据， 而且为利用空心瓜拓宽冬
瓜种质资源奠定重要的研究基础。
关键词 空心瓜 ； 葫芦科 ； ITS； 系统分类
中图分类号 Q949.782文献标识码 A Doi： 10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.012
The Taxonomic Classification of Praecitrullus fistulosus in Cucurbitaceae
based on Internal Transcribed Spacer Sequences
JIANG Biao LIU Wenrui HE Xiaoming
PENG Qingwu LIN Yue LIANG Zhaojun XIE Dasen
(Vegetable Research Institute, GAAS / Guangdong Provincial Key Lab for New Technology
Research on Vegetables, Guangzhou, Guangdong 510640)
Abstract Praecitrullus fistulosus is an annual Cucurbitaceae herb and it is an important resistant source in
Cucurbitaceae. However, the systematic classification of P. fistulosus is unclear for a long time, which
seriously affects its utility. Based on the morphological observation, author finds that there are many
similarities between P. fistulosus and Benincasa hispida. Subsequently, this paper carries out phylogenetic
analysis with other Cucurbitaceae species by clone the ITS sequence. The result showed that the genetic
distance between P. fistulosus and B. hispida is only 0.03, and they locates in the same terminal branch of
the phylogenetic tree. This indicates that P. fistulosus belongs to Benincasa. This study not only provides a
more clear evidence for the classification of P. fistulosus, but also lays an important foundation for the
utility of B. fistulosus to broaden B. hispida germplasm.
Keywords Praecitrullus fistulosus ; cucurbitaceae ; ITS ; phylogenetic classification
Vol．36, No．6
2016年6月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第36卷第6期
Jun． 2016
① 基金项目： 国家自然科学基金(No. 31401881)； 广东省自然科学基金(No.2014A030313566)； 广东省科技计划项目(No.
2013B060400031、 2 14B020202004、 15B020231004)； 广州市科技计划项目珠江科技新星专项(No.201610010102)； 广
州市科技计划项目产学研协同创新重大专项(No.201508020085)； 广东省农业科学院院长基金(No.201507)。
收稿日期： 2016-02-01； 责任编辑/黄东杰； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 江 彪(1983～)， 男， 博士， 副研究员， 主要研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术。
③ 通讯作者。 E-mail: xiedasen@126.com。
54- -
江 彪 等 基于 ITS序列探讨空心瓜在葫芦科中的系统分类
(Indian Baby Pumpkin)[1]。 前人研究结果表明， 空
心瓜可能对白粉虱具有一定的抗性[2]。 Levi等[3]的
研究结果显示， 空心瓜在苗期抗枯萎病。 因此， 空
心瓜可能是一个优良抗性资源， 对于葫芦科作物育
种具有重要的应用潜力。
空心瓜在葫芦科的系统分类是一个复杂的认知
过程。 由于空心瓜的花、 种子和叶等许多形态学特
征均与西瓜相似， 因此， Sujatha等[1]认为空心瓜
是西瓜的一个近缘野生种， 并将其命名为 Citrullus
vulgaris var. fistulosus(tinda)。 此外， 基于同工酶
研究结果， Navot等[4]研究发现， 空心瓜与所有西
瓜属植物均不同， 因此认为， 空心瓜不应该归于西
瓜属。 另一方面， 也有报道认为， 空心瓜应归为甜
瓜属， 因为其染色体基数与甜瓜相同[5-6]。 然而空
心瓜与甜瓜杂交不亲和， 并且同工酶分析结果表
明， 空心瓜与西瓜、 甜瓜均不相同[1]， 因此空心瓜
不应归于西瓜属或甜瓜属。 此外， Levi等[7]利用
RAPD标记和ISSR标记研究空心瓜与甜瓜属、 西瓜
属的亲缘关系， 结果表明， 空心瓜与甜瓜属、 西瓜
属间的遗传距离较远。
近年来， 空心瓜在葫芦科作物中的系统分类有
了新的发现[3,8-9]。 Schaefer等[8]利用叶绿体多基因
序列对葫芦科 114个属的 25%植物进行了进化分
析， 结果显示， 空心瓜与冬瓜(Benincasa hispida)
位于系统发育树的同一个末枝， 表明空心瓜与冬瓜
具有较高的遗传相似性。 Levi等[3]利用分子标记研
究空心瓜与西瓜、 甜瓜、 冬瓜、 葫芦、 南瓜等作物
的亲缘关系， 结果表明， 空心瓜与冬瓜的亲缘关系
最近， 同时通过花粉粒形态观察， 结果发现， 空心
瓜与冬瓜的花粉粒相似， 均为球形或半球形， 说明
空心瓜很可能是冬瓜属植物。
核糖体内转录间隔区(internal transcribed
spacers, ITS)是研究植物分类和亲缘关系的重要
工具[10-15]。 因此， 本研究通过克隆空心瓜的 ITS序
列， 并与葫芦科其他作物进行系统进化分析， 从而
探讨空心瓜在葫芦科作物中的分类地位。
1 材料与方法
1.1材料
空心瓜种子由郑州果树研究所王吉明研究员馈
赠， 种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云试验
基地。 同时对空心瓜的形态学性状进行调查统计，
包括叶、 茎、 雌雄花、 果实、 种子等。
1.2方法
1.2.1DNA提取
取刚展开的幼嫩叶片， 采用 CTAB法提取基因
组DNA[16]。 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及
质量， 并将其稀释至50ng/μL， 置于-20℃冰箱中
备用。
1.2.2ITS序列扩增
ITS序列包括ITS1、 5.8S rDNA和ITS2， 采用
双引物扩增。 两侧引物分别为： ITSR5′-CCTTAT-
CATTAGAGGAAGGAG-3′ [17]， ITSF5′ -TCCTCCGCT-
TATTGATATGC-3′[18]。 P R反应总体积为20μL， 包含
基因组 DNA20 ng、 正反向引物 50ng、 dNTPs2.5
mmol/L、 MgCl22.5mmol/L、 10×PCRbuffer和 Taq
DNA聚合酶1U(TaKaRa)。 PCR扩增程序为： 94℃5
min； 94℃30s， 56℃1min， 72℃1min， 35个循
环； 72℃10min。
1.2.3PCR产物的克隆
PCR产物利用1%琼脂糖凝胶进行检测， 并用琼
脂糖凝胶 DNA回收试剂盒(康为世纪)回收目的产物。
回收产物经纯化后连接于 pMD19-T载体(TaKaRa)，
并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 37℃培育后， 进
行蓝白斑筛选， 挑取白色单克隆， 在含有100mg/L
氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养过夜。 最后以
菌液为模板进行PCR扩增， 并将阳性克隆送往上海
英俊生物技术有限公司测序。
1.2.4序列分析
去除载体序列后， 将空心瓜ITS序列与葫芦科
其他作物的ITS序列进行分析(表1)。 基于已公布
的序列信息[19]， 确定各个 ITS序列的 ITS1、 5.8S
和 ITS2区。 所有序列采用 Cluster W进行多序列
比对[20]， 并利用BioXM 2.6进行GC含量分析。 同
时， 利用 MEGA5.05软件以 Kimura-2模型分析序
列间的遗传距离 。 进一步以秋海棠的 ITS序列
(AF485089)作为外根群， 利用MEGA5.05软件以邻
接法(Neighbor-joining)和最大简约法(Maximum
parsimony)构建系统进化树 ， 以自展法(boot-
strap)进行检测， 共循环1000次[21]。
55- -
2016年6月 第36卷第6期热带农业科学
表1 材料及编号
编号 名称 属 编号 名称 属 ITS登录号
1 Praecitrullus fistulosa
空心瓜
30 Kedrostis foetidissima Kedrostis 属 AM981180
2 Benincasa hispida
冬瓜
Benincasa
冬瓜属
31 Lagenaria sinceraria
瓠瓜
Lagenaria
葫芦属
FJ951164
3 Bolbostemmapaniculatum 假贝母
Bolbostemma
假贝母属
32 Luffa acutangula
有棱丝瓜
Luffa
丝瓜属
AM981165
4 Bryonia dioica
泻根
Bryonia
泻根属
33 Marah macrocarpus Marah 属 JN560192
5 Cayaponia africana
非洲泻瓜
Cayaponia
泻瓜属
34 Microsechium ruderale Microsechium属 JN560195
6
Cephalopentandra
ecirrhosa
伊沙头葫芦
Cephalopen-
tandra 35
Momordica charantia
苦瓜
Momordica
苦瓜属
HE661309
7 Citrulluslanaus
西瓜
Citrullus
西瓜属
36
Momordica
cochinchinensis
木鳖子
Momordica
苦瓜属
AY606266
8 Coccinia grandis
红瓜
Coccinia
红瓜属
37 Mukia javanica
爪哇帽儿瓜
Mukia
帽儿瓜属
EF595903
9 Cucumella aspera Cucumella 属 38 Myrmecosicyosmessorius
Myrmecosicyos
属
EF595905
10 Cucumeropsismannii
Cucumeropsis
属
39 Neoalsomitraintegrifo-liola 棒锤瓜
Neoalsomitra
棒锤瓜属
EF621642
11 Cucumis melon
甜瓜
Cucumis
甜瓜属
40 Oreosyce africana Oreosyce 属 EF595906
12 Cucumissativus
黄瓜
Cucumis
甜瓜属
41 Peponium vogelii Peponium 属 AM981090
13 Cucurbita maxima
笋瓜
Cucurbita
南瓜属
42 Raphidiocystis caillei Raphidiocystis属 AM981146
14 Cucurbitamoschata
南瓜
Cucurbita
南瓜属
43 Ruthalicia eglandulosa Ruthalicia属 AM981096
15 Cucurbitapepo
西葫芦
Cucurbita
南瓜属
44 Schizocarpum palmeri Schizocarpum属 HQ201991
16
Cyclanthera
brachystachya
小雀瓜
Cyclanthera
小雀瓜属
45 Schizopeponbryoni-ifolius 裂瓜
Schizopepon
裂瓜属
HQ201992
17 Dendrosicyossocotranus
Dendrosicyos
属
46 Sechiopsis tetraptera Sechiopsis 属 JN560203
18 Diplocyclospalmatus
毒瓜
Diplocyclos
毒瓜属
47 Sechiumedule
佛手瓜
Sechium
佛手属
AM981178
19 Doyereaemetocathartica Doyerea 属 48
Sicanaodorifera
香蕉瓜
Sicana
香蕉瓜属
HQ201994
20 Echinopeponpaniculatus
Echinopepon
属
49 Sicyosperma gracile Sicyosperma 属 JN560276
21 Edgaria darjeelingensis
三棱瓜
Edgaria
三棱瓜属
50 Siolmatra brasiliensis Siolmatra 属 HQ201998
22 Gomphogynecissiformis 锥形果
Gomphogyne
锥形果属
51 Siraitia grosvenorii
罗汉果
Siraitia
罗汉果属
JN407453
23 Gymnopetalumscabrum 金瓜
Gymnopetalum
金瓜属
52 Solena heterophylla
茅瓜
Solena
茅瓜属
GQ183047
24 Gynostemmapentaphyllum 绞股蓝
Gynostemma
绞股蓝属
53 Thladiantha dubia
赤瓟
Thladiantha
赤瓟属
GQ845144
ITS登录号
KU358563
JX073045
FJ980305
EU102709
HM057396
HQ201965
EF595859
HQ608206
EF595861
GU799495
KJ467172
AM981112
AM981171
FJ915110
EF595858
AM981177
HQ201974
JN834061
GQ489908
JN560183
GQ183042
EF621663
HQ201979
FJ980303
56- -
江 彪 等 基于 ITS序列探讨空心瓜在葫芦科中的系统分类
以空心瓜基因组DNA为模板， 通过PCR扩增获
得一条约720bp的目的片段(图2)。 目的片段通过
回收测序、 去除18S及26S序列后， 获得总长度为
614bp的ITS1＋5.8S＋ITS2序列。 该序列已提交
到 GenBank中， 登录号为 KU358563。 进一步将其
与其他 55种葫芦科作物的 ITS序列(表 1)进行综
合比较。 从表1中可看出， 所有材料的ITS序列长
度变异较大， 变化范围为 591～679bp。 葫芦科作
物的 5.8S rRNA较为保守， 长度均为 163bp， GC
含量变化范围为 57.67%～59.51%(表 2)。 而 ITS1
和 ITS2变异较大， 其中 ITS1的长度介于 179～
240bp， GC含量变化范围为 50.00%～72.28%；
编号 名称 属 编号 名称 属 ITS登录号
25 Hanburia oerstedii Hanburia 属 54
Trichosanthes
cucumerina
瓜叶栝楼
Trichosanthes
栝楼属
HQ202002
26
Hemsleya
zhejiangensis
浙江雪胆
Hemsleya
雪胆属
55 Zehneria bodinieri
钮子瓜
Zehneria
马瓞儿属
HQ202008
27 Hodgsonia heteroclita
油渣果
Hodgsonia
油渣果属
56 Zygosicyos tripartitus
三裂史葫芦
Zygosicyos
史葫芦属
HQ202010
28 Ibervillea millspaughii Ibervillea笑布袋属 57
Begonia grandis
秋海棠
Begonia
秋海棠属
AF485089
29 Indofevilleakhasiana
藏瓜
Indofevillea
藏瓜属
ITS登录号
JN560189
JF976604
HE661302
HQ201982
JX505443
续表1 材料及编号
2 结果与分析
2.1空心瓜的形态学观察
空心瓜为一年生蔓生植物， 茎被硬毛及长茸
毛， 有棱沟。 叶片肾形， 具深裂， 边缘有小齿。 叶
柄粗壮， 被粗硬毛和长茸毛。 雌雄同株异花， 雄花
具花瓣5～6枚， 被长茸毛， 雄蕊3个； 雌花具花瓣
5～6枚， 近球形， 被较密的长茸毛， 分柱头3个。
成熟果实较小， 近球形， 被稀刚毛， 果肉白色。 种
子为有棱双边， 黑色， 呈卵形， 两面平滑(图1)。
2.2空心瓜 ITS序列克隆
图1 空心瓜的形态学特征
说明： A.植株； B.雌花； C.柱头； D.果实； E.果肉； F.种子。
57- -
2016年6月 第36卷第6期热带农业科学
利用 Kimura-2模型， 以 MEGA5.05软件分析
ITS序列间的遗传距离。 所有葫芦科作物ITS之间
的遗传距离变化范围为 0.01～0.36， 其中 Cuc-
umella aspera(Cucumella属)与 Oreosyce africana(Ore-
osyce属)之间的遗传距离最小， 仅为0.01， 而 Bol-
bostemma paniculatum(假贝母属)与 Gomphogyne cis-
ITS2的长度为 227～279bp， GC含量变化范围为
54.51%～70.76%(表2)。
序列经 Cluster W比对后， 在 259个 ITS1位
点中， 变异位点共有196个， 其中信息位点173个，
占总位点的88.27%。 332个ITS2位点中， 变异位点
有244个， 其中信息位点有180个， 占总位点数的
54.22%。 5.8S rRNA较为保守， 在 163个位点中，
仅有16个变异位点， 其中只有2个是信息位点。
2.3葫芦科作物 ITS 序列的遗传距离及系统进化
分析
图2 空心瓜ITS序列的扩增
编号
ITS1 5.8S ITS2
编号
ITS1 5.8S ITS2
长度
/bp
长度
/bp
长度
/bp
长度
/bp
长度
/bp
长度
/bp
GC
/%
1 224 163 227 30 191 163 257 57.98
2 218 163 227 31 217 163 240 67.50
3 231 163 235 32 202 163 252 65.48
4 179 163 249 33 197 163 252 61.90
5 199 163 261 34 199 163 252 59.92
6 215 163 238 35 226 163 255 66.27
7 218 163 246 36 215 163 279 69.18
8 218 163 231 37 231 163 248 68.15
9 219 163 238 38 222 163 242 66.94
10 216 163 235 39 240 163 245 68.57
11 218 163 242 40 221 163 240 67.50
12 231 163 249 41 217 163 238 65.13
13 194 163 254 42 220 163 243 69.96
14 189 163 254 43 216 163 236 67.37
15 189 163 255 44 193 163 253 56.52
16 201 163 232 45 212 163 242 64.46
17 238 163 278 46 198 163 255 57.25
18 217 163 239 47 198 163 253 59.29
19 210 163 249 48 190 163 253 56.13
20 200 163 253 49 198 163 248 62.50
21 209 163 236 50 233 163 238 66.81
22 237 163 236 51 202 163 257 66.93
23 191 163 253 52 218 163 239 70.29
24 226 163 272 53 199 163 261 66.28
25 198 163 232 54 191 163 262 67.18
26 229 163 241 55 204 163 228 67.54
27 200 163 243 56 232 163 238 66.39
28 234 163 270 57 235 163 307 59.61
29 197 163 249
GC
/%
64.32
63.44
59.15
69.08
60.15
65.55
65.45
69.70
67.65
58.30
61.16
66.27
59.45
54.72
54.51
57.33
68.35
67.78
64.66
65.22
60.17
70.76
69.17
55.88
59.05
67.63
58.85
64.81
68.27
GC
/%
GC
/%
GC
/%
GC
/%
61.16 58. 8 58.64 57.6
60.09 58.90 61.29 58.9
54.98 58.90 61.39 58.90
59.78 58.90 58.38 58.90
56.28 58.28 57.29 58.28
61.86 58.90 5.49 58.90
59.17 58.90 65.12 58.90
64.22 58.90 64.07 58.90
61.64 58.90 61.26 58.90
54.17 58.28 67.50 58.28
55.5 58.90 61.09 58.9
59.74 58.28 61.29 58.90
54.64 58.90 66.36 58.90
52.91 58.90 1.57 58.90
52.38 58.90 53.89 58.90
53.23 58.90 60.85 58.90
64.29 59.51 55.05 58.90
63.13 58.28 52.53 58.90
62.38 58.90 50.00 58.90
58.00 58.28 57.07 58.90
60.29 59.51 65.24 58.90
69.62 59.51 72.28 58.90
61.26 58.9 65.14 58.90
8.14 59.51 62.31 58.90
56.57 58.28 61.78 58.90
64.63 58.90 58.82 58.90
54.50 58.90 67.24 58.90
60.68 59.51 62.98 53.99
69.04 59.51
表2 供试材料的ITS长度及GC含量
58- -
江 彪 等 基于 ITS序列探讨空心瓜在葫芦科中的系统分类
siformis(锥形果属)， 以及 Cucurbita pepo(南瓜属)与
Gomphogyne cissiformis(锥形果属)间的遗传距离最
大， 达到 0.36。 将空心瓜的 ITS序列与所有其他
作物的 ITS相比较 ， 其遗传距离变化范围为
0.03～0.30， 其中与 Benincasa hispida 冬瓜(冬瓜
属)的遗传距离最近(0.03)， 这表明与其他葫芦科作
物相比， 空心瓜与冬瓜具有更近的亲缘关系。
为确定空心瓜在葫芦科中的分类地位， 以葫芦
科作物的ITS序列为材料， 利用秋海棠作为外根群
构建系统进化树。 所有序列经 Cluster W比对后，
共有775个位点， 其中369个为信息位点。 分别采
用邻接法和最大简约法构建系统
进化树， 2种方法均得到基本相
似的结果。 图3是邻接法构建的
系统进化树， 从图 3中可看出，
这56份葫芦科作物可分为11个
亚族， 其中空心瓜与冬瓜均属于
Benincaseae(冬瓜)亚族， 且位于
同一个分支末端， 远离其他葫芦
科作物。
3 讨论与结论
为了探讨空心瓜在葫芦科中
的系统分类， 多年来分类专家先
后根据形态学及分子标记等手段
开展了许多工作[1,3-8]。 由于其形
态特征与西瓜相似， 而染色体基
数与甜瓜相同， 因此， 人们误认
为空心瓜归属于西瓜属或甜瓜
属， 并期望通过杂交来拓宽西瓜
或甜瓜的遗传基础[1,5]。 近年来，
Schaefer等[8]和 Levi等[3]先后
通过叶绿体多基因序列及分子标
记和花粉粒形态学观察等手段证
实空心瓜与冬瓜具有较近的亲缘
关系， 为空心瓜的系统分类奠定
了基础。 本研究通过对空心瓜的
形态学观察， 同样发现其与冬瓜
具有许多相似之处。 比如空心瓜
的果实形状与小冬瓜相似、 种子
形状与冬瓜的双边籽类似、 幼果均被较多长茸毛
等。
本研究进一步利用ITS序列研究空心瓜的系统
分类。 ITS具有进化速率快、 稳定性好、 测序方便
等特征， 是研究植物分类和亲缘关系的重要工具，
可解决在不同植物类群中科内的系统发育和分类问
题[10-15,22]。 Sharma等[22]利用ITS序列对从印度东北部
收集到的兰科植物进行系统分类研究。 侯新东等[14]
以 ITS序列研究庐山地区 12种荨麻科植物的系统
发育关系， 结果发现其分类结果与传统形态学的分
类结果基本一致。
图3 基于邻接法的系统进化树
59- -
2016年6月 第36卷第6期热带农业科学
本研究首先克隆了空心瓜的ITS序列， 并与葫
芦科其他作物进行系统进化分析， 结果显示空心瓜
与冬瓜的遗传距离仅为 0.03， 远低于与其他葫芦
科作物的距离； 系统进化分析结果表明， 空心瓜与
冬瓜均归属于Benincaseae冬瓜亚族， 且位于于同
一个进化树的分支末端。 综上所述， 空心瓜与冬瓜
亲缘关系较近， 归属于冬瓜属。 本研究不仅为空心
瓜的系统分类提供了更为直接的分子证据， 而且为
空心瓜优异基因的挖掘利用及冬瓜种质资源拓宽奠
定了重要的研究基础。
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