全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 6期，第 1201-1208页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.6, 1201-1208
SSR (simple sequence repeats)是一种基于 PCR
技术的分子标记，具有潜在数量丰富、等位位点变异
多、信息含量高、共显性、操作简便、重复性好等优点
(Goldstein et al., 1995)，被广泛应用于遗传多样性分
析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、功能基因的定位
收稿日期：2014-01-28 接受日期：2014-03-28 网络出版日期：2014-05-28
URL: http://biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2033
基金项目：本研究由广州市重点项目(12c14071617)资助
研究报告
Research Report
利用黄瓜、甜瓜和西瓜 SSR开发葫芦科作物穿梭标记
刘鹏 1,2 吴海滨 2 龚浩 2 何晓莉 2 邓国栋 1* 罗剑宁 2*
1贵州大学生命科学学院,贵阳, 550025; 2广东省农业科学院蔬菜研究所,广州, 510640
*通讯作者, dengguodong2@163.com; luojn@263.net
摘 要 微卫星标记(SSR)是分子育种中常用的遗传标记，葫芦科中仅有黄瓜、甜瓜、西瓜进行了大规模的
SSR标记开发，其他作物均不同程度地面临 SSR标记缺乏的情况。利用近源物种间分子标记具有一定的通
用性，本研究合成源于黄瓜、甜瓜和西瓜的 60对 SSR标记，从中筛选出 42对可用标记，对甜瓜、西瓜、黄瓜、
南瓜、苦瓜、冬瓜、节瓜和丝瓜 8种葫芦科作物进行验证，分析这三种瓜类 SSR标记在葫芦科中的穿梭性。结
果表明，42对标记中有 29对(69%)能在 8种常见葫芦科作物中都得到有效扩增，在 5种及 5种以上物种中
有扩增的引物达到 38对，占 90.5%，表明这三种瓜类 SSR标记在葫芦科作物中有良好的穿梭性，这为葫芦
科中数目庞大的未测序作物提供一种切实可行、高效低成本的分子标记开发方法。
关键词 SSR,葫芦科,穿梭标记,黄瓜,甜瓜,西瓜
Exploiting New Cross-Species Markers by SSR from Cucumber, Melon and
Watermelon
Liu Peng 1,2 Wu Haibin 2 Gong Hao 2 He Xiaoli 2 Deng Guodong 1* Luo Jianning 2*
1 GuiZhou University, Guiyang, 550025; 2 Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, 510640
* Corresponding authors, dengguodong2@163.com; luojn@263.net
DOI: 10.13271/j.mpb.012.001201
Abstract Simple sequence repeats (SSR) is one of the marker systems widely used in molecular breeding. Howe-
ver, only a limited SSRs have been reported in melon, watermelon and cucumber among Cucurbitaceae family,
while others are rarely reported due to their weakly research. In this study, we used SSR transfer between related
species to develop cross-species markers, and analysis their transferability to other Cucurbitaceae corps. By PCR
amplification with the genomic DNA of common Cucurbitaceae crops, including melon, watermelon, cucumber,
pumpkin, bitter gourd, wax gourd, chieh-qua and loofah, 60 pairs SSR markers were tested to analysis their
transferability, and found 69% (29 out of 42) usable pairs markers can be used successfully in 8 species of common
Cucurbitaceae crops, 90.5% (38 out of 42) can produce expected fragment in 5 or more than 5 species. These indi-
cated that SSR markers form cucumber, melon and watermelon had pretty transferability in Cucurbitaceae crops.
Provided a new effective, inexpensive way to develop molecular markers in huge Cucurbitaceae crops.
Keywords SSR, Cucurbitaceae, Cross-species markers, Melon, Watermelon, Cucumber
和克隆、分子标记辅助育种等研究领域(方宣钧等,
2001,科学出版社, pp.1-84)。已有研究表明，SSR标
记在亲缘关系较近的物种间具有一定的通用性
(FitzSimmons et al., 1995; Peakall et al, 1998)。因此，
利用 SSR侧翼序列的保守性，开发近源物种间的穿
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
梭标记，是一种高效、低成本获取标记的途径(Ya-
mamoto et al., 2001)。
葫芦科(Cucurbitaceae)是世界上重要的可食用植
物科，共有 126个属，900余种，世界各地均有分布，
在热带和亚热带地区种类尤其丰富，中国分布有 32
个属，160余种，以西南各省种类最为丰富。葫芦科作
物中以黄瓜、甜瓜和西瓜的研究最为深入(Huang et
al., 2009; Verma and Arya, 2008;刘栓桃等, 2010)，目
前已经完成了全基因组测序，开发了大量分子标记，
其他作物的基础研究则较为薄弱，均不同程度存在
特异性分子标记较少甚至没有的情况。
本研究从甜瓜、西瓜和黄瓜中选取 SSR标记，对
8种葫芦科作物进行检测，结果显示 42对可用标记
中有 29对能在 8种作物中都有效扩增，占 69%，38
对标记能够在 5种及 5种以上作物中有效扩增，占
90.5%，说明这三种瓜类 SSR标记在供试的葫芦科
作物中具有良好的穿梭性。通过本研究，期望为葫芦
科中数目庞大的未测序作物提供一种切实可行的分
子标记开发方法。
1结果与分析
1.1标记可用性分析
对合成的标记进行筛选，结果表明来自甜瓜的
15对 EST-SSR标记有 8对在甜瓜中能扩增出预期
片段，其余 7对无扩增，有效扩增率为 53.3%；来自甜
瓜的 25对 SSR标记有 17对在甜瓜中能扩增出预期
片段，其余 8对无扩增，有效扩增率为 68%；来自西
瓜的 10对 SSR标记有 7对在西瓜中能扩增出预期
片段，其余 3对无扩增，有效扩增率为 70%；来自黄
瓜的 10对 SSR标记全部能扩增出预期片段，有效扩
增率为 100%。供试的 60对标记中共有 42对可用
(引物序列见表 1)。
1.2标记穿梭性分析
将可用的 42对 SSR标记，对甜瓜、西瓜、黄瓜、南
瓜、苦瓜、冬瓜、节瓜和丝瓜共 8个物种 15份材料进
行扩增，部分扩增结果如图 1，扩增情况统计见表 2。
共 37对标记(除 C2, C3, C4, S7和 W1外)在甜
瓜中均能得到有效扩增，其中 12对标记(C7, E4, E5,
S6, S8, S12, S14, W3, W4, W5, W6和W10)在甜瓜品
系 CP-1、LP06之间表扩增多态性；共 37对标记(除
C4, C9, E9, S7和 S14外)在西瓜中均能得到有效扩
增，其中 19对标记(C1, C2, C3, C7, C10, E4, E5, M2,
M4, M7, M9, M10, S1, S5, S6, S10, S12, S15和W10)
图 1部分标记在 15份材料中的扩增
注: M: 50 bp ladder marker; A:引物M8的扩增; B:引物M3的
扩增 ; 1: 甜瓜品系 CP-1; 2:甜瓜品系 LP06; 3: 西瓜品系
MX90; 4:西瓜品系 WA10; 5:黄瓜品系 SCTP01; 6:黄瓜品系
SC-95; 7:南瓜品系 IP327; 8: 南瓜品系 IP401; 9: 苦瓜品系
CP800; 10:苦瓜品系 CP90; 11:冬瓜品系 PV-1; 12:冬瓜品系
P281; 13:节瓜品系 75-2; 14:节瓜品系 GM-1; 15:有棱丝瓜
品系 S1174
Figure 1 Parts of markers amplification with different 15 ma-
terials
Note: M: 50 bp ladder marker; A: Amplification with marker M8;
B: Amplification with marker M3; 1: Melon CP-1; 2: Melon
LP06; 3: Watermelon MX90; 4: Watermelon WA10; 5: Cucum-
ber SCTP01; 6: Cucumber SC-95; 7: Pumpkin IP327; 8: Pump-
kin IP401; 9: Bitter gourd CP800; 10: Bitter melon CP90; 11:
Wax gourd PV-1; 12: Wax gourd P281; 13: Chieh-qua 75-2; 14:
Chieh-qua GM-1; 15: Loofah S1174
在西瓜品系 MX90、WA10之间表现扩增多态性；共
40对标记(除 S14和W1外)在黄瓜中均能得到有效
扩增，其中 16对标记(C1, C7, C10, E12, M3, M9, M10,
S1, S6, S12, S13, W3, W4, W5, W9和W10)在黄瓜品
系 SCTP01、SC-95之间表现扩增多态性；共 39对标
记(除 E9, S14 和 W1 外)在南瓜中均能得到有效扩
增，其中除M2、W6外，另外 37对标记在南瓜品系
IP327、IP401之间表现扩增多态性；共 37对标记(除
E9, M9, S12, S14和W1外)在苦瓜中均能得到有效
扩增，其中除 C2、C3、C5、C6、E1、E12、M2、M3外，另
外 29 对标记在苦瓜品系 CP800、CP90 之间表现扩
增多态性；35对标记(除 C7, C9, E9, M9, S1, S14和
W1外)在冬瓜中均能得到有效扩增，除 C1、C3、C5、
1202
利用黄瓜、甜瓜和西瓜 SSR开发葫芦科作物穿梭标记
Exploiting New Cross-Species Markers by SSR from Cucumber, Melon and Watermelon
表 1来源于三种瓜类作物的 42对可用性 SSR标记
Table 1 42 pairs of usable SSR markers originated from 3 Cucurbitaceae
引物
Primers
E1
E4
E5
E8
E9
E12
E14
E15
S1
S5
S6
S7
S8
S10
S12
S13
S14
S15
M1
M2
M3
M4
M7
上游引物序列
Forward primer
TCCTTCAATGGCTTCCTCAC
CAGGAACGACAGCTCAAATG
TGTGGAGGTGGAGGTTAAGG
ACGAAATCCCACTGGTGAAC
TCAAGGATGCTTTGATTCCC
CACCAAACCCTAACAATGGC
ACGGCGGACTCAGTAACAAC
ACACCTCTTCCGACGATGAC
GCTCTGTTATAACCGTAACTGG
TCGAAGTCCAGGAAGAGAG
AAGAAGTCCTGAGTGTGAGAG
GATTTGTTTTGGCTGGAAC
CCTGTTGGAGTTGGAGAAG
CGATCGTTGCTAGGAGAAC
AGTCCACTCCTCCAATAAAAC
CATTTCATTTCATCACTTCC
CCATCAAATTGGTGTTTATCC
CGAAGATCAGGAAGAAAAGC
AATCAACCAAAACCACACCCTACCC
TCAACTGTCCATTTCTCGCTG
ATCATTGGATGTGGGATTCTC
TTCTGATCAACGACGAAG
TGGAAACTCTGTGGGTAGGC
下游引物序列
Reverse primer
TGGAGAGGATTTGTTCGAGG
CTGGTGGTTGTCGTTGTTTG
AACAACGGTAATGAGTCCGC
TTGTGGGTAGGTCTTGGAGG
GGACATAATGGGTGGGATTG
ATGTGGTAGCGGAGGTTGAC
ATGGACTTTGAACCTCGTCG
CGTCGAAAGCAGAAGGTAGG
ACGTGGCTAAATCTCGTTC
TAAAGAATGTGGAGAGCGG
CACCTCCTTCTTCATCTTCC
GGAGACGACAGATGAGGAC
TGAGATCCAACTAGACCGC
TTGAGCACATCTCTTTCCC
GGCCTTTAAATTGCCATAAC
GCGGCTGTTAATGATAAAG
AGAGATCTGGTCATCTGGG
CTCAACCTCCCAAGTTTTG
TGGGTTGTTATGTTTGGCTATTTGC
CCGTAAAGACGAAAACCCTTC
ACAGATGGATGAAACCTTAGG
GAAACAAAAGCCTCCATTG
TTTTGCTGAAACGCAACAAC
来源
Source
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
1203
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 2可用标记对 8种葫芦科作物成功扩增的数量
Table 2 The number of species amplification successfully with
usable markers
能扩增的物种数
No. of working species
标记数量
Number
比例(%)
Ration (%)
1
2
4.8
2
1
2.4
3
0
0
4
1
2.4
5
2
4.8
6
3
7.1
7
4
9.5
8
29
69
引物
Primers
M9
M10
W1
W3
W4
W5
W6
W9
W10
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
上游引物序列
Forward primer
GTTGATCAAAGTGGTGCTTTGGTG
CTTCATGTTTTATTTCCGTGG
AATCTCCACTACAATCCACCAG
CATTTTGAAAGCTTAGGGACTTG
GGCATACATTCCAACCCATC
GATGGAAGCTCTCCCTTTCC
AAAGGCCTTGTCCACACATC
TTGATCTTTTAGCCCTTGGC
AATCTTCCCCATGCCAAAAC
TTGACCCATAGACCCACACA
GCACAATTGGTTATTGAAGCG
TAGGCCGAGTTGGTGCTAGT
TGCCGTTTGGATCACATAGA
CGTAATTCCGCATCGTTTTT
CGTGGCATAAAACCACGAAT
TCAGATGTTGATTGGCTCTCA
ACCAGAAACCCTGCTCCTTT
CGATCTTCGAGTTTCGCAAT
TTTCCTAGCCAAATCATGCC
下游引物序列
Reverse primer
CACATTAAATCCTGGGGAAAATGC
CAACGAGAGGTACATAATTC
TTCCTCCAAACTCATCATTACC
CGTTTCAGAACCGTCTGATG
AGGGACAGAGAGCGACAGAG
TCATTCCCGCTCTCTTCATC
AGCAGCTCGAAAACAAGAGTG
ATTCCAAAGCTCCACGTGTC
GACTTCCAAACCCTCCCTTC
AACAACCAACAGGCCAAGAG
CAAAATGCATGTGTTGAGCA
GCTGCATTTGGAATCCTTGT
CAATACGCACAAAAAGCGAA
CGAGAACATGATCGTCTCCA
TTTCATCAAATTCAACAAAACCC
AGGGCCAACATTAAAGGGTC
AACCACGTCCTTCTGCATTC
ATCCAACGGCTCTCATTCAC
CTCGGGTCAGCATCTTTTTC
来源
Source
甜瓜
Melon
甜瓜
Melon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
西瓜
Watermelon
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
黄瓜
Cucumber
续表 1
Continuing table 1
C8、C10、E1、E4、E8、E15、M3、M4、M7、S6、W10 外 ，
其余 21对标记在冬瓜品系 PV-1、P281之间表现扩
增多态性；共 35对标记(除 E9, M1, M9, S1, S12, S14
和W1外) 在节瓜中均能得到有效扩增，C1、C2、C3、
C4、C5、C7、C10、E1、E5、E8、M3、M4、M7、S6、W6、W9
外，其余 19标记在节瓜品系 75-2、GM-1之间表现扩
增多态性；有 36 对标记(除 E9, M9, S1, S12, S14 和
W1外)能在有棱丝瓜品系 S1174中得到有效扩增。
1204
图 2聚类分析图
注: 1~15:材料编号,与图 1相同
Figure 2 Dendrogram for 15 Cucurbitaceous crops by UPGMA
method
Note: 1~15: The numbers of materials, see the figure 1
表 3不同作物可扩增标记数目及比例
Table 3 The number and ration of amplification makers
标记类别
Type of primers
黄瓜
Cucumber
西瓜
Watermelon
甜瓜
Melon
合计
Total
比率(%)
Ratio (%)
数量
Number
10
7
25
42
甜瓜
Melon
7
6
24
37
88.1
西瓜
Watermelon
8
7
22
37
88.1
黄瓜
Cucumber
10
6
24
40
95.2
南瓜
Pumpkin
10
6
23
39
92.9
苦瓜
Bitter gourd
10
6
21
37
88.1
冬瓜
Wax gourd
8
6
22
36
85.7
节瓜
Chieh-qua
10
6
20
36
85.7
丝瓜
Loofah
10
6
20
36
85.7
通用性扩增的标记数
No. of transferability primers
有 29对标记在全部 8个物种中均得到有效扩
增，占 69%；4对标记在 7个物种中得到有效扩增，占
9.5%；3对标记在 6个物种中得到有效扩增，2对标
记在 5个物种中得到有效扩增，1对标记在 4个物种
中得到有效扩增，1对标记在 2个物种中得到有效扩
增，2对标记仅能在 1个物种中有效扩增。在 5种及
5种以上物种中有扩增的标记共 38对，占 90.5%。
可用的 42对 SSR标记在不同作物间的扩增率
有所不同，统计结果见表 3。其中黄瓜的扩增率最高，
有 40对标记能进行有效扩增，扩增率达到 95.2%，其
次是南瓜，有 39对标记能有效扩增，扩增率达到
92.9%；在甜瓜、西瓜、苦瓜、冬瓜、节瓜和丝瓜中标记
的有效扩增分别为 38、37、37、35、35和 36对。这一
结果表明，黄瓜、甜瓜和西瓜三种瓜类作物 SSR标记
在葫芦科作物具有较高的通用性。
1.3葫芦科物种进化分析
将 42对 SSR标记对 8种葫芦科作物 15份材料
成功扩增的条带进行数据统计，共获得 617个位点，
平均每对标记扩增 14.7位点，引物多态性比例均为
100%。不同标记扩增的谱带数不同，其中扩增谱带数
最多的扩增出 32个位点，扩增位点数最少的仅扩增
出 2个位点。根据带型统计结果对 15份材料进行聚
类分析，从图 2可以看到，当相似系数为 0.64时，黄
瓜单独分为一类，其余七种作物归为一类；而当相似
系数为 0.65时，甜瓜最先与黄瓜靠近；在相似系数为
0.67时，西瓜与其他几种瓜类分开，而南瓜、丝瓜、苦
瓜、冬瓜以及节瓜归为一类；当相似系数 0.7时，南瓜
与丝瓜归为一类，而苦瓜、冬瓜和节瓜归为一类；在
图中可以看到，冬瓜与节瓜亲缘关系最近，甜瓜与黄
瓜的亲缘关系较近。
2讨论
开发葫芦科物种间的穿梭标记，能改善大量未
测序作物分子标记不足的现状，节省分子标记开发
的时间和资金投入，同时能够为葫芦科作物比较基
因组学研究提供有力工具。
本研究筛选可用标记要求在来源作物中必须有
扩增，无扩增即认为不可用。来源于黄瓜的标记
100%可用，而来源于甜瓜和西瓜的标记分别只有
利用黄瓜、甜瓜和西瓜 SSR开发葫芦科作物穿梭标记
Exploiting New Cross-Species Markers by SSR from Cucumber, Melon and Watermelon 1205
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
62.5%和 70%可用，这可能与标记的序列来源有关，
本研究所用实验材料与文献所述有一定的遗传距
离，如本研究的西瓜均为栽培型西瓜(C. lanatus var.
lanatus)，而文献中所述的西瓜品系 296341-FR为野
生型西瓜(C. lanatus var. citroides)，因此造成 30%的
西瓜 SSR标记不能得到成功扩增；另外有 37.5%的
甜瓜 SSR标记不可用。
以往关于葫芦科作物穿梭标记的研究，不同研
究的结果不尽相同。唐鑫等(2011)发现西瓜及甜瓜
SSR标记对丝瓜、冬瓜、苦瓜的通用性比率分别为
15.3%、23.04%和 14.74%，李楠等(2008)发现甜瓜、黄
瓜和西瓜基因组的 SSR标记在不同作物间最小通用
率仅为 24%，通用性比率较低。胡建斌和李建吾
(2009)的研究则认为葫芦科作物间 SSR标记具有较
高的通用性，黄瓜 EST-SSR标记对甜瓜通用性比率
高达 92.9%，对西瓜、南瓜和葫芦的通用性比率也分
别有 57.1%、53.6%和 60.7% (Hu et al., 2010)。本研究
筛选所得的穿梭标记对黄瓜的通用性比率为 95.2%，
对南瓜、甜瓜、西瓜、苦瓜、丝瓜、冬瓜及节瓜的通用
性比率分别为 92.9%、90.5%、88.1%、88.1%、85.7%、
83.3%和 83.3%，高于唐鑫等(2011)和李楠等(2008)的
研究，与胡建斌和李建吾(2009)的研究结果类似。这
一方面可能与标记的来源有关，唐鑫等(2011)所用
标记由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供，大多
数标记扩增得到的是模糊不清的条带或者完全没
有条带，通用性比率较低，李楠等(2008)所用标记来
自公开发表的文献；而胡建斌和李建吾(2009)则从
GeneBank 下载大量数据，严格限定搜查条件，通用
性比率较高；另一方面与标记是否经过筛选有关，唐
鑫等(2011)所研究的标记未经过筛选，全部用于通用
性研究。本研究所用的标记经过筛选，除去在来源物
种中无扩增的标记，引物的通用性比率较高，筛选的
42对标记中有 69%能在 8种葫芦科作物中通用，有
90.5%能在 5种及 5种以上葫芦科作物中通用。穿梭
标记的通用性比率也与统计标准相关，邵光金等
(2010)认为只有所扩增产物主条带与预期片段大小一
致或相差不大时，才可以将标记归为通用；而崔秀敏
等(2005)则认为只要有明显扩增即为通用，本研究采
用这种统计标准，即便穿梭标记扩增产物的大小和
数目有差异。目前关于统计的标准尚无统一定论，标
准的不同也是造成通用性比率相差较大的一个原因。
葫芦科作物种类繁多，有大量的种和亚种变异，
且研究基础相对薄弱，难以确保其分类的准确性(赵
胜杰等, 2011)。传统分类多采用形态标记，由于标记
数量少、可鉴别标记基因有限及易受环境等因素影
响，形态标记逐步向分子标记发展。本研究利用 42
对穿梭标记分析 8种葫芦科作物共 15个品系的遗
传进化关系，平均每对标记成功扩增 14.7位点，表明
研究的 15份材料遗传多样性丰富。结果显示节瓜与
冬瓜亲缘关系最近，这也符合节瓜是冬瓜的一个变
种(宋世威等, 2010)的观点；另外从聚类分析图可以
看出，甜瓜和黄瓜的亲缘关系较近，二者间通用标记
多，来自甜瓜的 25对 SSR标记有 24对能在黄瓜中
通用，说明在进化上二者遗传距离较近；丝瓜与南瓜
的亲缘关系较近，这与丝瓜和南瓜起源中心具有交
集的观点(张天明, 2005)相符。
利用近源物种开发穿梭标记是一种解决物种间
研究不平衡的有效方法，葫芦科作物黄瓜、甜瓜和西
瓜的全基因组测序已经完成，本研究表明这三种瓜
类 SSR标记在葫芦科作物中通用性比率高，利用这
些测序信息大规模开发葫芦科作物的穿梭标记，将
大幅提升葫芦科作物的整体研究水平，同时为葫芦
科作物的比较基因组学研究提供有力的工具。
3材料与方法
3.1材料
3.1.1试验材料
本研究所用材料包括甜瓜品系 CP-1、LP06，西
瓜品系MX90、WA10，黄瓜品系 SCTP01、SC-95，南
瓜品系 IP327、IP401，苦瓜品系 CP800、CP90，冬瓜品
系 PV-1、P281，节瓜品系 75-2、GM-1，有棱丝瓜品
系 S1174，共 8个物种 15份材料，催芽后种植于育苗
盘中，长至 2~3片真叶后摘取叶片提取 DNA。
3.1.2 SSR标记
从葫芦科基因组数据库(http://www.icugi.org/)中
获得甜瓜 EST-SSR 标记 15 对(E1~E15)，甜瓜 SSR
标记 15对(S1~S15)；参考相关文献获得甜瓜(Diaz et
al., 2011) SSR标记 10对(M1~M10)，西瓜(Ren et al.,
2012) SSR 标记 10 对 (W1~W10)，黄瓜 (Ren et al.,
2009) SSR标记 10对(C1~C10)。共计 60对，由上海
生工生物工程有限公司合成。
3.2方法
3.2.1 DNA提取
采集植物叶片，参照程周超 (2010)所用改良
CTAB法提取基因组 DNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳
1206
检测 DNA完整性，并用分光光度计进行定量，加 TE
稀释到 200 ng/μL备用。
3.2.2引物筛选
以甜瓜、西瓜和黄瓜三种作物 DNA为模板，对
合成的 60对标记进行 PCR扩增筛选，将扩增失败
的引物重新稀释再次进行扩增验证，去除在来源物
种中无扩增的标记，将其他标记用于通用性分析。
3.2.3标记穿梭性分析
选取葫芦科作物甜瓜、西瓜、黄瓜、南瓜、苦瓜、
冬瓜、节瓜以及丝瓜 8个物种共 15份材料，以基因
组 DNA为模板，将筛选后的标记用于扩增。PCR反
应为 20 μL体系，其中 10×Buffer 2 μL，10 mmol/L
dNTPs 0.4 μL，2 U/μL Taq 酶 0.5 μL，10 μmol/L 上
下游引物各 1 μL，200 ng/μL DNA 0.5 μL，ddH2O
14.6 μL；PCR扩增程序采用 Touch-Down PCR：94℃
预变性 5 min；94℃ 30 s，65℃ (-1℃/cycle) 30 s，72℃
1 min，12 个循环；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，
25个循环；72℃终延伸 10 min。PCR产物加入 4 μL
6×loading Buffer，取 1~2 μL用 8%变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳，银染显色后读带。
3.2.4葫芦科物种进化分析
将以上 8种葫芦科作物共 15份样品，用穿梭标
记进行聚类，在 DNA电泳图谱中对扩增情况做统
计，PCR扩增结果按照电泳谱带的“有”、“无”转换为
“1”、“0”二元数矩阵，将所得数据利用 NTSYS-PC2.
10软件进行分析，以 Jaccard (Jaccard’s coefficient)遗
传相似系数(Jcij)为基础，计算成对相似系数，采用非
加权平均法(UPMGA)进行聚类分析和构建树状图，
评价试验样品间的亲缘关系。
作者贡献
刘鹏和吴海滨是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；刘鹏完成数据分析，论文初稿的写作；吴
海滨、龚浩、何晓莉参与实验设计，试验结果分析；邓
国栋、罗剑宁是项目的构思者及负责人，指导实验设
计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并
同意最终的文本。
致谢
本研究由广州市重点项目(12c14071617)资助。
感谢广东省蔬菜新技术研究重点实验室李涛博士在
论文修改过程中提出的宝贵意见。
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