全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｊｕｎ. ２０１６ꎬ ３６(６):６９１－６９７
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１０００４
李国栋ꎬ尹子丽ꎬ刘小莉. 基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的胡黄连保护遗传学研究 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(６):６９１－６９７
ＬＩ ＧＤꎬＹＩＮ ＺＬꎬＬＩＵ ＸＬ. Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(６):６９１－６９７
基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的胡黄连保护遗传学研究
李国栋１ꎬ 尹子丽２ꎬ 刘小莉１∗
( １. 云南中医学院 中药学院ꎬ 昆明 ６５０５００ꎻ ２. 云南中医学院 民族医药学院ꎬ 昆明 ６５０５００ )
摘　 要: 胡黄连为特产中国￣喜马拉雅特有高山植物ꎬ作为常用中、藏药材ꎬ受到灭绝性采挖ꎬ作为濒危和二级
保护植物亟待科学的保护ꎮ 该研究以云南和西藏 ７个野生居群 ９１个个体为材料ꎬ基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ非编码
序列测序分析胡黄连的遗传多样性和遗传结构ꎬ分析显著进化单元ꎬ确立优先保护居群并提出科学的保护策
略ꎮ 结果表明:胡黄连 ｔｒｎＬ￣Ｆ序列长度为 ８７１~８７６ ｂｐꎬ根据序列的核苷酸变异共鉴定出 ５个单倍型ꎬ西藏占有
２个单倍型ꎬ云南占有 ３个单倍型ꎬ西藏和云南 ２个地区的所有单倍型均不共享ꎮ 胡黄连具有较低的单倍型多
样性(Ｈｄ ＝ ０.４３４ １９)和核苷酸多样性(Ｄｉｊ ＝ ０.００４ ６６)ꎮ 种群间分化度(Ｆｓｔ ＝ ０.８６４ ５２０)和基因流(Ｎｍ ＝
０.０４)、居群间的遗传分化水平(ＧＳＴ ＝ ０.９１６)、ＡＭＯＶＡ分析(０.７８％的遗传变异发生在居群内ꎬ６０.９７％的遗传变
异发生在地区内居群间ꎬ３８.２５％的遗传变异发生在地区间)均表明ꎬ胡黄连居群间存在明显遗传分化ꎮ 多数
一致性树将胡黄连划分为 ３个进化分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)ꎬ这 ３ 个分支均与地理相关ꎬ分支Ⅰ分布于横断山区的 ４
个居群ꎬ分支Ⅱ是分布于东喜马拉雅的一个居群ꎬ分支Ⅲ是分布于喜马拉雅中段的 ２个居群ꎮ ３个分支分属于
３个“进化显著单元(ＥＳＵ)”ꎮ 这 ３个 ＥＳＵ中白马雪山、茨中、定日、波密、聂拉木五个居群都需要保护ꎬ建议现
阶段应优先保护的居群是云南白马雪山和西藏波密居群ꎬ以就地保护为主ꎮ
关键词: 胡黄连ꎬ 濒危ꎬ ｔｒｎ Ｌ￣Ｆꎬ 单倍型ꎬ 保护遗传学
中图分类号: Ｑ９４５　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０６￣０６９１￣０７
Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ
ＬＩ Ｇｕｏ￣Ｄｏｎｇ１ꎬ ＹＩＮ Ｚｉ￣Ｌｉ２ꎬ ＬＩＵ Ｘｉａｏ￣Ｌｉ１∗
( １. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｙꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０５００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｉｎｏｒｉｔｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０５００ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ (Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ)ꎬ ａ ｍｏｎｏｔｙｐｉｃ ｇｅｎｕｓ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｉｓ ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ ｔｈｅ
Ｅａｓｔｅｒｎ Ｈｉｍａｌａｙａｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｅｎｇｄｕａｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｒｅｇｉｏｎ. Ｉｔ ｏｎｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｓ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｂｅｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａꎬ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ
３ ６００ ｍ ｔｏ ４ ２００ ｍ ｉｎ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｃｒｅｅｐ ｒｈｉｚｏｍｅｓ (Ｒｈｉｚｏｍａ Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａｅ) ａｒｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｖａｌｕｅ ａｎｄ
ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ Ｔｉｂｅｔａｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ. Ｍａｉｎｌｙ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｓ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕ￣
ｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｈａｖｅ ｓｕｆｆｅｒｅｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｃｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｎｏｗ ｉｔ ｉｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ａｎ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｅｃｏｎｄ ｃａｔｅｇｏ￣
ｒｙ ｏｆ ｋｅｙ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｗｉｌｄ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏ￣
ｒａꎬ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ＤＮＡ (ｃｐＤＮＡ) ｔｒｎＬ￣Ｆ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
收稿日期: ２０１４￣１０￣８　 　 修回日期: ２０１５￣０３￣２９
基金项目: 云南省自然科学基金面上项目(２０１０ＣＤ０７３)ꎻ国家科技基础性工作专项重点项目(ＳＢ２００７ＦＹ０２００)ꎻ云南省应用基础研究青年项目
(２０１４ＦＤ０３５) [ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ ( ２０１０ＣＤ０７３ )ꎻ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂａｓｉｃ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｆｕｎｄ
(ＳＢ２００７ＦＹ０２００)ꎻ Ｙｕｎｎａｎ Ｙｏｕｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ (２０１４ＦＤ０３５)]ꎮ
作者简介: 李国栋(１９８４￣)ꎬ 江西鄱阳人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事植物谱系地理学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｇａｍｍａｒ１１６＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 刘小莉ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ硕士生导师ꎬ主要从事药用植物资源研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｋｍｘｕｎｚｉ＠ ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ
ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｕｎｉｔｓ (ＥＳＵ) ｗｅｒｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ９１ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕ￣
ｌａｒｉｉｆｌｏｒａ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ａｌｍｏｓｔ ａｌｌ ａｒｅａｓ ｏｆ ｉｔｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｒａｎｇｅｓ. Ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｅｖｅｎ ｐｏｐｕ￣
ｌａｔｉｏｎｓꎬ ｆｏｕｒ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ Ｔｉｂｅｔ. Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｌｅｎｇｔｈ ｖａｒｉｅｄ ｆｒｏｍ ８７１ ｂｐ ｔｏ ８７６ ｂｐ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ｆｉｖｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｒｎＬ￣Ｆ ｎｕｃｌｅ￣
ｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ. Ｙｕｎｎａｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｒｅｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｂｅｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｗｏ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｎｏｎｅ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ
ｓｈａｒｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｙｕｎｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｂｅｔ. Ａ ｎｏｒｍａｌ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ (Ｈｄ ＝ ０.４３４ １９) ａｎｄ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ (Ｄｉｊ ＝ ０.００４ ６６) ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｌｅｖｅｌ. Ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ (０.９６)
ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ. ＡＭＯＶＡ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄａｔａ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ０.７８％ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗａｓ
ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬ ６０.９７％ ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｇｒｏｕｐｓꎬ ａｎｄ ３８.２５％ ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｔｈａｔ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ ｗａｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｙｕｎｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｂｅｔ. Ｔｈｅ Ｕ￣ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｉ￣
ｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＮＳＴ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ＧＳＴ(ＮＳＴ >ＧＳＴꎬ Ｐ < ０.０１)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙ ｐｈｙｌｏ￣
ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｐａｔｔｅｒｎ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｌｏｗ (Ｎｍ) ｗａｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ ０.０４. Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ＮＳＴ ｔｈａｎ ＧＳＴ(Ｐ<０.０１) ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ
ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙ ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｐａｔｔｅｒｎ. Ｃｏｎｊｏｉｎｔ Ｆｓｔ (０.８６４ ５２０)ꎬ ｇｅｎｅ ｆｌｏｗꎬ ＧＳＴ ａｎｄ ＡＭＯＶＡ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｌ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａ ｓｉｇ￣
ｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆｌｏｗ
ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｅｅ ｔｅｎ￣
ｔａｔｉｖｅ ｃｌａｄｅｓ (ⅠꎬⅡａｎｄ Ⅲ) ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｍａｊｏｒｉｔｙ￣ｒｕｌｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒｅｅ. Ａｌｌ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒａｎｇｅ: Ｃｌａｄｅ
Ⅰｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｆｏｕｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ (ＣＺꎬ ＹＺꎬ ＳＮꎬ ＢＭ) ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｈｅｎｇｄｕａｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｒｅｇｉｏｎꎻ ＣｌａｄｅⅡｃｏｍ￣
ｐｒｉｓｅｄ ｏｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ (ＢＭＩ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｈｉｍａｌａｙａｓ ｒｅｇｉｏｎꎻ ａｎｄ Ｃｌａｄｅ Ⅲ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｔｗｏ ｐｏｐｕｌａ￣
ｔｉｏｎｓ (ＤＲꎬ ＮＬＭ) ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｉｍａｌａｙａｓ ｒｅｇｉｏｎ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ ｔｈｒｅｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｕｎｉｔｓ (ＥＳＵ) ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｆｏｒ
ｔｈｉｓ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｂａｉｍａｘｕｅｓｈａｎ ａｎｄ Ｃｉｚｈｏｎｇꎬ Ｂｏｍｉꎬ Ｎｉｅｌａｍｕ ａｎｄ Ｄｉｎｇｒｉ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｕｎｉｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｌｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉａｌ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓꎬ
ａｌｌ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｉｎ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｕａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬ Ｂａｉｍａｘ￣
ｕｅｓｈａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｙｕｎｎａｎ ａｎｄ Ｂｏｍｉ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｔｉｂｅｔ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｇｉｖｅｎ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｆｏｒ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｏｎ￣
ｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｉｄｅａｌ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａꎬ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄꎬ ｔｒｎＬ￣Ｆꎬ ｈａｐｌｏｔｙｐｅꎬ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　 　 胡黄连(Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ)为玄参科
的单种属植物ꎬ为中国￣喜马拉雅特有高山植物ꎬ分
布于我国云南西北部、西藏ꎬ海拔 ３ ６００~４ ２００ ｍ的
高山冷凉生境下ꎮ 胡黄连具有重要的药用价值ꎬ是
常用的中、藏药材ꎬ根状茎具有清湿热ꎬ除骨蒸、消疳
热的功效(中华人民共和国药典ꎬ２０１０)ꎮ 经过课题
组全面调查发现ꎬ胡黄连资源蕴藏量急剧下降ꎬ生存
受到严重威胁ꎮ 已被收载在«中国珍稀濒危植物名
录»«国家重点保护野生药材物种名录»中ꎬ目前对
胡黄连研究主要集中在资源调查 (杨少华等ꎬ
２００９)、栽培 (杨少华等ꎬ２００８)、化学 (黄开毅等ꎬ
２００８)、药理(高宏伟等ꎬ２０１１)几个方面ꎬ对胡黄连
遗传变异研究仅限于课题组前期基于 ＩＳＳＲ 分析
(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌꎬ ２０１１)ꎮ 近年来ꎬ叶绿体 ＤＮＡ (ｃｐＤＮＡ)
非编码区核苷酸序列变异已被经常用于分析植物的
种群遗传变异(刘阳等ꎬ２０１０ꎻ 苏英娟等ꎬ２００４)ꎬｃｐ￣
ＤＮＡ测序法可以避免其它基于 ＰＣＲ 的分子标记法
经常遇到的长度同塑性问题ꎬ在估算种群遗传结构
和基因流的能力方面具有较大优势(Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ
２００１ꎻ 苏应娟等ꎬ２００４)ꎮ 本研究选择用于胡黄连近
缘种(Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏｏａ)并且具有很好的位点变异
的 ｔｒｎＬ￣Ｆ片段对胡黄连开展了保护遗传学研究ꎬ旨
在检测胡黄连基于 ｃｐＤＮＡ遗传多样性水平、遗传结
构并确定优先保护种群ꎬ分析位于云南和西藏居群
在地区水平上是否存在显著分化ꎬ划分显著进化单
元ꎬ提出保护建议ꎬ其结果可以为胡黄连这一重要药
用资源的可持续利用奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 研究材料
本研究实验材料为采集自云南和西藏 ７个居群
共 ９１个个体ꎬ基本覆盖了该物种的所有已知分布
点ꎮ 每个居群的个体之间的距离至少 ５ ｍ以上ꎬ 避
２９６ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 １　 胡黄连 ７个居群的地理分布信息
Ｔａｂｌｅ １　 Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｓａｍｐｌｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
缩写
Ａｂｂｒｅｖｉａ￣
ｔｉｏｎ
取样地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
取样数量
Ｎｕｍｂｅｒ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ (ｍ)
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
ＢＭ 白马雪山
Ｂａｉｍａｘｕｅｓｈａｎ
２０ ４ ０４０ ２４°４４′ Ｎ ９８°５６′ Ｅ
ＳＮ 斯农
Ｓｉｎｏｎｇ
２０ ３ ６５０ ２８°２８′ Ｎ ９８°４４′ Ｅ
ＹＺ 永芝
Ｙｏｎｇｚｈｉ
１８ ３ ９００ ２８°１０′ Ｎ ９８°４６′ Ｅ
ＣＺ 茨中
Ｃｉｚｈｏｎｇ
１９ ３ ６２０ ２８°００′ Ｎ ９８°５０′ Ｅ
ＤＲ 定日
Ｄｉｎｇｒｉ
２０ ４ ２４８ ２８°０８′ Ｎ ８６°２６′ Ｅ
ＮＬＭ 聂拉木
Ｎｉｅｌａｍｕ
１９ ４ ０５０~４ ３００ ２９°４６′ Ｎ ８５°５７′ Ｅ
ＢＭＩ 波密
Ｂｏｍｉ
２０ ３ ８１０ ２９°４６′ Ｎ ９５°４１′ Ｅ
免采集到同一株的克隆ꎮ 选择幼嫩、干净的叶片ꎬ放
到硅胶中干燥保存ꎮ
研究材料采集点详细信息见表 １ꎬ凭证标本存
放于云南中医学院ꎮ
１.２ ＤＮＡ提取
参考 Ｄｏｙｌｅ(１９９１) ＣＴＡＢ 法ꎬ针对胡黄连叶片
在研磨过程中极易褐化的问题ꎬ 在研磨时加入适量
ＰＶＰ 粉ꎬ在 ６５ ℃温浴过程中ꎬ将 ２×ＣＴＡＢ 溶液与 ２
μＬ β￣巯基乙醇混合ꎬ以有效解决褐化问题ꎮ
１.３ ＰＣＲ扩增
引物序列为 ｔｒｎＬ: ５′￣ＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＧＡＣＧＣ￣
ＴＡＣＧ￣３′ꎻ ｔｒｎＦ: ５′￣ＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＡＧ￣３′ꎬ
引物由上海生工技术有限公司合成ꎮ ＰＣＲ 扩增程
序: ９４ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４ ℃３０ ｓꎬ ５５ ℃ ３０ ｓꎬ ７２ ℃
６０ ｓꎬ ３０个循环ꎻ末次循环 ７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎꎬ ４ ℃保
存ꎮ ＰＣＲ产物经 ２％的琼脂糖凝胶检测ꎬ扩增成功的
样品送中美泰和生物技术(北京)有限公司测序(所
有个体均进行双向测序)ꎮ
１.４ 数据处理与分析
将每条序列与 ｃｈｒｏｍａｓ 峰图逐一对比ꎬ结合
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １. ８３ 软件对序列进行排列校正ꎮ 用 Ｂｉ￣
ｏＥｄｉｔ软件统计序列信息和核苷酸组成变异ꎮ 用
ＤｎａＳＰ ４.０软件分析统计单倍型数目、单倍型频率、
单倍型多样度 (遗传多样度ꎬ ｈ)、核苷酸多样性
(Ｄｉｊ)、基因流(Ｎｍ)等指标ꎮ
运用 ＨＡＰＬＯＮＳＴ 程序计算胡黄连总遗传多样
性(ＨＴ)和居群内平均遗传多样性 (Ｈｓ)以及 ７ 个居
群间遗传分化系数(ＧＳＴ)ꎮ ＧＳＴ和 ＮＳＴ的比较采用 Ｕ
统计方法进行ꎮ 在揭示胡黄连遗传变异的分布以及
分化程度时ꎬ用 Ａｒｌｅｑｕｉｎ软件 ３.０１ 中的分子方差分
析 ＡＭＯＶＡ(Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖａｒｉａｎｃｅ)软件计
算遗传变异在居群内、居群间及云南和西藏 ２ 个地
区间的组成和单倍型分布的 ＦＳＴ评价ꎮ 应用 ＰＡＵＰ∗
４.０ ｂ１０软件中的最大简约性分析法(ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒ￣
ｓｉｍｏｎｙꎬ ＭＰ)对单倍型进行系统发育分析ꎬ 选择
Ｐｉｃｒｏｒｃｈｉｚａ ｋｕｒｒｏａ、Ｗｕｌｆｅｎｓｉｏｐｓｉｓ ａｍｈｅｒｓｔ、短筒兔儿草
(Ｌａｇｏｔｉｓ ｋｏｎｇｂｏｅｎｓｉｓ)、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｃｏｒｏｎｏｐｕｓ 作为外类
群ꎬ 把空位作为缺失ꎬ采用启发式方式搜索ꎬ得到一
致性系统树ꎮ 分支的可靠性进行 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ分析ꎬ 用
１ ０００次的重复检验各个分支的支持率ꎮ
２　 实验结果
２.１ 胡黄连 ｔｒｎＬ￣Ｆ序列变异分析
对胡黄连 ７个居群 ９１个个体进行了 ｃｐＤＮＡ片
段 ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的双向测定ꎬ序列长度在 ８７１~８７６ ｂｐ
之间ꎬ排序后长 ８６９ ｂｐꎮ 共检测到 ５ 种单倍型
(Ｈａｐ１~Ｈａｐ５)ꎮ 单倍型序列比对后共发现 １３ 处变
异位点:１２处碱基替换和 １ 处插入或缺失ꎬ其中 １２
处替换包括 ２ 处碱基转换ꎬ１０ 处碱基颠换(表 ２)ꎮ
通过统计 ９１ 个个体的序列发现ꎬ碱基 Ａ / Ｔ 含量丰
富ꎬ占整个序列的比例为 ６４.９３％~６５.１％ꎬ这与大多
数植物叶绿体 ＤＮＡ碱基组成成分相符(苏应娟等ꎬ
２００４ꎻ陈生云等ꎬ２００８)
２.２ 胡黄连单倍型分布、单倍型多样性、核苷酸多样性
胡黄连每个居群单倍型数目、组成、频率、多样
性以及核苷酸多样性指数见表 ３ꎮ 胡黄连共有 ５ 个
单倍型ꎬ分别是 Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５ꎬ单倍型 Ｈ１、Ｈ３、
Ｈ４、Ｈ５占绝对优势ꎬ单倍型 Ｈ４ 的频率最高ꎬ在 ＤＲ
居群和 ＮＬＭ２个居群中出现ꎬ有 ２７ 个个体ꎬ占总个
体数的 ３０％ꎬ而单倍型 Ｈ２的分布频率最低ꎬ仅在居
群 ＢＭ 中有 ２ 个个体ꎮ Ｈ３ 在 ＣＺ 居群、ＳＮ 居群和
ＹＺ居群中出现ꎮ 西藏 ３ 个居群共有 ２ 个单倍型即
Ｈ４、Ｈ５ꎬ云南 ４ 个居群共有 ３ 个单倍型即 Ｈ１、Ｈ２、
Ｈ３ꎬ西藏和云南 ２ 个地区的所有单倍型均不共享ꎬ
均为各自独特的单倍型ꎬ这也为胡黄连药材的产地
鉴定提供了可能ꎮ 由单倍型地理分布可见ꎬ胡黄连
在云南和西藏 ２个地区间存在一定程度的隔离ꎮ
３９６６期　 　 　 　 　 　 　 　 李国栋等: 基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的胡黄连保护遗传学研究
表 ２　 胡黄连叶绿体 ＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ片段 ５个单倍型间的序列变异位点
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｎＬ￣Ｆ ａｍｏｎｇ ５ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
变异位点
Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
１０
３
２３
４
２３
８
２７
７
３９
２
４５
８
４８
５
５４
７
６５
８
６８
４
８１
８
８３
１
８５
２
Ｈ１ Ｇ Ｔ － Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ
Ｈ２ Ｔ Ｔ － Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ
Ｈ３ Ｇ Ｔ － Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ
Ｈ４ Ｇ Ａ － Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｇ
Ｈ５ Ｇ Ａ ▲ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ
　 ▲＝ＴＣＡＡＡ
表 ３　 胡黄连 ７个居群叶绿体 ＤＮＡ单倍型的遗传多样度、组成和频率
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ５ ｃｐＤＮＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ７ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
居群
Ｐｏｐｕｌａｉｔｏｎ
样本数
Ｓａｍｐｌｅ
ｎｕｍｂｅｒ
单倍型数目
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｈａｐｌｏｔｙｐｅ
单倍型组成、频率 Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
Ｈ１ Ｈ２ Ｈ３ Ｈ４ Ｈ５
核苷酸多样性
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
(Ｄｉｊ)
单倍型多样性
Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
(ｈ)
ＢＭ １１ ４ ９ ２ ０.０００３８ ０.３２７２７
ＳＮ １２ １ １２ ０.０００００ ０.０００００
ＹＺ １２ ２ １２ ０.０００００ ０.０００００
ＣＺ １１ ２ １０ １ ０.０００２１ ０.１８１８２
ＤＲ １６ １ １６ ０.０００００ ０.０００００
ＢＭＩ １８ ２ １８ ０.０００００ ０.０００００
ＮＬＭ １１ １ １１ ０.０００００ ０.０００００
　 　 胡黄连具有较低的单倍型多样性 ( Ｈｄ ＝
０.４３４ １９)和核苷酸多样性(Ｄｉｊ ＝ ０.００４ ６６)ꎮ 各个
居群中ꎬ只有 ＢＭ 居群的单倍型多样性较高(Ｈｄ ＝
０.３２７ ２７)ꎬ 其余居群的单倍型多样性均较低ꎬ其中
ＳＮ和 ＹＺ居群均为同源组成ꎮ 地区水平上ꎬ云南的
单倍型多样性(Ｈｄ ＝ ０. ５４３ ９６)高于西藏(Ｈｄ ＝
０.０００ ０)ꎮ
２.３ 遗传多样性和遗传结构
胡黄连 ７ 个居群 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ 多样性在居群
间的分化程度ꎬ两种中性检验法检验的结果均为正
值 ( Ｆｕ ａｎｄ Ｌｉ′ ｓ Ｄ∗ ＝ １. ４７０ ３４ 和 Ｔａｊｉｍａ′ ｓ ＝
１.８９６ ０２)ꎬ并且均呈显著水平(０.１０>Ｐ>０.０５)ꎮ 同
时ꎬ对胡黄连居群 ｔｒｎＬ￣Ｆ 片段序列数据的歧点分布
分析显示观测值和期望值两者比较得到的是一个非
单峰分布图(图 １)ꎬ此图明显偏离了群体扩张模型ꎬ
结果表明胡黄连可能未曾经历过居群扩张ꎮ
根据胡黄连 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列变异(ｇａｐ ａｓ ｔｈｅ
ｆｉｆｔｈ ｓｔａｔｅ)采用 Ｎｅｉ(１９７３)的算法估算出的居群间分
化度(Ｆｓｔ)为 ０.８６４ ５２ꎬ基因流(Ｎｍ)为 ０.０４ꎬ表明胡
黄连各个居群间存的分化较大ꎮ 在云南和西藏 ２ 个
地区内ꎬ云南居群间的 Ｆｓｔ 为 ０ ~ ０.９０４ ３８ꎬ Ｎｍ 为
０.０８ꎬ西藏居群间的 Ｆｓｔ为 ０~１.０００ꎬ Ｎｍ为 ０ꎬ说明 ２
个地区内居群间的基因交流也近乎为零ꎮ
胡黄连总的遗传多样性 ＨＴ(ｓｅ)、居群内平均遗
传多样性 ＨＳ(ｓｅ)、７ 个居群间遗传分化 ＧＳＴ(ｓｅ)和
ＮＳＴ(ｓｅ)值分别为 ０.８６１ (０.０４４３)、０.０７３ (０.０４９６)、
０.９１６ (０.０５７ ５)和 ０.９８７ (０.０１３ ３)ꎮ 使用 Ｕ统计法
检验胡黄连所有单倍型变异的地理结构ꎬ结果发现
ＮＳＴ>ＧＳＴ(Ｐ<０.０１)ꎬ以上分析结果均表明胡黄连在整
个中国￣东喜马拉雅分布区内ꎬ居群间的遗传分化水
平非常高(ＧＳＴ ＝ ０.９１６)ꎬ单倍型的亲缘关系越相近
越倾向于分布于同一居群中ꎬ并且有着明显的亲缘
地理结构存在ꎮ 将胡黄连按照地区分为云南和西藏
２个组后ꎬ ＡＭＯＶＡ 分析也表明ꎬ胡黄连居群只有
０.７８％的遗传变异发生在居群内ꎬ而 ６０.９７％遗传变
异发生在地区内居群间ꎬ３８.２５％遗传变异发生在地
４９６ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
区间(表 ４)ꎬ 这也揭示了胡黄连的遗传变异主要存
在于居群间ꎬ而且具有相当高的居群分化水平ꎮ
表 ４　 胡黄连 ２个地区之间的 ｃｐＤＮＡ ＡＭＯＶＡ分析
Ｔａｂｌｅ ４　 ＡＭＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ ｆｒｏｍ
ｔｗｏ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
变异分类
Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
自由度
ｄｆ
总方差
Ｓｕｍ ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
变异组分
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
占总变异百分比
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ
地区间
Ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐｓ
１ ９９.５７１ １.４８２ ８８ Ｖａ ３８.２５
地区内居群间
Ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
ｗｉｔｈｉｎ ｇｒｏｕｐｓ
５ １５１.１８１ ２.３６３ ５１ Ｖｂ ６０.９７
居群内
Ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
８４ ２.５４５ ０.０３０ ３０ Ｖ ０.７８
图 １　 胡黄连 ｃｐＤＮＡ序列的失配分布图　
实线 Ｅｘｐ￣预期值ꎻ虚线 Ｏｂｓ￣观测值ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｐＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｏｆ
Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ　 Ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｖａｌｕｅꎻ ｄｏｔｔｅｄ ｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｖａｌｕｅ.
２.４ “显著进化单元”的划分
用粗筒兔儿草等做外类群对 ５个单倍型构建系
统发育多数一致性树ꎬ通过启发式搜索得到一棵多
数一致性树ꎬ得到了 ３ 个进化分支(ＧｒｏｕｐⅠ－Ⅲ)ꎬ
如图 ２ꎮ 组Ⅰ和组Ⅱ共同构成一个单系ꎬ具有 ５４％
的支持率ꎮ 组Ⅰ的单倍型为分布在横断山区的 ４ 个
居群(ＢＭ、ＹＺ、ＳＮ、ＣＺ)ꎬ构成一个单系ꎬ具有 ９０％的
支持率ꎬ组Ⅱ的单倍型分布在东喜马拉雅北端的 ２
个居群(ＤＲ、ＮＬＭ)ꎬ组Ⅲ的单倍型分布在东喜马拉
雅的居群(ＢＭＩ)ꎬ与 Ｐ. ｋｕｒｒｏｏａ 聚为一支ꎬ具有 ７８％
的支持率ꎮ 因此 ＧｒｏｕｐⅠ、ＧｒｏｕｐⅡ、ＧｒｏｕｐⅢ各自划
分为一个 ＥＳＵꎮ
遗传距离计算的结果支持 ３个 ＥＳＵ 的划分(表
５)ꎬ３个 ＥＳＵ内两两居群间的遗传距离≤１.１８２ (对
角线以下ꎬ不加粗部分)ꎬＥＳＵ 之间的两两居群间的
遗传距离≥１.３９９(对角线以下ꎬ加粗部分)ꎮ 居群内
平均遗传距离为 ０ ~ ０.３２７ꎬＥＳＵⅠ、Ⅱ、Ⅲ内平均遗
传距离分别为 ０.０００、０.００１、０.０００ꎮ ９１ 个个体两两
的遗传距离为 ０.０００~０.０１３ꎮ
对 ３个 ＥＳＵｓ 进行 ＡＭＯＶＡ 分析和相应的 Ｆ 检
验的结果(表 ６)可见ꎬ遗传变异主要存在于 ＥＳＵｓ
间ꎬ所占比例高达 ９４.２２％ꎬＥＳＵｓ内居群间的遗传变
异仅占 ５.０９％ꎬ居群内的遗传变异几乎可以忽略不
计ꎬ仅为 ０.６９％ꎬ因此ꎬＡＭＯＶＡ的结果也支持胡黄连
３个 ＥＳＵｓ的划分ꎮ
图 ２　 胡黄连 ５个单倍型的多数一致性树ꎬ
显示 ５０％以上的支持
Ｆｉｇ. ２　 Ｍａｊｏｒｉｔｙ￣ｒｕｌｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｏｆ ５ ｃｐＤＮＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ
Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａꎬ ｓｈｏｗｉｎｇ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ５０％ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｐｏｒｔ
３　 讨论
３.１ 胡黄连遗传分化程度
胡黄连的 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ片段检测结果发现ꎬ在
单倍型序列的 １３ 个变异位点中ꎬ小片段的插入 /缺
失仅占了 １个ꎬ而点突变占了 １２个ꎮ 由此表明了胡
黄连单倍型序列间的分化水平较高ꎬ种内遗传分化
经历的时间较长ꎮ
对胡黄连整个地理分布区的 ７ 个居群 ９１ 个个
体进行的 ｔｒｎＬ￣Ｆ 基因间区检测发现ꎬ胡黄连总的遗
传多样性(ＨＴ ＝ ０.８６１)和居群间遗传分化程度都很
高(Ｇｓｔ ＝ ０.９１６)ꎮ 这与 ＩＳＳＲ 分子标记的分析结果
一致(ｌｉｕ ｅｔ ａｌꎬ ２０１１)ꎮ 居群间遗传分化程度较之大
多数物种高ꎬ如条纹狭叶龙胆 (Ｍｅｔａｇｅｎｔｉａｎａ ｓｔｒｉａ￣
ｔａ)ꎬ Ｇｓｔ＝０.８５９(陈生云等ꎬ２００８)、偏花报春(Ｐｒｉｍｕｌａ
５９６６期　 　 　 　 　 　 　 　 李国栋等: 基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的胡黄连保护遗传学研究
表 ５　 胡黄连 ７个居群间和居群内的遗传距离
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ７ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
居群
ＰＯＰ
ＥＳＵ Ⅰ
ＢＭ ＳＮ
ＥＳＵ Ⅱ
ＹＺ 　 ＣＺ
ＥＳＵ Ⅱ
ＤＲ 　 ＮＬＭ
ＥＳＵ Ⅲ
ＢＭＩ
ＢＭ ０.３２７ ０.９４１ ０.９４１ ０.１９３ ０.０００ ２.９２７
ＳＮ １.１８２ ０.０００ ０.０００ ０.８４５ １.５９３ １.５９３ ３.００１
ＹＺ １.１８２ ０.０００ ０.０００ ０.８４５ １.５９３ １.５９３ ３.００１
ＣＺ ０.２７３ ０.９０９ ０.９０９ ０.１８２ １.２９７ １.２９７ ２.２９２
ＤＲ １.３９９ ３.０００ ３.０００ ２.０９１ ０.０００ ０.０００ ２.６３２
ＮＬＭ １.３９９ ３.０００ ３.０００ ２.０９１ ０.０００ ０.０００ ２.６３２
ＢＭＩ １０.１８２ １１.０００ １１.０００ １０.０９１ ８.０００ ８.０００ ０.０００
　 注: 对角线下为居群间遗传距离ꎬ 对角线上为标准误ꎬ下划线为居群内遗传距离ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: Ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ａｒｅ ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｄｉａｇｏｎａｌ(ｍｅａｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ＥＳＵ). ＳＥ ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ａｂｏｖｅ ｄｉａｇｏｎａｌ. Ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｍｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
表 ６　 胡黄连 ７个居群不同层次 ＡＭＯＶＡ分析
Ｔａｂｌｅ ６　 ＡＭＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｆｏｒ ７ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎ. ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ
不同层次
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ
自由度
ｄｆ
平方和
Ｓｕｍ ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
变异成分
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
变异组成
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
Ｆ￣检验
Ｆ￣ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ
Ｐ值
Ｐ￣ｖａｌｕｅ
显著进化单元间
Ａｍｏｎｇ ＥＳＵｓ
２ ２３９.９７１ ４.１５１ ０７ Ｖａ ９４.２２ ＦＣＴ＝ ０.９４２ ２０
显著进化单元内居群间
Ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ＥＳＵｓ
４ １０.７８１ ０.２２４ ３４ Ｖｂ ５.０９ ＦＳＣ＝ ０.８８１ ００
居群内
Ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
８４ ２.５４５ ０.０３０ ３０ Ｖｃ ０.６９ ＦＳＴ＝ ０.９９３ １２
<０.０１
<０.０１
<０.０１
　 注: 显著性检验用 １ ０２３次置换ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｅｓｔｓ ｕｓｉｎｇ １ ０２３ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ.
ｓｅｃｕｎｄｉｆｌｏｒａ)ꎬ Ｇｓｔ ＝ ０.８１６(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ ２００８)、肋果
沙棘(Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｎｅｕｒｏｃａｒｐａ)ꎬＧｓｔ ＝ ０. ６４６(孟丽华
等ꎬ２００８)等ꎮ 胡黄连的 ｃｐＤＮＡ 多样性水平高于
Ｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ(２００５)所统计的 １７５ 种种子植物的平均
ｃｐＤＮＡ多样性 ＨＴ ＝ ０.６７ꎮ ＡＭＯＶＡ 分析也表明ꎬ胡
黄连 ９９.２２％遗传变异发生在居群间ꎬ基因流仅为
０.０４ꎬ 说明胡黄连具有很高的遗传分化水平ꎬ而且
居群间几乎没有基因交流ꎮ Ｏｕｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ(１９９９)认
为种群间一粒种子或一个花粉粒的交流就会导致
Ｇｓｔ值达到 ０.２０ꎬ这说明胡黄连种群间存在极低的花
粉或种子交流ꎮ 根据 ｃｐＤＮＡ 得出的 Ｇｓｔ 值反映种
子迁移对基因流的贡献ꎬ而根据核基因组分子标记
ＩＳＳＲ计算出的 Ｇｓｔ值既反映了种子迁移对基因流的
贡献ꎬ同时也反映了花粉运动对基因流的贡献ꎮ 因
此对于胡黄连而言ꎬ花粉运动对基因流的贡献要比
种子稍大ꎮ
胡黄连居群间如此大的遗传分化和如此低的基
因流这可能与喜马拉雅和横断山区的生境复杂度有
关ꎮ ５个单倍型在 ２ 个地区中的分布呈现较大差
异ꎬ所有单倍型在 ２个地区间均不共享ꎬ而是为各自
独有ꎬ在西藏地区ꎬ聂拉木(ＮＬＭ)和定日(ＤＲ)共享
一个单倍型(Ｈ４)ꎬ居群波密 (ＢＭＩ) 居群独有一个
单倍型(Ｈ５)ꎬ从胡黄连单倍型多数一致性树(图 ２)
可见西藏的 ２个单倍型不构成一个单系ꎬ这一结果
显然也说明胡黄连存在分化明显的遗传谱系ꎬ ＢＭＩ
与 Ｐ. ｋｕｒｒｏｏａ聚为一支ꎬ这是否意味着该属分类地
位上存在一定的疑问? 有待于深入研究ꎮ
３.２ 显著进化单元的划分及胡黄连保护
本研究根据多数一致性树划分的 ３ 个 ＥＳＵｓꎬ
从居群间的遗传距离矩阵也得到很好的支持ꎬ所有
３个 ＥＳＵ 内两两居群间的遗传距离小于 ＥＳＵ 之间
的两两居群间的遗传距离 (分别是≤１. １８２ 和≥
６９６ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
１.３９９)ꎬ表明 ＥＳＵｓ 内的居群之间遗传分化程度低ꎬ
ＥＳＵｓ之间遗传分化程度高ꎮ
ＥＳＵⅠ 包括了 ４ 个居群分别是 ＢＭ、ＣＺ、ＹＺ、
ＳＮꎬ占有 ３个单倍型(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)ꎬ 从单倍型在这
个 ４个居群的分布来看ꎬ必须优先保护的是 ＢＭ 和
ＣＺ居群ꎮ 其中 ＢＭ居群的保护任务是最紧迫的ꎬ因
为 ＢＭ 居群具有独特的单倍型 Ｈ２ꎬ而 ＣＺ 包含了
Ｈ１、Ｈ３２个单倍型ꎬ因此保护这 ２ 个居群就等于保
护了所有的遗传变异ꎮ 目前 ＢＭ居群分布于白马雪
山国家级自然保护区内ꎬ但由于此居群与胡黄连的
其它居群相比ꎬ交通相对便利ꎬ云南省迪庆州德钦县
的藏医日常使用常在此处采挖ꎬ保护区由于地域广
阔ꎬ人力物力限制ꎬ对濒危植物的保护相对较薄弱ꎬ
因此此居群境况堪忧ꎮ 按照 ＥＳＵ 的保护原则是种
群的遗传组成越独特ꎬ越具有优先保护价值ꎬ因而
ＢＭ居群是需要重点保护的居群ꎬ因为这个居群的
消失会对胡黄连的遗传多样性造成重大影响ꎮ ＣＺ
居群离附近的村庄比较远ꎬ居群附近生境恶劣ꎬ鲜有
人烟活动ꎬ受到威胁的可能性较小ꎮ
ＥＳＵⅡ包括了 ＤＲ和 ＮＬＭ２个居群ꎬ只有这 ２个
居群具有单倍型 Ｈ４ꎬ因此也具有独特性ꎮ ＮＬＭ 居
群分布于聂拉木县城附近ꎬ每年都有药材收购商到
当地收购胡黄连药材ꎬ当地药农往往组织成小分队
的形式进行采挖ꎬ因此对 ＮＬＭ 居群的干扰特别大ꎬ
而 ＤＲ居群是位于日喀则地区定日县融霞乡的一个
居群ꎬ多年前被定日县的藏医采收过ꎬ由于资源已严
重匮乏ꎬ当地藏医已多年未曾来此地采集ꎬ此居群由
于地处偏远、交通不便受人类干扰相对较小ꎬ但此居
群很小ꎬ能够自然复壮的几率很低ꎮ 这 ２ 个居群已
经处于珠穆朗玛峰国家级自然保护区内ꎬ尽管此保
护区主要保护高山、高原生态系统ꎬ但由于地域广
阔ꎬ对胡黄连的保护没有受到足够重视ꎮ 综上所述ꎬ
ＤＲ居群可以采用就地保护措施ꎬ而对严重受人类
干扰的 ＮＬＭ居群的最佳保护措施则是迁地保护ꎬ由
于两者具有共同的单倍型ꎬ因此 ２ 个居群能够保护
好一个居群即可ꎮ
ＥＳＵⅢ 只包含一个居群即 ＢＭＩ 居群ꎬ并且具有
一个独特的单倍型 Ｈ５ꎬ 结合 ＩＳＳＲ分子标记研究结
果ꎬＢＭＩ 居群是所有居群中遗传多样性水平最低的
一个(ＰＰＢ＝ ４.８８)ꎬ因而此居群胡黄连具有重要的
保护价值ꎮ 在调查中发现此居群胡黄连数量已非常
少ꎬ呈零星分布ꎬ距离最近的是波密县城ꎬ波密县以
旅游业为主ꎬ未见藏医院以及藏医ꎬ因而此地对胡黄
连的利用很少ꎬ但胡黄连为何会数量如此之少ꎬ原因
现无从得知ꎮ 从保护遗传差异性居群角度ꎬ此居群
由于遗传的特异性ꎬ需要就地保护ꎮ
由于胡黄连的遗传多样性主要分布在居群间ꎬ
若有条件在高海拔地区建设胡黄连种质资源圃对胡
黄连进行迁地保护时ꎬ样品采集应该覆盖尽可能多
的居群而避免从一 ２个居群采集多个个体ꎮ
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７９６６期　 　 　 　 　 　 　 　 李国栋等: 基于 ｃｐＤＮＡ ｔｒｎＬ￣Ｆ序列的胡黄连保护遗传学研究