全 文 ：华北农学报·2016，31(2) :211 -217
收稿日期:2016 － 02 － 19
基金项目:国家公益性(农业)行业科研专项资助项目(201303028) ;山东省科技发展计划资助项目(2014GNC111008) ;山东省自然科学
基金项目(ZＲ2015CQ022)
作者简介:孙晓辉(1989 －) ，男，山东威海人，在读硕士，主要从事植物病理学研究。
通讯作者:竺晓平(1966 －) ，男，江苏六合人，教授，博士，主要从事植物病理学研究。
山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及
黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定
孙晓辉1，王树森2，高利利1，乔 宁3，刘永光3，赵 静3，竺晓平1
(1．山东农业大学 植物保护学院，山东省蔬菜病虫生物学重点实验室，山东 泰安 271018;2．山东省诸城市
农业农村综合办公室，山东 诸城 262200;3．潍坊科技学院 蔬菜花卉研究所，山东 寿光 262700 )
摘要:为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类，从山东诸地 11 个蔬菜种植区采集了 867 个葫芦科蔬
菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南
瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样
品分别进行 ＲT-PCＲ 检测，各病毒检出率分别为 34． 8%，10． 4%，20． 0%，41． 7%，27． 0%，7． 8%，2． 6%，1． 7%，0，
0. 9%。表明除 PNＲSV外，其他 9 种病毒在山东各地均有发生，且 CMV和 TMV发病率较高，2 种或 2 种以上病毒复合
侵染也很普遍。同时为明确山东地区 CMV分离物的株系分化状况，选取 11 个地区有代表性的 CMV 阳性样品，测定
其外壳蛋白(Coat protein，CP)和 ＲNA3 核苷酸序列并进行序列比对和进化分析，结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜
的 CMV分离物均属于 IB亚组，与韩国分离物 As(AF013291)相似性最高，未发现其他株系。
关键词:瓜类病毒病;黄瓜花叶病毒;ＲT-PCＲ;亚组
中图分类号:S432． 4 + 1 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2016)02 － 0211 － 07
doi:10． 7668 /hbnxb． 2016． 02． 034
Detection of Viruses Infecting Cucurbit Vegetables in Shandong and
Identification of Subgroup of the Cucumber mosaic virus Isolates
SUN Xiaohui1，WANG Shusen2，GAO Lili1，QIAO Ning3，
LIU Yongguang3，ZHAO Jing3，ZHU Xiaoping1
(1． College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Shandong Provincial Key Laboratory for
Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests，Taian 271018，China;2． Zhucheng Intergrated Office
of Agriculture and Countryside，Zhucheng 262200，China;3． Institute of Vegetables and Flowers，Weifang
University of Science and Technology，Shouguang 262700，China)
Abstract:In order to detect and identify the viral causing agent that infecting cucurbit vegetable plants in
Shandong，867 cucurbit plant samples of suspected viral diseases from 11 vegetable planting areas in Shandong were
collected during July to August，2014． 9 primer pairs specific to Cucumber mosaic virus(CMV) ，Cucumber green
mottle mosaic virus(CGMMV) ，Watermelon mosaic virus(WMV) ，Tobacco mosaic virus(TMV) ，Zucchini yellow mo-
saic virus(ZYMV) ，Squash mosaic virus(SqMV) ，Melon yellow spot virus(MYSV) ，Cucurbit chlorotic yellows virus
(CCYV) ，Prunus necrotic ringspot ilarvirus(PNＲSV)and Melon necrotic spot virus(MNSV)were used respectively to
perform PCＲ detection． The results showed that viruses carried rate was 34． 8%，10． 4%，20． 0%，41． 7%，27． 0%，
7． 8%，2． 6%，1． 7%，0 and 0． 9% respectively． The natural infection of these viral diseases except PNＲSV in
Shandong was confirmed，and the incidence of CMV and TMV were higher than others． Two or more than two viruses
mixed infections were also very common in field． At the same time，those CMV positive samples from 11 regions
212 华 北 农 学 报 31 卷
were selected for subgroup classification． Coat protein(CP)gene and the whole ＲNA3 nucleotide sequences were
determined． Sequence alignment and phylogenetic analyses were performed． The results showed that the CMV iso-
lates of cucurbit vegetables in Shandong area were all members of CMV subgroup IB with the highest similarity to a
South Korea isolate As(AF013291) ，no other strains were found．
Key words:Cucurbit viral disease;Cucumber mosaic virus;ＲT-PCＲ;Subgroup
病毒病的蔓延流行严重制约着黄瓜、西葫芦和
西瓜等葫芦科蔬菜的生产，葫芦科蔬菜病毒病种类
有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟
草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜绿斑
驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，
CGMMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，
WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic
virus，ZYMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，
SqMV)、番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus，
PＲSV)、南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne
yellows virus，CABYV)、李属坏死环斑病毒(Prunus
necrotic ringspot ilarvirus，PNＲSV)、甜瓜坏死斑点病
毒(Melon necrotic spot virus，MNSV)等 38 个确定种 9
个暂定种和 1 种类病毒确定种［1］，在我国主要有
PＲSV［2］、CABYV［3］、SqMV［4］、CMV［5］、WMV［6］、
ZYMV［7］、TMV［8］、CGMMV［9］、MNSV［10］等。山东省
作为主要的设施蔬菜产区，葫芦科蔬菜上病毒病的
发生比较严重，据有关学者的报道［5 － 12］表明，病毒
的种类也较多［5 － 12］，但多年来缺少针对葫芦科蔬菜
病毒病的系统及全面的检测和鉴定。
本试验通过分子检测手段对山东葫芦科蔬菜上
的病毒病病原种类及其主次关系进行了全面检测和
鉴定，并针对近年来在山东蔬菜产区发病较为普遍
的 CMV，通过序列测定确定了其亚组归属，以期为
葫芦科蔬菜上抗病品种的选育及病毒病的防治提供
科学依据。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 感病样品采集 2014 年 7 － 8 月，从山东的
泰安、淄博、潍坊、临沂、聊城、菏泽、青岛、烟台、威
海、日照、济宁 11 个地级市的南瓜、丝瓜、黄瓜、西
瓜、西葫芦产区共采集到 867 个葫芦科蔬菜疑似感
病样品，其中设施蔬菜 567 株，种苗 300 株。将采集
到的样品保存在 － 80 ℃冰箱，用于后续试验。
1． 1． 2 菌株、载体和生化试剂 大肠杆菌 DH5α 菌
株由山东省蔬菜病虫生物学实验室留存;Ｒecombi-
nant ＲNase Inhibitor、Ｒeverse Transcriptase M-MLV
(ＲNase H-)、T4 DNA 连接酶及克隆载体 pMD18-T
购自宝生物工程(大连) (TaKaＲa Biotechnology，
Dalian)有限公司;快捷型琼脂糖凝胶 DNA 回收试
剂盒Ⅱ(离心柱型)购自北京百泰克生物技术(Bio
Teke Corporation)有限公司;TＲIzol 试剂、TaqDNA聚
合酶、dNTPs及 DNA分子量标准 Trans 2K plus均购
自北京全式金生物技术(Trans Gen Biotech)有限公
司;其他常用生化试剂均为进口或国产分析纯。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 山东葫芦科蔬菜病毒病种类检测 本试验
用引物序列见表 1。ＲNA 提取采用 TＲIzol 法，而后
利用 CMV、CGMMV、TMV、ZYMV、WMV、CCYV、
PNＲSV和 MYSV等特异性引物对葫芦科疑似感病
样品分别进行 ＲT-PCＲ 检测，反应程序为:预变性
94 ℃ 3 min;变性 94 ℃ 30 s，退火(退火温度)30 s，延
伸 72 ℃ 1 min，共 32个循环;终延伸 72 ℃ 10 min。
取 25 μL PCＲ 扩增产物与 4 μL 6 × Loading
Buffer混合于 1%的琼脂糖凝胶上检测并拍照记录
试验结果。从各县 \区阳性样品中，选择 1 ～ 2 个切
取目的条带利用凝胶回收试剂盒回收，回收产物纯
化后与 pMD18-T Vector 连接转化大肠杆菌 DH5α，
用含氨苄青霉素(Amp)的培养基进行筛选。阳性
克隆经菌液 PCＲ 验证后委托上海铂尚生物科技有
限公司进行测序。
1． 2． 2 CMV 序列分析及株系鉴定 从山东 11 个
地区感病样品中分别选取具有代表性的分离物的
CMV CP和 ＲNA3 阳性克隆送铂尚生物技术(上海)
有限公司测序。所得序列在 NCBI 上利用 Blast 进
行检索，利用 DNAStar软件中的 MegAlign 将所得序
列与 GenBank中已登录的亚组 IA、亚组 IB 和亚组
II的代表序列进行同源性比对。利用软件 Mega
5. 05 的 Clustal W 法进行多序列比对分析以及邻接
法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树，系统进化
树中各分支置信度(Bootstrap)进行 1 000 次重复
分析。
2 结果与分析
2． 1 病毒检出率和复合病毒检出率
在山东采集的 567 个设施样本中检测到 CMV、
CGMMV、TMV、ZYMV、WMV、SqMV、CCYV、MYSV
2 期 孙晓辉等:山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定 213
表 1 用于病毒检测的引物序列
Tab． 1 Primer sequences for virus detection
名称
Name
序列
Sequence
片段大小 /bp
Fragment size
退火温度
/℃ Tm
TMV-F［4］ GCCGACCCAATAGAGTTA 410 50
TMV-Ｒ GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG
SqMV-F［4］ AGGCACATTTCGCAGTTC 354 50
SqMV-Ｒ CGATGGTTGCCTTTATGT
WMV-F［4］ CCAGTGGCAAAGGTGATA 485 56
WMV-Ｒ TGCTGCGTCTGAGAAATG
ZYMV-F［4］ GGAGCGGAAACAAGTGAA 542 52
ZYMV-Ｒ ACCTGCTCATTCCCATCC
CGMMV-F［9］ ATGGCTTACAATCCGATCACACC 486 59
CGMMV-Ｒ CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC
MYSV-F［11］ GACAACAGGGCAGAGCGAATG 505 58
MYSV-Ｒ TACCGTTACTAAGCTGACAAAGGAGAA
CCYV-F［12］ CGTAAGTGATCGCAATCAAT 876 54
CCYV-Ｒ AGTGATCACTTGACCATCTCC
CMV-CPF［13］ ATGGACAAATCTGAATCAACC 777 52
CMV-CPＲ TAAGCTGGATGGACAACCCGT
CMV-3F［14］ AATCGGATCCGTAATCTTACCACTGTGTGTGTG 2 220 62
CMV-3Ｒ AATTCTGCAGTGGTCTCCTTTTＲGAG
PNＲSV-F［15］ ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA 449 54
PNＲSV-Ｒ TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG
MNSV-F［16］ TCTACCTCTGCTAGCGAATC 710 53
MNSV-Ｒ GGTGCTACCAGCACCAGA
和 MNSV 9 种病毒的存在，所有检测到的病毒均经
测序验证为该种病毒，没有检测到 PNＲSV病毒的存
在，各病毒的样本检出率见图 1，其中从图 1 中可以
看出 TMV 和 CMV 的病毒检出率最高，ZYMV 和
WMV其次，CCYV、MYSV和 MNSV的病毒检出率相
对较低，300 株种苗带毒率为 14． 7%。另外，在采集
到的设施样本中发现病毒的综合复合侵染率为
37. 4%，2 种病毒的复合侵染率为 18． 2%，3 种病毒
的复合侵染率为 11． 3%，4 种病毒的复合侵染率为
3． 5%，5 种病毒的复合侵染率为 4． 4%，未测到更多
种病毒的复合侵染。
图 1 单一病毒检出率和复合病毒检出率
Fig． 1 Detection rate of single virus and detection rate of composite virus
2． 2 CMV PCＲ扩增结果及亚组鉴定
2． 2． 1 以待测葫芦科样品提取的 ＲNA 为模板，利
用特异性引物 CMV-CPF /Ｒ 和 CMV3F /Ｒ 进行 ＲT-
PCＲ扩增，取 5 μL扩增产物利用 1． 2%琼脂糖凝胶
进行电泳检测分析。结果如图 2，分别出现 777 bp
左右的条带(分别包含 CP 全基因组片段及其上下
游侧翼序列)和 2． 3 kb 左右的条带(分别包含
ＲNA3 全基因组片段及其上下游侧翼序列)。
214 华 北 农 学 报 31 卷
A．特异性引物 CMV-CPF /CMV-CPＲ扩增结果:1 ～ 11．葫芦科样品;M． Trans 2K Plus DNA Marker;CK．阴性对照;
B．特异性引物 CMV3ＲF /CMV3ＲＲ扩增结果:1 ～ 6．葫芦科样品;M． Trans 2K Plus DNA Marker;CK．阴性对照。
A． Specific primer CMV-CPF /CMV-CPＲ amplification results;1 － 11． Gourd family sample;M． Trans 2K Plus DNA Marker;CK． Negative control;
B． Specific primer CMV3ＲF /CMV3ＲＲ amplification results;1 － 6． Gourd family sample;M． Trans 2K Plus DNA Marker;CK． Negative control．
图 2 CMV检测结果
Fig． 2 Detection results of CMV
表 2 用来比较的黄瓜花叶病毒山东分离物与其他地区分离物的信息
Tab． 2 Information of isolates of Cucumber mosaic virus in Shandong and other regions for comparison
分离物
Isolates
name
地点
Loca．
tion
登录号
Accession
No．
寄主植物
Host
plant
片段
Protein
分离物
Isolates
name
地点
Loca．
tion
登录号
Accession
No．
寄主植物
Host
plant
片段
Protein
SD-HZ 菏泽 KP710840 西瓜 CP BY16 湖北 KF564789 芋头 CP
SD-JN 济宁 KP710854 南瓜 CP Cah1 浙江 FJ268746 美人蕉 CP
SD-LC 聊城 KP710841 丝瓜 CP CMV-Cu 伊朗 EF620777 黄瓜 CP
SD-LY 临沂 KP710842 丝瓜 CP HB24 郑州 KC019301 不确定 CP
SD-QD 青岛 KP710843 南瓜 CP SFQT1-2 新疆 HQ283393 番茄 CP、ＲNA3
SD-ＲZ 日照 KP710844 南瓜 CP Nt9 台湾 D28780 不确定 CP、ＲNA3
SD-TA 泰安 KP710845 西葫芦 CP O 日本 D00385 不确定 CP、ＲNA3
SD-WH 威海 KP710847 南瓜 CP Xb 福建 AF268598 香蕉 CP、ＲNA3
SD-WF 潍坊 KP710846 南瓜 CP LS 美国 AF127976 不确定 CP、ＲNA3
SD-YT 烟台 KP710848 南瓜 CP LY 澳大利 AF198103 不确定 CP、ＲNA3
SD-ZB 淄博 KP710849 南瓜 CP As 韩国 AF013291 不确定 CP、ＲNA3
QDＲ 青岛 KP710852 南瓜 ＲNA3 EＲ 美国 U15730 豇豆 CP、ＲNA3
WHＲ 威海 KP710851 南瓜 ＲNA3 Ns 匈牙利 AJ511990 叶烟 CP、ＲNA3
TAＲ 泰安 KP710853 南瓜 ＲNA3 Legume 日本 D16405 豇豆 CP、ＲNA3
ZBＲ 淄博 KP710850 南瓜 ＲNA3 Fny 美国 D10538 不确定 ＲNA3
Barcelona 西班牙 AM183116 番茄 CP trk7 匈牙利 L15336 不确定 ＲNA3
S 美国 AF063610 不确定 CP Tfn 意大利 Y16926 番茄 ＲNA3
SDTA 泰安 FJ403473 辣椒 CP p1-1 西班牙 AM183116 番茄 ＲNA3
Lucknow 印度 EF153734 番茄 CP Phy 浙江 DQ412732 不确定 ＲNA3
AMA 荷兰 AJ131625 观赏作物 CP I17F 法国 Y18137 不确定 ＲNA3
2． 2． 2 CMV山东分离物序列分析 利用 MegAlign
方法，对选取的 CP 和 ＲNA3 核苷酸序列进行相似
性比较分析(表 2)。
CP核苷酸序列比对结果显示，本研究获得的 11
个样品的 CP核苷酸序列相似性为 97． 2% ～99． 9%;与
CMV亚组Ⅱ株系分离物相似性较低，为 77． 0% ～
78． 5%;与 CMV亚组 IA株系分离物的相似性较高，
为 92． 4% ～ 94． 5%;与 CMV 亚组 IB 株系分离物的
相似性最高，为 93． 3% ～ 97． 6%，其中与 CMV 亚组
IB株系韩国(Korea)分离物 As(AF013291)的相似
性最高。ＲNA3 核苷酸序列比对结果显示:获得的 4
个 ＲNA3 全序列相似性为 94． 4% ～99． 3%;与 CMV
亚组Ⅱ株系分离物相似性较低，为 67． 4% ～69． 8%，与
CMV亚组 IA株系分离物的相似性为 86% ～91． 2%，
与 CMV 亚组 IB 分离物的相似性最高，为 89% ～
93． 8%，其中与 CMV亚组 IB的韩国(Korea)分离物
As(AF013291)的相似性最高。
为了更好地分析其进化历程和亲缘关系，选取
世界各地有代表性的 CMV 分离物的 CP 和 ＲNA3
核苷酸序列构建系统进化树(图 3)。从构建的 2 个
系统进化树可以看出，山东 CMV 各分离物的 CP 和
ＲNA3 核苷酸序列与韩国 (Korea)分离物 As
(AF013291)亲缘关系最近，与同源性比对结果相一
致，同属于 CMV IB亚组。
2 期 孙晓辉等:山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定 215
A．基于 CP基因的系统进化树;B．基于 ＲNA3 的系统进化树。
Phylogenetic tree based on sequences of CP;B． Phylogenetic tree based on sequences of ＲNA3．
图 3 黄瓜花叶病毒 CP和 ＲNA3 序列系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic relationships based on sequences of the CMV CP and ＲNA3 genes
3 结论与讨论
山东是蔬菜生产主要地区，病毒病较为严重种
类也较多。目前，山东虽然有 CMV［5］、WMV［6］、
ZYMV［7］、TMV［8］、CGMMV［9］、MNSV［10］的相关报
道，但缺少全面而系统的检测，病毒种类、主次关系
及复合侵染情况不明确，缺少重要病毒的株系分化
鉴定。
本试验利用多对针对不同瓜类病毒的特异性引
物对山东 11 个地区采集到的葫芦科蔬菜样品进行
ＲT-PCＲ检测，检测到的病毒种类及发病严重程度
由大到小排序如下:TMV、CMV、ZYMV、WMV、CGM-
MV、SqMV、MYSV、CCYV、MNSV，并且复合侵染情
况较重，检出的病毒复合组合中除了 CMV 与
MYSV、WMV 与 SqMV 和 CCYV、ZYMV 与 CCYV、
SqMV与 MYSV、CCYV与 MYSV和 MNSV与所测病
216 华 北 农 学 报 31 卷
毒均未发现复合侵染外，其他的组合均存在复合侵
染的情况，并且这些组合中 CMV 和 TMV 的复合侵
染率最高。这可能与山东地区葫芦科作物的大面积
种植、栽培模式的多样化以及广泛的传毒媒介有关。
CMV 是迄今已知病毒中寄主范围最广泛、分布最
广、危害最严重也是目前研究最多最具经济重要性
的一种植物病毒［13］。在我国，葫芦科蔬菜上的
CMV在南京［17］、广州［18］、浙江［19］、新疆［20］等多地
均有发现。
黄瓜花叶病毒是一种 ＲNA 病毒具有很强变异
性和适应性，在世界各地分布广泛，能够侵染 1 000
多种植物，因而其株系分化十分复杂［18，21 － 22］。不同
地区和不同寄主植物上 CMV 分离物的生物学性状
和分子生物学特性存在明显差异［23］，导致育种难度
加大。CMV分为不同的株系，Pita等［24］根据寄主范
围、症状反应、血清学以及 CP 序列差异将 CMV 分
为亚组Ⅰ和亚组Ⅱ，不同亚组株系在致病性、寄主范
围等方面有一定差异，如亚组Ⅰ常引起坏死、蕨叶等
较为严重的症状。Palukaitis 等［25 － 26］基于基因组
ＲNA3 的 5端的非编码区序列将亚组Ⅰ进一步分为
亚组ⅠA 和亚组ⅠB。序列分析是划分 CMV 株系
的最主要的技术与方法，应用也越来越广泛［13，27］。
它从分子水平揭示了 CMV 分离物不同亚组之间的
差异。我国 CMV分离物也存在着株系分化，我国绝
大多数地区 CMV分离物都隶属于 CMV亚组Ⅰ［28 － 33］，
徐平东等［13］首次测定了我国分离物亚组Ⅱ的 CP
基因序列，从分子水平证实了在我国存在 CMV 的 2
个亚组。
本研究在山东的西瓜、南瓜、丝瓜、西葫芦等葫
芦科作物上获得的 11 个样品的 CP、ＲNA3 经分子
比对和进化分析发现这些样品均归属于 CMV 亚组
ⅠB。与除了福建以外的我国其他序列均处于一个
大分支上，且序列与葫芦科寄主无明显的相关性。
由于山东葫芦科蔬菜上 CMV亚组的单一性，可以针
对这一亚组培育抗病品种来控制病毒病的发生，为
葫芦科蔬菜的防控提供了科学依据。
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