全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Aug．２０１５,３５(４):４６４－４６７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０１０２０
贺燕飞,李同建,吴永恒,等．苎麻叶绿体SSR引物筛选及分析[J]．广西植物,２０１５,３５(４):４６４－４６７
HeYF,LiTJ,WuYH,etal．ScreeningandanalysisofchloroplastSSRprimersinramie[J]．Guihaia,２０１５,３５(４):４６４－４６７
苎麻叶绿体SSR引物筛选及分析
贺燕飞１,２,李同建２,吴永恒２,赵珊红２,徐玲玲２,廖　亮２∗
(１．江西农业大学 园林与艺术学院,南昌３３００４５;２．九江学院 药学与生命科学学院,江西 九江３３２０００)
摘　要:叶绿体微卫星标记为单亲遗传(除部分裸子植物外),有独立的进化路线,它在植物遗传多样性、群体
遗传结构、系统发育分析及杂种鉴定等研究上用途广泛,是研究谱系地理的有效手段.苎麻的主产地和主要
分布区均在我国,但其谱系地理研究目前尚未见有报道.该研究选择来自全国不同地区的５２个苎麻样本,利
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,在２３对已知通用叶绿体SSR引物中筛选出适用于苎麻谱系地理研究的SSR引
物,并利用筛选到的多态引物对５２个苎麻样本进行聚类分析和单倍型网络图分析.结果表明:从２３对通用
引物中共筛选出１６对适用于苎麻的多态引物,其平均多态信息含量为０．１０５３,虽然以上引物多态性较低,但
能够用于野生苎麻的遗传分析研究;这５２个苎麻样本聚为１０支,分为８个单倍型,初步分析表明叶绿体SSR
遗传变异速率较慢,不适用于苎麻种内的系统发育研究,但以上引物能够检测苎麻种内单倍型变异,可用于苎
麻的谱系地理研究.
关键词:苎麻;叶绿体SSR;引物筛选
中图分类号:Q９４９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０４Ｇ０４６４Ｇ０４
ScreeningandanalysisofchloroplastSSRprimersinramie
HEYanＧFei１,２,LITongＧJian２,WUYongＧHeng２,ZHAOShanＧHong２,
XULingＧLing２,LIAOLiang２∗
(１．CollegeofLandscapeandArt,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang３３００４５,China;
２．SchoolofPharmacyandLifeSciences,JiujiangUniversity,Jiujiang３３２００,China)
Abstract:Givenamaternalinheritancenature(exceptforsomegymnosperms)andalowfrequencyofgeneticrecomＧ
bination,chloroplastsatelitesmarkersareespecialyusefulinplantgeneticdiversityanalysis,populationgenetic
structure analysis, phylogenetic analysis and hybrid identification, which is an efective means of
phylogeography．ThemainproducingareaandmaindistributionareaoframieisinChina,butthephylogeographyreＧ
searchonramiehavenotbeenreported．Thisarticle’saimistoscreenpolymorphismcpSSRprimersappropriatefor
phylogeographyfromuniversalcpSSRprimers．Inthispaper,２３pairsofuniversalcpSSRprimerswerescreenedusing
５２ramiesamplesfromdiferentlocationsaloverthecountry,bypolyacrylamidegelelectrophoresis．Andclustering
analysisandcpDNAhaplotypesanalysisof５２ramiesampleswereconductedusingthescreenedprimers．Sixteenout
ofthemwerepolymorphic,andtheaveragepolymorphisminformationcontentofthemwas０．１０５３．Althoughthe
polymorphismoftheseprimerswaslow,theycouldbeusedintheresearchofgeneticanalysisinramie．FiftyＧtwo
sampleswereclusteredintotengroupsanddividedintoeighthaplotypes,andprimarilyanalysisshowedthatthegeＧ
neticvariationofcpSSRremainsslow,theseprimerswerenotsuitableforphylogenticresearch．However,these
primerswereabletodetecthaplotypevariation,andsuitableforthephylogeographyresearchonramie．
Keywords:ramie;cpSSR;primersscreen
收稿日期:２０１４Ｇ１１Ｇ２１　　修回日期:２０１５Ｇ０２Ｇ２９
基金项目:国家自然科学基金(３１０６００５０);江西省自然科学基金(２００８GZN００４４);江西省教育厅重点科研项目(GJJ０８４３１);九江市科技支撑计划项目.
作者简介:贺燕飞(１９８７Ｇ),女,河南三门峡人,硕士研究生,主要研究方向为植物系统进化,(EＧmail)４０５８７００３４＠qq．com.
∗通讯作者:廖亮,博士,教授,研究方向为植物分子生物学,(EＧmail)Liaol５８＠１６３．com.
　　苎麻(Boehmerianivea),被称为“中国草”,为
荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)多年生草
本宿根植物,是优良的天然韧皮纤维作物和纺织工
业的重要原料(陈建华等,２０１１).我国苎麻人工栽
培已有五千年历史,栽培品种类型极为丰富.苎麻
种质资源是我国苎麻育种和生产的宝贵财富,也是
确保我国苎麻业处于国际优势地位的基础.但苎麻
是多年生异花授粉作物,分布广,易杂交,又能进行
无性繁殖,通过长期的自然杂交和人工杂交繁殖,使
得苎麻的遗传背景十分复杂(唐冬丽等,２０１１).而
苎麻群体遗传学研究少见报道.因此,开展苎麻群
体遗传学等方面的研究,对了解苎麻的进化、指导苎
麻育种、开辟苎麻研究与利用等领域具有重要意义.
叶绿体基因组为单亲遗传(除部分裸子植物
外),在进化过程中相对保守,且在种子植物中,花粉
分离和种子散布是决定群体遗传结构的重要因素.
一般认为,单亲遗传的叶绿体基因组有效群体较小,
叶绿体基因组的遗传变异容易受到群体遗传效应影
响(如遗传漂变)(Birkyetal．,１９８３;Petit,２００５).
因此,叶绿体基因组是研究系统发育、群体分化和谱
系地理的有效手段,而目前国内主要是基于叶绿体
trnLＧF 序列对苎麻系统发育的研究.然而,在生物
进化过程中,不同序列之间的进化速度是不同的,单
凭某一种序列的分析结果不能得出可靠的结论(廖
亮等,２００９;唐冬丽等,２０１１),也不足以全面分析苎
麻系统发育、群体分化和谱系地理等.
高等植物的叶绿体微卫星(chloroplastSSR,
cpSSR)是以单核苷酸A或T为重复单元组成的多
核苷酸重复串联序列,在叶绿体基因组中分布十分
广泛,由于cpSSR不仅兼有核基因组SSR标记的高
多态性、多等位性、共显性等特点(Provanetal．,
２００１),而且呈单亲遗传模式,兼顾到叶绿体基因组
结构简单、相对保守等特点(Kaundunetal．,２００２),
使cpSSR技术已广泛应用于植物群体遗传结构、基
因流、胞质遗传特性、物种演化、谱系地理等方面研
究(Bissetal．,２００３;Lianetal．,２００３;Sukhotuet
al．,２００４),成为研究苎麻种下变异及其进化规律的
有效手段.而国内用cpSSR对野生苎麻进行遗传
分析的研究未见报道.本文通过分析cpSSR通用
引物在苎麻野生群体中是否存在多态性,验证其能
否用于群体遗传学的分析,可为其在苎麻谱系地理
研究中应用打下基础.
１　材料与方法
１．１材料
５２份材料均来自广西、广东、贵州、湖南、四川、
陕西、湖北、安徽、福建、浙江、江西等１１个省(区)的
５２个地区.由于苎麻异交性较强,广泛存在克隆繁
殖,导致其居群内变异较小,本研究主要是筛选
cpSSR多态性引物,每个居群取１个样品.采集新
鲜、完整的植物幼嫩叶片,硅胶干燥,Ｇ８０ ℃冰箱
保存.
１．２方法
１．２．１基因组DNA提取、PCR扩增和电泳　苎麻基
因组DNA的提取采用改良的CTAB法(Doyleet
al．,１９８７).选择２３对位于基因间隔区的叶绿体微
卫星通用引物(Chungetal．,２００３),对５２份苎麻材
料进行PCR扩增,扩增产物用８％变性聚丙烯酰胺
凝胶在５５W 恒功率条件下电泳,银染、拍照(BenＧ
bouzaetal．,２００６).
１．２．２数据统计与分析　与LadderMarker对比记录
条带大小,录入Excel表格,建立数据矩阵.利用
Popgene３２软件进行等位基因观察数、有效等位基因
数、香农信息指数、多态基因位点百分比等遗传参数
分析.用PowerMarkerV３．２５软件,分析等位基因
频率和引物的多态信息含量,并构建基于NJ算法的
５２个苎麻个体聚类树状图.利用NETW４６１１软件
构建基于MJ算法的苎麻NetWork单倍型网络图.
２　结果与分析
２．１引物筛选分析
２３对cpSSR引物中筛选出１６对多态引物,片
段大小在２２０~３５０bp之间,多态基因位点数１６,多
态基因位点百分比为６９．５７％,每对引物可检测到等
位基因１~３个.平均等位基因数１．８６９６,平均有
效等位基因数 １．１４０１,平均等位基因频率为
０．９３８１,平均香农信息指数为０．２２１５,平均多态信息
含量０．１０５３,ccSSR２的多态信息含量最低为０．１０２８,
ccSSR９的多态信息含量最高为０．３０３２(表１).
２．２苎麻个体聚类树分析
使用 NJ算法构建５２个苎麻个体的系统树
(图１),共分为１０支,其中Ⅲ分为两支,遵义、娄底归
为一支,勐仑、龙州和阳春归为一支.Ⅳ分为两支,其
５６４４期　　　　　　　　　　贺燕飞等:苎麻叶绿体SSR引物筛选及分析
表１　苎麻１６对cpSSR多态引物的遗传多样性参数
Table１　Diversitystatisticsof１６pairsofcpSSRprimers
基因座
Locus
样本数
Samplesize
观察等位基因数
A
有效等位基因数
Ne
等位基因频率
F
香农信息指数
I
多态信息含量
PIC
ccSSR１ ５２ ３．００００ １．２１４７ ０．９０３８ ０．３６４７ ０．１６６５
ccSSR２ ５１ ２．００００ １．１２４５ ０．９４２３ ０．２２３７ ０．１０２８
ccSSR４ ５２ ３．００００ １．２１６９ ０．９０３８ ０．３８１３ ０．１７０４
ccSSR５ ４８ ２．００００ １．１８０３ ０．９２３１ ０．２８６８ ０．１３１９
ccSSR６ ５２ ２．００００ １．１６５５ ０．９２３１ ０．２７１２ ０．１３１９
ccSSR８ ５１ ２．００００ １．１６９０ ０．９２３１ ０．２７４９ ０．１３１９
ccSSR９ ５２ ３．００００ １．４８９０ ０．８０７７ ０．６１９０ ０．３０３２
ccSSR１０ ４６ ２．００００ １．１８８８ ０．９２３１ ０．２９５４ ０．１３１９
ccSSR１１ ５１ ２．００００ １．１６９０ ０．９２３１ ０．２７４９ ０．１３１９
ccSSR１２ ５２ ２．００００ １．１６５５ ０．９２３１ ０．２７１２ ０．１３１９
ccSSR１３ ４８ ２．００００ １．１３２７ ０．９２３１ ０．２３３８ ０．１３１９
ccSSR１８ ５０ ２．００００ １．１７２６ ０．９２３１ ０．２７８８ ０．１３１９
ccSSR１９ ５２ ２．００００ １．１６５５ ０．９２３１ ０．２７１２ ０．１３１９
ccSSR２０ ５０ ２．００００ １．１７２６ ０．９２３１ ０．２７８８ ０．１３１９
ccSSR２１ ４９ ２．００００ １．１７６４ ０．９２３１ ０．２８２７ ０．１３１９
ccSSR２３ ５２ ３．００００ １．３１９０ ０．８６５２ ０．４８７０ ０．２２８０
mean ５１ １．８６９６ １．１４０１ ０．９３８１ ０．２２１５ ０．１０５３
中澜沧、富宁和绿春归为一支,巴卡单独归为一支;
Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ三个分支中均仅有一个苎麻个体.此系统
树分辨率较低,不能说明苎麻的系统发育关系.
２．３苎麻单倍型网络图分析
５２个苎麻个体聚类归为８个单倍型(图２).其
中单倍型A占苎麻总个体数的７１．１６％,单倍型B
占苎麻总个体数的３．８５％,单倍型C、D、E、H 分别
占苎麻总个体数的１．９２％;单倍型G占苎麻总个体
数的５．７７％,单倍型F占苎麻总个体数的１１．５４％.
其中单倍型A分布最为广泛,几乎分布于苎麻所有
分布区;单倍型B、G、H 分布于云南、广西地区,单
倍型F分布于陕西、福建、浙江,单倍型C、D、E则
分别分布于广东、贵州、湖南三省.
３　讨论
３．１引物的多态性
Botsteinetal．(１９８０)提出多态信息含量(PIC)
是衡量基因变异程度高低的指标.本研究表明
cpSSR引物在苎麻野生群体中多态性较低.产生
此现象的原因可能有以下两方面:一是由于引物的
通用性和序列保守性密切相关,但与遗传多态位点
互为矛盾.尽管引物具有较高的通用性,但位点过
于保守,揭示物种多态性能力较低(魏潇等,２０１３).
二是选用的引物所检测的微卫星重复序列均为单碱
基重复序列,聚丙烯酰胺凝胶电泳对检测单碱基差
异的灵敏度较弱.而与之相比,DNA单链构象多态
性(SSCP),作为一种单核苷酸多态性(SNPs)筛选
方法,主要用于各种点突变,可能会检测到较多的突
变(谢晓兵等,２０１１),因此,可选用此方法检测单碱
基重复序列的多态性.尽管所选叶绿体微卫星引物
在苎麻中多态性较低,但能够在苎麻野生群体中检
测到突变,可应用于苎麻群体遗传和种质资源分析.
３．２苎麻的聚类分析
运用cpSSR分子标记构建５２个地区苎麻样品
的系统树,５２个苎麻样本聚类为１０个平等分支,但
系统树分辨率低,结合其地理分布未能清晰说明苎
麻的演化关系,说明所筛选的cpSSR引物不适用于
苎麻种内的系统发育研究;而运用cpSSR分子标记
构建的单倍型网络图,结果显示５２个苎麻样本聚类
为８个单倍型,显示不同地区苎麻存在丰富的单倍
型变异.虽然本研究所用样本数较少,不能准确分
析苎麻的系统演化和谱系地理关系,但筛选的
cpSSR引物能够用于检测苎麻种内单倍型变异,为
苎麻谱系地理研究打下了基础.
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６６４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
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