全 文 ：@ 毕一6
广 西 植 物 Guihaia 20(1)：64—68 2000年 2月
文章编号 ：l【)(M】一3l 42(2000)t}l一0[}64一O5
五种黄精属植物的蛋白水解酶谱研究 & ．7；8．2
张为民 ，张 钧 ，邢智峰 ，姬生栋 胡轶红 ，徐存拴
a “．5白
摘 要 用蛋白术解酶复性电沫方法 (G—PAGE)分析 了 5种黄精属植物根状茎和叶的蛋白水解尊
的种 类 和 活 性 。结 果表 明 ：(I)它 们 的 报状 茎均 古有 85 kD 和 55 kD 的蛋 白水 解 醇 ；叶均 古有 82 kD
的 蛋 白水解 酶 ：(2)根被 茎 和 叶 的 蛋 白 水 解 酶种 类 和 活 性 有 裉 大差 异 ，叶 的蛋 白水 解 酶 活 性 为根 状
茎 的 l o倍．它们 的活性均璺 pH 响 ，其最适 pH 为 71(3)每种植物都 古有 自己特有 蛋 白水解尊 ；
(4)蛋白水解酶在植物鉴定 中有参考价值 。
关键词；黄精属植物；堡白 酶；蛋白水解酶复性电诛 ·P冉辱芒．
中围分娄号 ：Q949．71 8．230．656 文献标识码 ：A
盛 }分耋孽
Investigation on the proteinase activities of
five species in Polygonatum
ZHANG W ei—min ，ZHANG Jun ，XIN Zhi—feng ，
JI Sheng—dong ，HU Yi—hong。，XU Cun—shuan
t 1． n ilⅢ tⅢ¨lt ltJ Bi*dogy一 !⋯ t¨ EdM mM “ Lolh,ge 3i~ceuo 483005 China
2 l ￡} }rm ，l Bbd．gy．Hcnw r Nt tn Unir~,xity Xinxiang 453002 China、
Abstract： Fhe proteim1．~e activities in rhizoma and]eaves of five species in Pdyg~ atum were analyzed
hy SDS— 1．ItlI1一p ) cry gel electrophoresis．The results show：(1)The rhizomas al contain 85
kD antl S5 kD proteilt~lse8，and the leaves contain 82 kD proteinase{(2)There are Large differences
]~etween rhizonms and leaves proteinase activity The proteinase activity in leaves is 10 times higher
than in rhi zx)mas． Fheir activity 2tre affected by change of pH，and their highest activities Hilt shown
at pH7{(3)F~tch species in Polygmatm．u se a unique protelna,~esl(4)The use of proteina~ in
the identification of plants valuable
Key W ords；l~ol3,gmtatum；protelnase；SDS-gelatin—polyacrylamid gel elec~rophoresis(G-PAGE)
很多黄精属植物的根状茎具有重要的药理作用。在世界的 40多种黄精属植物中，中国有
收 幡 日期 ；1 999—07—1 z
作 者 简介 ：强为 Rtl 96l】j，且 Ⅱ4教 授 从 {}f植 物学 教学 和科 研工 作
基 盒 项 目 河 南 肯教 竹 委员 会 由然 科学 基 金磷 助项 目(994013400)
I 董
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1期 张为 民等 ：五种黄 精属植物 的蛋 白水 解酶 谱研 究 65
30多种。 然而．萤精属植物 的分类是一个十分困难的问题，因为，经典分类学所依据的性状
(形 态、结 构等 )在黄精 属植 物中很 不 稳定 ，地理 环境对 它们 的影 响很 大 ，地 理分 布上往 往 有交
错 、重 叠和替 代的现象 尽管 细胞遗 传学 和染色体 分类 学有助于 解决黄精 属的分类 困难间题 ，
但 并不能 解决全部 问题 ，因为 ，有些 黄精属植物 ，在细胞 和染色 体水平 上是难 以区别的 。它们
的区别 可能仅表现 在基 因水平上 若真如 此，黄 精属植 物 的分 类就得借 助于分子分 类学 了 。在
分 子分类 学的诸 多方法 中 ，用 蛋白质 和同工酶作 为分类 的可行性 已有一些 探讨 。用 蛋 白
水 解酶谱 作为分 类指标 的可行性“ 也有一些研 究。理论 上 ，蛋 白质 、酶 (包 括 同工酶 、蛋 白水解
酶等)都是基因的直接产物 ，是性状(从宏观到微观、从生长、发育 、生殖 、适应环境到新胨代谢)
的直接 体现者 ，借 助于 蛋 白电泳 、层析 、微机 分析 系统等现 代化 分析测试 手 段还 可对蛋 白质 和
酶 的种 类 、古 量 、活性进 行定 量分析 。 ，所 以 ，它 们有 可能成 为从 分子水 平上 研究生 物遗传 、变
异、分娄和亲缘关系的重要依据。近十几年研究表明，蛋白水解酶对生命是必不可少的，蛋白水
解酶不仅在蛋白水解过程中起重要作用，而且与蛋白修饰 、降解及生物的应急反应密切相关 ，
在生物的，圭长 、发育 、抗逆和生殖过程中有重要作用” 。本文采用蛋 白水解酶复性电泳技术分
析了 5种黄精属植物的蛋白水解酶种类 ，分布、活性及 pH值依赖性，以探 寻它们的蛋 白水解
酶谱特 点 ，为黄精 属植物 的分类学提 供参考 。现 将结果报告如下 。
l 材料和 方法
1．1材 料
试验用 的 20多个标本均与 1 997年 5月中旬随机从河南焦作境 内的太行山余脉采集 样
品采到后 ．一份制成腊 叶标本备鉴定，鉴定结果表明，所采 20余个标本台的 5种植物是玉竹
(Po@g~m ⅢH r， ㈣Ⅲ (Mil1)Druce)、轮叶黄精(Potygo*zatum verticilatum(I )Al，)、卷叶黄精
(Po／3- 卅m ci*‘r ／ ㈨，(WalD Royle)、湖北黄精(Pf gormtum 煳H ， ¨N Pamp，)和黄
精(P ⅢatU~l sibb icum Delar，,eX Redoute)f另一份放入冰壶带到实验室备作蛋白水解酶电
泳分 析 ，标本 的常规 鉴定与它 们的蛋 白水解 酶谱分析按 双盲法进行 。
1．2样品 制备和 蛋 白质浓 度测定
取 根状 茎用 自来水洗 净 ，双蒸 水 冲洗 以后 ，横截 0．5～ 1．j Em 根状 茎各 制样用 ；同耐 ，取 同
一 植株的 5个叶片用 自来水洗净，双蒸水冲洗 2次后 ，横切下叶中部区域备制样用。每 窖样品
加 10 1hi 、el C生 理盐 水 ，冰 浴匀 浆 ，4 C离 心 (2O 000 g、30 rain)，取上 清分装 于 Eppendoff
管 ， 85 C保存 按 Neul,off等方法 测定 蛋白质浓度 。
1．3蛋 白水 解酶复 性 电泳(c·PAGE)
G PAGE按 Neuhaus—Sleinmmz等方法 进行 。其基 本原理是 ：聚丙 烯酰胺 凝胶里 共聚有
明胶 ，样 品 电泳后 ，与蛋 白水解酶 结合 的 SDS可 为非离子去 垢剂(如 Triton X—i00)洗去 ，使 蛋
白水解酶复性 ．并把相应位置的明胶消化掉 ，成为不能为 coomassie Brilant R250染色区域(透
亮 区域 )。本文 的样 品缓 冲液 不含 巯 基 乙醇 、分 离胶 的丙烯 酰胺 浓度 为 10 、每槽 加 ：50 g
(根状茎 )或 l0 lag(叶片)蛋 白质 ，胶 板在 37 C保 温液 (0．1 mol／l 甘 氨酸 、5 mmol／l CaCl 、词
至实 验结果 所示 的 pH)里保温 24 1-,，然 后 ，固定 、显色 、分析 。
电泳 、显色后 ，根据标 准蛋 白(分子量分 别为 ：97．4、66．2、43、31、2O和 l4．4 kD)的相 对
迁移率绘制标准曲线 ，然后，从标准曲线上查找未知蛋白水解酶的分子量。
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66 广 西 植 物 2O卷
2 实验结果
2．1根 状茎 的蛋 白水解酶话 性的 pH依 赣性
用 G PAGE分 析 5种黄精 属植 物根状 茎蛋 白水 解酶 在不 同 pH 的活 性 表 明，它 们 的活性
表现 出强烈的 pH依赖性。pH7时，酶活性最强，当 pH大 于 7或小于 7时，酶活性 降低 。
pH3．5时 ，只有 玉竹和轮 叶黄精 的 85 kD、湖北黄精 的 85、74和 55 kD、黄精 的 110、85和 7,1 kD
蛋白水解 酶有 微弱 活性 (团 1)。
2．2根 状 茎 蛋 白水 解酶 种 类 和活
性
表 1列 出了最 适 pH(pH7)时
5种 黄 精 属 植 物 的 蛋 白水 解 酶种
类 和活 性 ，其 中 85和 55 kD 蛋 白
水解 酶 为受 检植 物所共有 ，可作 为
该 属 的 标记 酶 ，250 kD 蛋 白水 解
酶 为卷 叶黄 精所 特 有 ，110 kD 蛋
白水 解酶 在黄精 中 活性最 强 ，它们
可作 为相 应植 物的标记酶 。
2 3叶的 蛋 白承解酶 活性的 pH 依
赖性
用 (；一PAGE分 析 5种黄 精 属
植 物 叶 的 蛋 白水 解 酶 在 不 同 pH
中 的活性表 明 ，它们的 活性表现 出
强 烈 的 pH 依赖 性 。pH7时 ，酶 活
性 最 强 ，当 pH 大 于 7或 小 于 7
时 ，酶 活性 降 低 ，这 些情 况相 似 于
根 状茎 (图 2)。
2．4叶的 聋 白水解 酶种类 和活性
表 2列 出 了在 pH3．5、7和
8．5时 ，5种黄 精属 植 物 叶 的 蛋 白
水 解 酶种类 和 活性 。其 中 150 kD
表 1 pH7时，根状茎的蛋白水解■种类殛活性
Table 1 The proteinases of rhi~anas and their activity at pH7
植 钎名 肆 (Species)
丹 子量 Molecular weight(kD)
250 ii0 85 74 65 57 55 54
寰 2 在不同 pH时 ，叶的蛋白水解■种类与活性
Table 2 The proteinases of kave and their activity at different pH
的蛋 白水解酶 (图 2 Bc)为卷叶黄精特 有 ，62 kD的蛋 白水 解酶 (圈 2 Ae)为黄精 所特有 ，玉 竹的
82 kD蛋白水解酶(图 2Ca)对 pH变化最敏感 ，它们可作为相应植暂的标记酶。但是，仅在 O87
时 ，叶 中才出现 一个受检植物 共有 的蛋白水解酶 (82 kD)。
2．5根状茎和叶的蛋白水解酶活性比较
圈 1、2表 明，虽 然根状茎和 叶蛋 白水解 酶活性 的最 适 pH 均为 7，但 是 ，根 状茎 和叶的l蛋 白
水解酶谱有很大的不同，叶的蛋白水解酶活性是根状茎的 10多倍 ，除每种植物根状茎和叶都
音的特有蛋白水解酶外 ，pH7时，5种黄精属植物根状茎均音有 85 kD和 55 kD的蛋 白水解
酶 ，叶 中均含有 82 kD 的蛋白水解酶 。
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l期 张为 民等 ：五种 黄精属植 物的 蛋白水 解酶谱研 究 67
分 析 j种 黄精 属植 物 蛋 白 水解 酶谱 表
明 ，它 们 的 蛋 白水 解 酶 活性 有 明 显 的 pH 依
赣 性 ，其 最适 pH 值 为 7。在 最适 pH 条件 下 ，
5种植 物 的 根 状茎 含有 85和 55 kD 的 蛋 白
水解 酶 ；它们 的时均 含有 82 kD 的蛋 白水 解
酶 ．这些 蛋 白水 解 酶 的活性 在 不 同植 物 中有
较大 差异 【图 1)。通 过分析 20余个 标本 的蛋
白水 解 酶话 性发 现 ，根 状茎 的蛋 白水 解 酶谱
比叶更 稳定 ，这 可能 是 由于根 状茎 生长 在 地
下 ．不 易 受 环 境 、气候 、昼 夜 变 化、生 理 代 谢
等 因 素影 响 。叶则 不 然 ，随时 随 地都 受到 各
种 环境 因素影 响 ，即是 用 同一 植 株不 同位 置
叶片或 同一 叶片 的不 同部 分 ，蛋 白水 解酶 的
种 类和 含量也有 差 异 未出示照 片) 由此可
见 ．将 蛋 白水 解 酶种 类 、含 量 和恬 性 作 为鉴
定植 物 和 研 究 不 同植 物 亲缘 关 系 的参 考 指
标 时 ，选 用 生理 和代 谢 相对 稳 定 、不易 受 环
境 影 响的器 官作材 料是 必要 的。
分子 分 类 学是 一 门新 的学科 ，在分 子分
类学 的诸多方法中，应用同工酶进行生物亲
缘关系与分类学研究的报道很多“ ，曾樵等
报道 过用植 物叶蛋白质双 向电泳结合微机
分析 系统研 究 摁木 属( 妇 )植物 的 系统 演
化 ．王 莹等 报道 过 以蛋 白水解 酶 进行 经济
海藻 分类 学研究“ 理论上 ，被选 择 的对 象所
Fig 1 Fig 2
目 J川 G l】AGE分 析五种 臂 柑属 植钎 根批 茎的 蛋 白柬解 一活 性
A pH3．5}B PH7{c pH8．5I R．玉竹 t k辖 It黄 精t
c卷 叶黄 精{d．朝北 黄精 I e 黄精 ．
阿 2用 G-PAGE分析 五种 黄精 ■植 袖 叶 的蛋 白柬 一 恬性
A．pH3 5}B 州 7’c．pH8 5}^ ．玉竹 ；b．轮 叶 蕾精 }
c卷 叶黄 精，d．期北 黄精 }e 黄 精 ．
Fig 【U ‘ G PAGE tO 呻^ Jy t P mtt⋯ nclivitieM l啊I
rhizomn 0f Frye es in polygonat~
A pH3．5；B pH7I C．PH8．5}R． 岫 r 辨 r - {
h P,gyg~mtamn {c．poIyg*l~ttuln cirrlfj}gt~ }
d ，· 一 }e Potyg~ tum flgrlc~
rig 2 U~ing G-PAGE to an y the p⋯ 一 aellvixies m
I帅 0f f # 5 in P ， fIⅢt
^ pH3 5B 州 7 0 pH8 5l ^ ， u⋯ f 删 { ’
b P y idI ⋯ c Pdy ⋯ l elrrtdfoliu~t
d m⋯ B ～ r ， m ⋯
含的可选择参数越多，越易作为分类依据，与同工酶相比，蛋 白水解酶的种类 、功能、生理作用
要 比同工酶 多许多 ，而它们 的种类上 叉 比蛋 白质少 和 易分析 ．因此 ，用 蛋 白水 解酶作 分类 的参
考指标 ，将有助于鉴定物种亲缘关系和分析物种系统演化。捌如，本研究采集到的黄精属 20多
个标本 中，有 4个标本依据形态和结构特征既可归并到这个种 ，又可归并到那个种的标本，若
参考 它们 的蛋 白水解酶 谱 ，有 助于上 述问题 的解 决 。
应 当指 出 ．本 文 只是 以花期 植 物根状茎 和 叶为材料 ，数 量 上也 只是黄 精属植 物 5个 种 、2O
余个标本的研究结果 ，尚未对其它种(中国的 30多种、世界的 4O多种)、不同生活期、不同器官
和不同地域材料作系统分析与比较 只有系统的完成这些工作后 ，才能准确评价蛋白水解酶谱
在植 物分 类 学方 面 的参考 价值 。
参考 文献 ：
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68 广 西 植 物 20卷
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