全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(6)：753— 759 2010年 11月
植物分子 系统发育与进化研究的基因
选择 、引物设计与应用策略
王 玉 国
(复旦大学 生命科学学院 生物多样性科学研究所，教育部生物多样性-9生态工程重点实验室 ，上海 200433)
摘 要：引物选择、设计与应用策略是植物分子系统发育与进化研究的关键环节。本文综述了基因选择的原
则、引物设计的技巧以及如何有效地利用所涉及 的片段获取相应的 PCR片段的方法。
关键词 ：系统发育 ；进化 ；基因选择；引物设计；应用
中图分类号：Q941 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2010)06—0753—07
Gene selection． 。 design and their utilit~on0 primer y 0 m ’e ，
studies of plant molecular phylogeny and evolution
Ⅵ NG YLI-Guo
(Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering，Institute of
· Biodiversity Science，Fudan University (IBSFU)，Shanghai 200433，China)
Abstract：Primer selection，design and utility are key and absolutely necessary steps on the studies of plant molecular
phylogeny and evolution．Here the principles of gene selection，the skills of primer design and the efficient utility of
the primers selected to obtain the needed PCR products are summarized．
Key words：phylogeny；evolution；gene selection；primer design；utility
随着分子生物学和生物信息学的快速发展，核
酸序列分析已成为分子系统发育与进化研究 中广泛
应用的基本方法。而作为 PCR实验 的关键环节 ，引
物选择 与设 计 策略 的 好坏 却 往往 可 决定 研 究 的
成败 。
1 植物分 子系统发育 与进化研 究
的基 因选择原则
以往植物分子系统发育与进化研究 ，已经利用
了来 自三个基 因组的基 因或 DNA片段构建 了不 同
类群的系统发育。每个基 因组的不同基因可能被应
用在不同分类 等级的类群 。由于不 同分类学家对
科、属、种等阶元 的概念和范围理解不 同，而相 同阶
元 内不同类群的进化速率可能不一致 ，因此也会出
现即使 同一基因在同一阶元的不同类群中应用效果
有所不同的现象 ，如 cpDNA ￡r 工厂F 区可以很好地
解释一些属的系统发育 ，但 在另一些属 内则可能很
少有分化。尽管如此，在分 子系统发育与进化研究
中基因选择还是有基本原则可以遵循的。(1)通用
引物优先原则 ：在亲缘关系较远的不 同类群 中都适
用的引物 ，往往是 通用 引物 ，其适用范 围也广，如
white等(1990)设计 的扩增核糖体基 因(nrDNA)
ITS区域 的 ITS5、ITS4、ITS3和 ITS2四个引物、
Taberlet等 (1991)设 计 的扩增 叶绿体 基 因(cpD-
NA)trnT-trnL—trnF 区段的 a—f 6个引物、Demesure
等(1995)设计的扩增线粒体基因(mtDNA)nadl和
nad4内含子的 6个引物，这些引物通用性在很多类
群都得到很好的验证 ；(2)近缘类群优先原则 ：通常
情况下，在一个类群中已经成功应用的基因，往往在
收 稿 日期 ：2O10—10一l6 修 回 日期 ：2OlO—l1-1 2
基金项目：国家自然科学基金(30970199)[Supported bytheNational Natural Sciense Foundation of china(3O97Ol99)]
作者简介：王玉国(1970一)，男 ，黑龙江甘南人，博士，长期从事被子植物分子系统发育与进化研究，(E-mail)wangyg’@fudan．edu．cn。
754 广 西 植 物 3O卷
其近缘类群也可以使用 。因此 ，如果在一个类群的
近缘类群上已经做过某些基 因的系统学分析 ，这些
基因就可以作为优先的选择 。以木兰科为例 ，cpD-
NA matK 基 因序 列 可 用来 分 析 木 兰 科 含 笑属
(Michelia)的系统发育(金虹等，1999)，那么，该基
因通常也会适合其近缘类 群木兰属 (Magnolia)的
系统发育 (Azuma等 ，1999)。(3)富含信息位点原
则：具有关键信息位点或信息位点丰富的基 因才有
助于疑难系统发育与进化关系问题的解决。对于较
低分类等级的类群 ，选择长的内含子或基因间隔区，
相对短的基因片段 而言信 息位 点可能会多些。因
此，在基 因选择和引物设计时应作重点考虑。
了解不 同基 因组的特点 、不 同基因或 DNA 片
段的一般应用分类等级的上下限(图 1)，以及具体
类群的具体情况 ，将有助于合理而有效地应用它们
去获得系统发育信息(Soltis＆ Soltis，1998)。
A
nad1 BC
le
m atR
且
Coxl
CHS
7Phy 7
，Pgi)
Ir
?adh i?
le ?GapA
组 5S RDNA spacer
lTS
5．8S rDNA(ra rely used)
26S rDNA
l8S rDNA
trnG—trnS spacer
trnC—trnD
Rp116
cplTS2 and cplTS3
trnT—trnL space r
e
‘ trnL-trnF spacer
￡ trnL jntron
atpB—rbcL intergenic region 一 一 一 一
rps2 7
16S rDNA
ndhF
m atK
rbcL
atpB
Population Species Genus Fam ily
居群 种 属 科
Order
目
Subclass
亚纲
Phylum
门
图 1 引 物实用 范 围上下 限
Fig．1 Taxonomic level of utility of primers
根据 Soltis DE＆ Soltis PS(1998)修改而成 。‘⋯ ’代表该基因可能 的上限或下 限，‘?’代表该基 因很少被用到
Figure is motified from Soltis DE ＆ Soltis PS(1998)．‘一一 一 designates the approximate upper or lower
limits of applicability．‘?’Refers to genes that have been rarely used
1．1叶绿体基因组
主要 由单拷贝序列组成，在被子植物 中常常单
亲遗传 ，一般母 系遗传 (猕猴桃属 Actinidia是个例
外，为父系遗传)，与核基因相比，不受网状进化(re—
ticulate evolution)影响，其进化历史相对容易分析，
构建系统树 比较容易。叶绿体基因组还具有以下几
个方面的优点受到研究者青睐：(1)cpDNA在植物
总 DNA 中含量较丰富，易于提取和分析；(2)对叶
绿体基因遗传背景 了解较多 ，目前 已经有超过 7O余
种的叶绿体全基因组序列公布，更多物种的叶绿体
全基因组序列正在测序之中；(3)不同的叶绿体基因
进化速率不同，具有系统学价值 的基因很多(Hoot
6期 王玉国：植物分子系统发育与进化研究的基因选择、引物设计与应用策略 755
等，1999)，可以选择进化速率快的基 因探讨低分类
等级的系统发育 ；也可 以选择核酸替换相对保守的
基因，去解决较高等级分类群 的系统发育问题 。例
如 rbcL是分子系统学研究常用的基因，通常适合于
科以上分类等级的系统发育，有时也用于科 内属间 ；
而 matl~基因、t 7_7l F 区和 rp￡l6内含子 等则非常
适合用于属内、种间的系统发育关系研究。
marK基因长约 l 500 bp，位于 叶绿体赖氨酸
tRNA基 因(trnK)的 内含子 中，编码 一种 成熟 酶
(maturase)，可能参与 RNA转录体 中 Ⅱ型 内含子
的剪切 。mark是叶绿体基 因组蛋白质编码基 因中
进化速率最快的基因之一 (Johnson& Soltis，l994；
Liang& Hilu，1996)。marK 的序列变异 中转换和
颠换的频率、密码子 3个位置没 有严 重偏离 ，这 与
rbcL有较大差别 。由于 marK 序列 的变异 均为均
一
，在构建系统树时不必对不 同类 型的变异进行加
权，极大地增强 了分子系统树 的可靠性 ；同时 matK
比rbcL长，核酸替换率是 rbcL的 2～3倍以上，用
于构建分 子系统 树分 辨 率大 大提 高 (Johnson &
Sohis，l994)。rnatK 一般用 于科 内、属 间、一些类
群种间关系的研究 (如 Erdogan& Mehlenbacher，
2000；Levin等 ，2000；Meimber等 ，2001)。 由于
”川，K进化速率相对保守 ，同样也适用 于较高等级
的分类群研究 (Manos＆ Steele，1997)。
trnL—F区 包 括 trnL[UAA]内含 子 和 trnL
EUAA]一trnF[GAA]之间的间隔区(约0．8 kb)。针
对该基 因片段所设计 的引物 比较通用 ，相对容易扩
增而被广泛地应用于低分类等级的系统发育研究之
中(如 I evin等 ，2000；Sweeney Price，2000；
Wilkstr0m & Kenrick，2000；Yen ＆ Olmstead，
2000；Fritsch等，2001；Manen等 ，2002)。
在有详细化石记录可校对 系统发育分支 的类
群 ，rbcL、matt(、trnL-F 等基 因可 以很好 地进行分
子钟推导 ，进一步推测进化历史事件 ，在物种起源与
进化研究中被广泛采用 。
rpll 6基因是编码 核糖 体 L16的基 因，其 内含
子约 1．0 kb，在绝大多数被子植物 中都存在，并成
功地应用一些属的系统发育研究 ，可以很好地解释
属内种 问 的 系统 发育 关 系 (如 Posno等 ，1986；
Downie等 ，l996，2000；Jordon等 ，1996；Kelchner
Clark，l997；Baum 等，l998；Kelchner，2002；
Wang等，2004)。比较烟草和水稻 17个共有的叶
绿体基因内含子碱基序列后 发现 ，rpll6内含子是
分化最快的(Donwnie等，1996)。此外，可作为分子
系统学研究其他叶绿体 DNA的分子标记还有：at—
pB、ndhF、 rps2、 rps4、 rpsl6、 cplTS2—4． 59
CpITS3、trnC-trnD、非 编 码 序 列 PY-IGS 片段 等
等。CBOL Plant Working Group(2009)曾 比较
matK、rbcL rpoB rpoC1，atpF-atpH psbK-psbI
和 trnH—psbA 等 7个基因或基因间隔区，来探索区
分陆生植物物种的“条形码 (Barcoding)”。事实上 ，
可用做 Barcoding的基 因还很多，Heinze(2007)就
对已经发表的引物、新设计 的引物进行汇总建立一
个叶绿体基 因引物数据库 。文章见 http：／／www．
plantmethods．corn／content／3／1／4。全部 引物可从文
中附表获得。研究者可以根据不同目的进行选择。
1．2线粒体基因组
以往认为线粒体基因重排事件频繁，作为信息
分子，同源性受到影响，很难用于分子系统学研究，
特别是应用于高等级分类群的研究。但是，一些线
粒体基因如COX 、matR和mtSSU已经在被子植物
基部类群的研 究 中应用 ，并取得很好 的进展 (Par
kinson等，l999；Qiu等 ，1999)。nadl exon BC in—
tron II也在较低 分类 等级类 群的系统发育和进化
研究 (Sanjur等 ，2002；Schaefer& Rennet，2O10)，
甚至在大花草及其宿主的基因水平转移研究中都有
报道(Davis& Wurdack，2004)。
1．3核基 因组
尽管核基 因组很大，所包含的基 因的数量和变
异相当大 ，但是大多数用于系统发育研究的核基因
序列却主要 限于核糖体 DNA。rDNA用于植物系
统分类和进化研究有其突出的优点：(1)结构功能十
分保守 ，但又具有一定的变异 ；(2)在细胞中含量大，
易获得 ；(3)与叶绿体基 因相 比，避免 了由于单亲遗
传带来的对分支关 系的错误解释。因此，rRNA是
进行分子系统分类和进化研究较为理想的指标 。最
常用基因或片段 ：18S rRNA基 因、nrDNA ITS区
等 。高度保守的拷贝区(18S、26S rDNA)最早被用
于科和科以上水平的系统发育研究。而进化速度快
的区域，如 ITS，则常用于种间和近缘属间的关系。
其他几个核基因，如 Pgi、gapA、adh、gapC显示出
一 定的应用潜力 ，甚 至可用于居群水平的研究(Sol—
tis& Soltis，l998)。
nrDNA ITS 区 (internal transcribed spacer of
nuclear ribosome，核糖体 DNA转录间隔区) 这是
高等植物中应用最为普遍的 DNA 片段。它位于小
756 广 西 植 物 30卷
亚基和大亚基 rRNA基 因之间 ，被 5．8S rRNA基
因分为两段，即 ITS1和 ITS2。在被子植物中，虽然
不同被子植物的 rDNA ITS区序列 差异较大 ，但
ITS区的长度差别较小 ，总长度约为 600～700 bp，
l rS l的长 度 为 187～ 298 bp，ITS2为 187～ 252
bp，非常容 易进行 PCR扩增 (Baldwin等，1995)。
作为 18S一26S rDNA 的一个组成部分，ITS在核基
因组中是高度重复的，而且通过不等交换和基因转
换 ，这些重复单位间已发生了位点内或位点 间的同
步进 化 (concerted evolution)(Elder& Turner，
l995)，即不同 ITS拷贝间的序列趋于相近或完全
一 致。对于不涉及网状进化(即杂交起源)的类群，
通常情况下其 PCR扩增产物都可以直接测序；对于
不易 扩增 的 DNA 样 品，组 合 使用 ITS5、ITS4、
ITS3、ITS2等通用引物，采用分段 PCR或巢式
PCR的方 法可 以很好 地实现 ITS区 PCR扩增 、
测序 。
利用 ITS作分子标记来研究系统发育关系已
得到了广泛应用，它在科 、亚科、族内的系统发育与
分类 问题研 究方 面具 有重 要 作用 (Campbel等，
1995；Downie& Katz—Downie，l996；Francisco—Or—
tega等，1 997)。关 系密切 的物种之 问 ITS长度接
近，而序列有一定程度的变异 ，因此，该 片段特别适
合于属、组级等较低等级分类群的系统发育和分类
研究 (Baldwin，1993；Baldwin等，1995；Yuan等，
l 996；Ainouche Bayer，1997；Kollipara等，1997)。
单拷贝与低拷贝核基因 对于杂交或多倍化起
源的类群，单拷贝基因和低拷贝核基因是探讨其系
统发育与进化的最合适 的选择 。已有的文献显示，
rpb2一d或一I copy、Adhl、Adh2、GBSSI(waxy)、以
及花基因 PISTILLATA(PI)、Leafy等基 因在一
些类群 中都可 以作 为单拷 贝基 因使用 (Sang等，
l997；Mason—Garner等 ，1998；Lee等，2002；Oxel—
1]l~l rl等，2OO4；Kim 等，2008)。由于古多倍化 的存
在 ，对于染色体基数较大的类群 ，寻找完全的单拷贝
基因往往是非常困难的。可以将同一基因家族的不
同拷贝作为备选基 因考虑，但如果研究涉及 的取样
量较大时，其克隆测序的工作量将明显加大。
适合谱系地理学(PhylogeOgraphy)的核基 因
谱系地理学的范围一般涉及同一个种的复合体或同
种的不同居群。要求的合适基因是在这两个水平上
有较高的信息位点变异。通常nrDNA ITS、cpDNA
⋯ r厂_F、atpB-rbcL 等是植物谱系地理学主要 的候
选基因。核基因在这方面应有很大潜力 ，如查尔酮
合成酶基 因(chalcone synthase)的内含子、Leafy
内含子 2、果 实液泡转 化酶 (fruit vacuolar invert—
ase)基因内含子 2在不同类群中都有很好应用(Ca—
icedo& Schaal，2004；Bartish等，2006；Liao等，
2010)。优先考虑具有长的内含子或基因间隔区是
这类基因筛选的关键。
多基因综合分析是 目前被子植物系统发育与进
化研究主要的常规手段 。不同基因对于揭示植物系
统发育过程均具有重要意义。一般情况下，核基因
树与叶绿体基因树是一致的，但有时也会发生系统
树冲突。不同于单亲遗传的叶绿体基因和线粒体基
因。核基因是双亲遗传 的，利用其序列变异探讨植
物的系统发育过程，特别是解决网状进化问题具有
明显的优势。对于进化速率不同的基 因或 DNA片
段，综合分析可望对所研究类群的系统发育提供更
为全面的理解。
2 引物设计软件的使用
并不是 在任何肘候都有可以借鉴的通用基因，
用于植物的系统发育与进化研究。由于研究者所要
解决的科学问题不同，近缘类群没有相关研究，往往
就需要根据不同研究 目的进行引物设计。比如研究
植物的杂交与多倍化，就需要设计单拷贝核基因的
引物 ；研究多基因家族进化 ，就需要设计可以扩增这
一 基因家族不同基因的引物；做谱系地理学研究，就
需要针对进化速率相对较快的基因设计引物；做背
景不清的类群的居群遗传结构和遗传多样性研究，
有时就需要设计微卫星引物。
无论哪种情况 ，都要涉及 引物设计软件。设计
软件种类很多，但其引物设计主要遵循 3条基本原
则：首先，引物与模板的序列要紧密互补；其次，引物
和引物之间避免形成二聚体(primer dimer)；再次，
引物不能在模板的非 目的位点引发 DNA聚合反应
(即错位)。在进行引物设计 时，还要注意以下的要
点(张新宇等 ，2004)：1)引物长度 ：一般为 15～30
bp。其有效长度可以用公式 Ln一2(G+c)+(A+
T)来计算 ，一般不应 大于 38 bp，否则产物的特异性
将因 PCR最适延伸温度超过 Taq酶的最佳作用温
度(74℃)而降低 ；2)G+C含量应在 4O ～6O 之
间。PCR复性温度一般是引物的 Tm值减去 5～1O
℃。当引物长度小于 20 bp时，Tm=4(G+c)+2
6期 王玉 国：植物分子系统发育与进化研究的基 因选择、引物设计与应用策略 757
(A十T)；3)碱基应随机分布 ，应避免连续出现几个
同样的碱基。尤其不应在 3 端出现超过 3个连续的
( 或 C，否则会导致引物在 G+C富集 区错误引发 ；
4)引物 3 端不应发生错 配，否则会在很大程度上影
响 Taq酶的延伸效应。引物 3 端最好选用 A、G或
c，而尽可能避免使用 T(也有文献说明应避免使用
A)，尤其是连续 2个 以上 的 T；5)引物 自身不能含
有互补序列，否则会形成发夹结构而导致引物无效 ；
6)两个引物之 间不应有 多于 4个互补或 同源 的碱
基 ，否则会形成引物二聚体 ，尤其应避免 3 端 的互
补重叠；7)引物应与扩增 目的序列之间存在特异性。
与非扩增序列的同源性 小于 7o 或少于连续 8个
互补碱基。
对于已知序列 ，可通过特定的引物设计软件如
Primer Premier 5．0和 Oligo 6．44来完成引物设计
和评估 。关于这两个软件的用法 ，张新宇等 (2004)
已有较为详尽 的说明，在此不再赘述 。需要说明的
是，即便是软件对给出所设计的引物各项指标得分
都很高，也不一定能确保引物一定能扩增 出所需的
条带。比如，用于克隆 目的的 PCR，由于产物序列
相对 固定 ，引物设计的选择 自由度较低。要想获得
效果很好的引物，在 自动搜索的基础上还要辅以人
工分析 ，将这两套引物设计软件 合并使用可能效果
更好。根据以往设计引物的经验，(1)对于特殊 的酶
退火温度要求较高，如 LA Taq酶或其他高保真酶 ，
设计时可通过控制引物长度来决定 ；(2)正向引物和
反向引物的 Tm值、GC含量值不要相差悬殊；(3)
扩增引物不宜在所扩增 区段 内部有连续的配对区。
(4)引物 长 度 可通 过 File> Rreference> Default
Primer Length选定 ，通过手工来调节 3 端碱基 组
成和两个引物 GC含量差值。
2．1利用 mRNA序列设计 引物扩增总 DNA特殊片
段的方 法
在实验设计 中，常常需要根据已知的 mRNA序
列设计扩增总 DNA特殊片段的引物。一般原则是
从外显 子保守 区域 人手设 计。通 常 的办法 ：将该
mRNA序列通过 GenBank与有基 因组全长的物种
如拟南芥 、水稻等进行 Blast比对 ，确定内含子与外
显子边界 ，推测可能的内含子长度；然后在 内含子区
域用多个 (如 2O或 以上 )n来代替 ，将该序 列导人
Primer Premier 5．0之中，再避开 n区进行引物设计 ，
按引物设计的一般原则 ，尽可能设计多对扩增引物，
以便后续的分段 PCR或巢式 PCR扩增 目的片段。
2．2微卫星引物的开发与设计方法
微卫星 DNA(Microsatelllite DNA)即简单重复序
列(simple repeats sequence，SSR)，是一类 由 l～6个
碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列。不同等
位基因问的重复数存在丰富差异，且重复序列两侧多
是相对保守的单拷贝序列，可通过设计特异引物对基
因组总 DNA进行 PCR扩增。由于微卫星标记扩增
片段的多态性丰富，重复性好 ，标记一般为共显性，在
基因组中分散分布，已成为系统与进化植物学研究的
重要分子标记 ，被广泛应用于植物居群遗传结构、遗
传多样性与谱系进化等方面的研究中。
微卫星引物 的开发方法多样 (Zane等，2002，张
增翠，侯喜林，2004；陈怀琼等，2009)。经典的方法是
基于基因组文库构建结合 SSR探针杂交的筛选法，
后来 陆续 发展 了基 于 RAPD(Randomly Amplified
Polymorphic DNA)的 开 发 策 略 (Cifareli等，1995；
Lunt等，1999)、基 于 ISSR-PCR 的 SSR分 离 策略
(Fisher等，1996；Lench等，1996)、基于引物延伸的分
离策略(Ostrander等 ，1992)、利用选择杂交进行 SSR
分离(Karagyozov等 ，1993；Kandpal等，1994；Zane等，
2002)、建立序列标签文库获得 SSR引物序列等方法。
其中，利用微卫 星富集基 因组文库构建法与 ISSR-
PCR方法筛选微卫星在实验室 已非常广泛(Armour
等 ，1994；Fleischer& Loew，1995；Fisher等，1996；
Lench等，1996；Matthew等，1999)。微卫星富集基因
组文库构建法 (SNX linker方法)主要是通过基因组
酶切、接头(Adaptor)制备与连接、连接产物的扩增、
产物与含重复序列的生物素探针杂交、磁珠富集及产
物吸收预扩、克隆测序、引物设计来完成；而利用 IS—
SR片段筛 选 SSR标 记主要依 据 为 ISSR是 介 于
SSR之间的片段 ，其 中长的 ISSR片段本身就可能
包含有 SSR片段 。通过对这样的片段筛选、克隆测
序并进一步设计 SSR侧翼区引物。
3 多引物组合使 用——巢 式 PCR
与分段 PCR
对于一些难于扩增 的材料 ，比如长模板或模板
DNA浓度过低的样 品，常规 PCR往往不能达到扩
增 目的 片段 的 目的 ，可 以采用 巢 式 PCR 和分 段
PCR来解决。前者是对 PCR产物的再扩增 ，引物
至少应有一个为内部引物 ，否则 PCR扩增成功率会
受影响。需要注意的是 以 PCR产物为模板 ，模板浓
758 广 西 植 物 3O卷
度是关键 ，通常情况下 ，出现上拖带和下拖带分别暗
示模板浓度过高或过低 ，需要调试，否则会达不到扩
增的目的；后者使用外部引物和内部引物，内部引物
和内部引物的分段扩增 ，然后再将各段序列拼接起
来，如 trnT-F用 a和 d，c和 _厂分别扩增 ，然后再用
“、d、c、f测序，其效果与用 “和 厂扩增 ，然后再用这
4个引物测序是相同的。这里的关键是需要有先设
计足够的内部引物，各段序列之间应有重叠区域 。
对于 PCR扩增产物条带较弱的，除调试模板之外 ，
可以采用多管浓缩与克隆测序相结合的方法先获得
序列 ，然后再设计合适的引物优化实验体系。
基因选择、引物设计与应用策略的好坏 ，是能否
获得高质量 PCR扩增的前提，只有解决这些 问题 ，
才能为后续的序列或遗传多态性分析提供详实可靠
的科学数据和关键证据。
致谢 感谢李先琨主编盛情约稿，仅以此文纪念
《广西植物》创刊三十周年。本文在撰写过程 中，朱永
青博士提供宝贵建议，王昊、廖辉提供部分参考资料 ，
张宏彬协助绘图，特此致谢。
参考文献：
Amoudm ML．Bayer R． 1997． On the origins of the tetraploid
Bro．I“ species(section BroTnus，Poaceae)：insights from interna1
transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNAEJ]．Ge—
nolll~，40：730—743
Arn1．otlr JA1 ，Neumann R，Gobert S，el a ． 1994．Isolation of hu—
alan simple repeat loci by hybridization selection[J]．Hum Mol
Genet，3：599— 605
Azuma H，Thicn LB，Kawano S． 1 999， Molecular phylogeny of
Magnvlia(M agnoliaceae)inferred from cpDNA sequences and ev—。
olutionary divergence of the floral scents[J]．J Plant Res，112；
29l一3()6
Baldwin BG．1 993．Molecular pllylogenetics of Calycadcnia(Corn—
positac)base{l on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA：chro—
mosomal and morphological evolution reexamined[J]．Am J
Bot，80：222—238
Baldwin BG，Campbel S。Porter JM，eta1．1995．Utility of nu—
clear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences in
phylogenctic analyses of angiosperms[J]．Ann Mo But
Gard，82：247— 277
Bartish IV，Kadereit』W ，Colncs HP．2006．Late Quaternary his—
tory (]f HippophⅡ rhamnoides(Elaeagnaceae)inferred from
chalcone synl hase intron(Chs1)sequences and chloroplast DNA
variation[JJ．Mol E ，15：4 065—4 083
Baum DA，Smal RL．Wendel JF．1998．Biogeography and floral e—
volution of baobabs(Adansonia，Bombacaceae)as inferred from
multiple data sets[J~．Syst Biol，47：181—207
CH(jI IJ]ant Working Group． 2009． A DNA barcode for land
plauts[J]．ProeNatl Acad 5ci USA，106：12 794—12 797
Caicedo AI ．Sehaal BA． 200,1． Population structure and phylo—
geography of Solarium pimpineli folium inferred from a nuclear
gent n ^ & 13：l 871—1 882
Campbel CS，Baldwin BG，Donoghue Mj．el“￡．1995．A phyloge—
nv of the genera of M aloidae(Rosaceae)：evidence from se—
quences of the internal transcribed spacers of nnclear ribosomal
DNA sequences and congruence with morphology[J]．Am J
B f，82：903— 918
Chen HQ(陈怀 琼)，Sui C(隋春)，Wei JH(魏建 和)，2009．
Summary of strategies for developing SSR primer(植物 SSR
引物开发策略简述)EJ]．Mot Plant Breed(分子植物育种)，
7．845～ 851
Cifareli RA．Galiteli M ，Celini F． 1995． Random amplified hy—
bridization microsatellites(RAHM)：isolation of a new class of
microsatelite-containing DNA clones[J]．Nucleic Acids Res，
23：3 802—3 803
Davis CC．Wurdack KJ．2004． Host—to-parasite gene transfer in
flowering plants：phylogenetic evidence from Malpighiales[J2．
Science，305：676— 678
Demesure B。Sodze N，Petit RJ．1995．A set of universal primers Ior
amplification of polymorohic non-coding regions of mitochondria1
and chloroplast DNA in plantsEJ]． z 0Z，4：129—131
Downie SR，Katz-Downie DS． 1996． A molecular phylogeny of
Apiaceae subfamily Apioideae：evidence from nuclear ribosoma1
DNA internal transcribed spacer sequences~J]．Am J But，83：
234— 251
Downie SR．Katz-Dowhie I38．a1o K—J．1996．Phylogenetic analysis
of Apiaceae subfamily Apioideae using nucleotide sequences from
the chloroplast rpoCl intronEJ]．Mol Pkylogenet＆ z，6：1一l8
Downie SR，Katz-Downie DS，W atson MF．2000．A phylogeny of the
flowering plant fanfily Apiaceae based Ol chloroplast DNA @16
and rpoC1 intron sequences：Towards a suprageneric classification
of subfamily Apioideae[J]．Am J Bot，87：273—292
Elder JR．，rurner BJ．1995．Concerted evolution of repetitive DNA
sequences in eukaryotes[J]．QRev Biol，70：297—319
Erdogan V，Mehlenbacher SA．2000．Phylogenetie relationships of
Corylus species(Betulaceae)based on nuclear ribosomal DNA
ITS region and chloroplast matI(sequences[J]．Syst Bog，25：
727— 737
Fisher PJ．Gardner RC．Richardson TE．1996．Single lOCUS micro—
satelites isolated using 5-anchored PCR[J]．Nuelei~Acids
Res，24：4 369— 4 371
Fleischer RC，Loew S．1995．Construction and screening of micro—
satelitc-enriched genomic libraries[M]／／Pe．．．．is J，Palumbi S
(eds)．M olecular Zoology：Advances，Strategies and Protocols．
W iley-Liss．New York：459——468
Francisco-Ortega J，Santos-Guerra A，Hines A．et n￡． 1997．Mo
lecular evidence for a M edite*‘raneal origin of the Macaronesian
endemic genus Argyranthemum(Asteraceae)Vii．Am J Bot，84：
1 595～ l 613
Fritsch PW ．Morton CM ，Chen T，eta1．2001．Phylogeny and bio—
geography of the Styracaceae[J]．International J Plant S(i，162
(6 Supp1．)：$95一S116
Hamilton MB．Pincus EL．Di Fiore A ，eta1．1999．Universal linker
and ligation procedures for construction of genomic DNA 1ibrar-
ies enriched for mierosatelites[J]．Bio Te{ ，27：500～507
Heinze B． 2007． A database of PCR primers for the chloroplast
genomes of higher plants[J]．Plant Methods，3：4
Hoot SB．Magalon S．Crane PR． 1999．Phylogeny of basal eudicots
based on three molecular data sets：atpB，rbcL，and 18S nuclear ri—
bosomal DNA sequences~J]．AnnMo But G ，86：1—32
Jin H．Shi SH，Pan HX，et a1．1999．Phylogenetic relationships be—
tweed Michelia(Magnoliaceae)and its related genera based ol the
matK gene sequence[J]．Acta Univ Sunyatseni：Sci Nut E ．
38：93— 97
Johnson LA．Soltis DE．1994．matK DNA sequences and phyloge—
6期 王玉 国：植物分子系统发育与进化研究的基 因选择、引物设计与应用策略 759
netic reconstruction in SaⅪfragaceael_J]．SystBot，19：143—156
．foTdon WC，Oourtney MW ，Neigel JE． 1996． Low levels of in—
traspecific genetic variation at a rapidly evolving chloroplast DNA
lOCHS in North American duckweeds(Lemnaceae)[J]．Am J
B0￡，83：430— 439
Kandpal RP，Kandpal G，Weissman SM．1 994．Construction of li—
braries enriched for sequence repeats and j umping clones，and hy一
1)ridizadon selection for region—specific markers[J]．Proe Natl
A“ [』Sci USA．91．88—92
l
quence repeats[J]．NucleicAcid Research 21：3 911—3 912
Kelchner SA，Clark LG． 1997．M olecular evolution and phyloge—
netic utility of the chloroplast rpll 6 intron in Chusquea and the
Bambusoideae(Poaceae)[J]．Molecular Phylogenetics Evolu—
tion，8：385— 397
Kelclmer SA．2002．Group II introns as phylogenetic tools：struc—
ture，function，and evolutionary constraints[J]．AmericanJ Bot，
89．1 651— 1 669
Kim T，Sultan SE，I)onoghue MJ．2008．Alopolyploid speeiation
in Persicaria(Polygonaceae)：Insights from a 1ow-copy nuclear
region[j]．Proceedings National Academy oy Sci United States
o
．
／America，105：12 370—12 375
I<()lipara Kl】．Singh RJ，Hymowitz T．1997．Phylogenetic and ge—
nomic relationships in the genus Glycine Willd． based on se—
qticnccs from the irI、S region of nuclear rDNA[J]．Genome，40：
57— 68
I 。 1、 ，Mummenhoff K，Bowman JL．20O2．Al1opolypl0idiza—
rion and olution of species with reduced floral structures in
LePidiIA7I(Brassicaceae)【J]．Proc Natl Acad Sci L，sA，99：
1 6 83 S 16 840
I ench NJ，Norris A ．Bailey A， f a1． 1996．Vectorette PCR isola—
tion of microsatellites repeat sequences using anchored dinucleoti—
de repeats primers[J]．Nucleie Acids Res，24：2 190—2 191
I cvin MM 。Tbulin M．I abat J-N，eta1．2000．Africo，the odd man
out：Molecular biogeography of Dalbergigid legumes(Fabaceae)
suggests otherwise[J]．Syst Botany，25：449——467
I 1aG F C，Kuo D—C．Lin C-C，et a1．2010．Historical spatial range
expansion and a very recent bottleneck of Cinnamovaum kane—
hirae(Lauraceae)in Taiwan inferred from nuclear genes rJ_．
B ^CEwo[Bio[，10：124
Liang H ，Hilu KW．1 996．Application of the matI
l unt DH．Hutchinson WF．Carvalho GR． 1999． An efficient
rlctl1od for PCR—based identification of microsatelite arrays(PI—
MA){J】．MolEcol，8：893—894
Mane!q J-F，Boulter MC，Naciri—Graven Y．2002．The complex his—
tory of the genus Ilex(Aquifoliaceae)：evidence from the compar—
ison of plastid and nuclear DNA sequences and from fossil data
『J『．Plant Syst 235：79—98
~lauos PS，Steele KP． 1997． Phylogenetic analyses of“higher”
1一tamamelidae based on plastid sequence data[J]．Am J Bot，84：
l l07 1 41 9
Mason—Gamer Rj，WeiI CF，Kelogg EA． 1998． Granule~bound
starch synthase：structure，function，and phylogenetic utility[J]．
MolBio!Evol，15：1 658— 1 673
Meimberg H ．Dittrich P，Heub1 G．2001．Molecular phylogeny of
Ne1)entbaceae based on cladistic analysis of plastid tnlK intron
seqtieuce data；J 1．Pla~t Bio1．3：164— 1 75
()sl rander EA ．Jong PM ．Rine J，et“ ． 1992． Construction of
Sill lIl lnsert genOI13iC I)NA Libraries highly eDriched for mic—
r() tcllite repeat 8cquencesrj]．Proc Natl Acad Sci USA，
89：3 419— 3 423
Oxelman B，Yoshikawa N，McConaughy BL， t nZ．2004．RPB2
gene phylogeny in flowering plants，with particular emphasis on
asteroids[J]．Mol Phylogenet Evol，32：462—479
Parkinson CL，Adams KL，Palmer JD．1999．Multigene analyses i-
dentify the three earliest lineages of extant flowering plants[J]．
CurrBiol，9：1 485— 1 488
Posno M ．van V1let A，Grott GSP．1986．The gene for Spirodel“0Z—
igorhiza chloroplast ribosomal protein homologous to E．coli ribo—
somal protein L16 is split by a large intron near its 5 end：Structure
and expression[j]．NuxleicAcids-Res，14：3 181—3 195
Qiu YL，Lee J，Bernasconi-Qua&oni F，et a1．1999．The earliest
angiosperms：evidence from mitoehondrial， plastid and nuclear
genomes[J]．Nature，402：404—407
Sa~ur OI，Andres TC，Wessel—Beaver L．2002．Phylogenetic rela—
tionships among domesticated and wild species of Cucurbita(Cu—
curbitaceae)inferred from a mitochondfia1 gene：Implications for
crop plant evolution and areas of origin[J]．Proc Natl Acad Sci
嘲 ，99：535— 540
Sang T，Donoghue MJ，Zhang D．1997．Evolution of aleohol
dehydrogenase genes in peonies(Paeonia)：phylogenetic rela-
tionships of putative nonhybrid species[J]．Mol Biol Evol，
14：994— 1 O07
Schaefer H ，Renner SS．2010． A three-genome phylogeny of M o一
110rdica(CUCHrbitaceae)suggests seven returns from dioecy to
monoecy and recent long-distance dispersal to Asia[J]．Mol
Phylogenet Evol，54：553——60
Sohis DE，Soltis PS．1998．Choosing an approach and an appropri—
ate gene for phylogenetic analysis[M]／／Sotis DE(eds)．Molecu—
lar Systematics of Plants II．DNA Sequencing．Kluwer Academic
Publishers：l 42
Sweeney PW 。Price RA． 2000．Polyphyly of the genus Dentaria
(Brassicaceae)：Evidence from trnL intron and ndhF sequence
data[J]．Syst Boa，25：468—478
Taberlet P，Giely L，Pautou G，et n￡．1991．UniversaI primers for
amplification of three non-coding regions of chloroplast DNAEJ]．
PlantMol Biol，17：1 105— 1 109
Wang Y，Fritsch PW ，Shi S，et a1．．2004．Phylogeny and infrage—
neric classification of Symplocos(Symplocaceae)inferred from
DNA sequence data[J]．Am J Bot，91：1 901—1 914
White TJ，Bruns T，Lee S，et a ．1990．Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics
[M]／／Innis MA(eds)．PCR Protocols：A Guide to Methods and
Applications．Academic Press，San Diego：315— 322
W ilkstr6m N ，Ken rick P． 2O0O． Re1ationships of Lycopodiela
based on combined plastid ，_6fL gene and ￡r- L intron sequence
data[J]．S “B0 ，25：495—51O
Yen AC，olmstead RG．2OOO．M 01ecular systernatics of Cyperaceae
t—be Cariceae based 0n tw0 chlor0plast f)NA regi0ns： F^ and
L intron-intergenic spacer[J]．s ￡B ，25：479—494
Yuan Y—M，Kupfer P，D。yle JJ． 1996． Infragene rjc phylogeny of
the genus(； ”f n，z“inferrred fr。m nucleotide sequences of the in—
ternal transc ribed spacers of the nuclear r．bosomal DNA[刀．Am
J B ，83：641—652
Zane L，Bargeloni L，Patarnel0 T． 0O2．Strategies for microsa卜
e1Iite isolation：a review[J]．M0￡E 0￡，11：1—16
Zhang x(张新宇)，( 0Y(高燕宇)．2。。4．T0 design pcR primers
th 01ig。6 and primer 5(PcR引物设计及软件使用技巧)[J]．
“J B o n如Ⅲn s(生物信息学)，2(4)：15一l8，46
zhang zc(张增翠)，Hou xL(侯喜林)．2oo4．strategies for de—
ve1[)pment of SSR mo1ecular markers(SSR分子标记开发策略及
评价)[J]．H 缸“ (遗传)，26：763—768