全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(3)：383— 387 2011年 5月
甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析
李成磊，张晓伟，吴 琦 ，赵海霞，陈 惠，邵继荣
(四川农业大学 生命科学与理学院，四川 雅安 625014)
摘 要：利用 RT PCR技术从甜荞中克隆得 到查耳酮合酶 (CHS)的 cDNA开放阅读框 (ORF)序列，命名为
FeChs，NCBI登录号为 GU172166．1。该序列长 1 179 bp，编码 392个氨基酸，与其它植物 CHS基因的同源性
为 78 ～92 ，其推导的氨基酸序列含有 CHS高度保守的活性位点及 CHS的标签序列 GFGPG。
关键词：甜荞 ；查耳酮合成酶基因；克隆；序列分析
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)03 0383—05
Cloning and sequence analysis of chalcone synthase
gene Chs from Fagopyrum esculentum
LI Cheng-Lei，ZHANG Xia0_Wei，WU Qi ，ZHAO Hai-Xia，
CHEN Hui，SHAO Ji—Rong
(Colege of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)
Abstract：The eDNA ORF sequence of chalcone synthase gene(FeChs)was amplified by RT-PCR from Fagopyrum
esculentum．Its accession number is GU172166．1 on GenBank．The anlyasis indicated the cDNA sequence was 1 179
bp，encoding 392 amino acids and had a homlogy 78 一 92 with other plants’CHS genes．The deduced amino
acids sequence of FeChs contained the highly conserved catalytic active sites，and the typical Tag sequence of CHS
with GFGPG．
Key words：Fagopyrum esculentum ；chalcone synthase gene；cloning；sequence analysis
甜荞(Fagopyrum esculentum)又称普通荞麦，
属蓼科荞麦属双子叶植物，是我国荞麦的主要栽培
品种之一。甜荞是一年生草本，具有生育期短，抗逆
性强，极耐寒瘠，栽培简单等生产优势，当年可多次
播种多次收获，是中国古代重要的粮食作物和救荒
作物之一。甜荞的籽粒不仅含有丰富的营养元素，
还含有黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在于自
然界，属植物次级代谢产物，在植物紫外防护、花的
显色 、种间相互作用和防御反应 中都扮演着重要角
色(Stefan等，2005)。黄酮类化合物具有降低血浆
胆固醇和甘油三酯的水平、预防动脉粥样硬化(李传
勋等，2005)，抗炎和提高机体免疫力的作用(吴晓
等，1998；胡芝华等，2009)，有很高的营养价值和药
用价值。随着我国荞麦科研和产业开发的发展，荞
麦在农业生产中的地位正在由“救灾补种”作物转变
为农民脱贫致富的经济小作物。
植物体内的黄酮类化合物源自于苯丙氨酸代谢
途径。查尔酮合酶是苯丙氨酸代谢分枝途径中的一
个关键酶。苯丙氨酸经过三步酶促反应生成香豆酰
一 CoA，再 由查尔酮合酶催化 1分子香豆酰一CoA和 3
分子丙二酸单酰一CoA缩合生成柚配基查尔酮，在此
基础上经其它酶的催化合成植物黄酮类化合物(张
收稿日期：2010—09—07 修回日期：2011 O1 27
基金项目：四川省科技攻关项目(2006Z08—012)[Supported by the Key Technologies R&D Program of Sichuan Provinee(2006Z08 o12)1
作者简介 ：李成磊(1983一)，男，四川雅安市人 ，博士研究生，研究方 向为植物基因工程 ，(E-mail)liehenglei1998@yahoo．cn。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E mail：wuqiwq@yahoo．cn)
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萍等，2008)。目前，Chs的研究报告大都集中在其
对花卉花色的影响这一领域(胡可等，2009；邵莉等，
1996；冯慧等，2007)，而对植物体内黄酮类化合物合
成的影响鲜有报道。对传统的甜荞进行改造，以增
强植株体内黄酮类化合物的合成和积累，则其利用
价值将大大提升。对关键酶基因的克隆是这些研究
工作 的基础 和重 点。本研 究以甜荞为材料，对
FeChs的 cDNA进行克隆，为今后进一步的研究提
供资料。
1 材料与方法
1．1材料与主要试剂
供试甜荞种子购自四川阿坝农户，栽培于四川
农业大学生物系试验农场。
RNA提取试剂植物 RNAout试剂盒购 白天泽
基因工程有 限公 司；逆转 录试剂 盒 RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit购 自 Fermentas
公司；质粒 DNA小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购
自 Omega公 司；rTaqDNA 聚 合 酶、克 隆 载 体
pMD19一T购 自 Takara公司。
1．2仪器与设备
高速冷冻离心机，Thermo ELECTRON COR—
PORATION；MyCycler PCR仪 ，BIO—RAD；DYY一
Ⅲ一68型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶
成像系统，BIO—RAD；DNP一9272型电热恒温培养
箱，上海精宏试验设备有限公司。
1．3方法
1．3．1甜荞花总 RNA提取及甜荞 Chs基 因 cDNA
ORF序列的克隆 采用植物 RNA。 试剂盒提取甜
荞新鲜花总 RNA，电泳检测。在 200 L Ep管中加
入甜荞 花 总 RNA 4 FL，Oligo—dT(0．5ug／uL)1
L，H。()7 L，混匀后 ，70℃变性 5 min，立即置于
冰上 1～2 min。向上述离心管 中加入 5×reaction
buffer 4 uL，RiboLock M Riobonuclease Inhibitor 1
L，10 mmol／L dNTP mix 2 L，混匀，37℃反应 5
min除去可能 的 RNA酶污染。将 1 L Rever—
tAidTM M—MuI V Reverse Transcriptase加入上述
Ep管，反应总体积 20 L。42 C 60 min；70℃下
10 min灭活反转录酶，得到 cDNA第一链。以苦荞
Chs的 DNA序列为依据，设计特异引物 Chsf(5f_
CAATGGCACCGACGGT一3 )、 Chsr (5 一GCGC—
CTAGGGATAATCAGTT一3 )，扩增甜 荞 Chs的
cDNA。以引物 Chsf和 Chsr进行 PCR扩增 ，PCR
反应参数 ：94℃ 5 min预变性；(94 oC 1 min，55。C
1 min，72℃ 1 min 30 s)30 cycles；72。C 8 min。扩
增产物经琼脂糖凝胶 电泳 回收后连接至 pMD 19一T
进行克隆，筛选出阳性克隆后送北京诺赛基因组研
究中心进行测序。
1．3．2生物信息学分析 借助 NCBI(http：／／www．
ncbi．nlm．nih．gov／)在线工具 BLAST和生物信息
学软件 DNAman进行甜荞 FeChs核苷酸序列和蛋
白质序列的同源性分析，利用 Clustal X1．81进行多
序列比对后构建系统发育树。
2 结果与分析
2．1甜荞花总 RNA的提取
提取的甜荞花总 RNA 经 2 琼脂糖 电泳结果
见图 1，28S rRNA、18S rRNA和 5．8S rRNA条带
清晰可见，28 S与 18 S的亮度比例接近于 2：1，表
明提取的 RNA质量较高，可用于RT PCR。
图 1 甜荞总 RNA
28s
1 8s
5．8s
Fig．1 Tota1 RNA extracted from flower
of F．esculentum
2．2甜荞 FeChs eDNA序列的克隆
以甜荞新鲜花总 RNA反转录得到的 cDNA第
一 链为模板 ，用特异引物 Chsf和 Chsr进行 PCR扩
增得到约 1 200 bp的特异性条带(图 2)。
2．3甜荞 FeChs基因序列分析
甜荞 CHS基因cDNA扩增产物测序结果经拼
接后得到了长为 1 179 bp的核苷酸序列。该 cDNA
序列包含一个完整的开放阅读框，编码 392个氨基
酸(图 3)，将该序列命名为 FeChs，提交 GenBank，
登录号为 GU172166．1。
Chs序列经 Blast分析表明，其核苷酸序列与
已报道的金荞麦(Fagopyrum dibotrys)F C s的同源
3期 李成磊等：甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析 385
400b
2O0b
图 2 甜荞 Chs基因的 RT-PCR
Fig．2 RT-PCR product of Chs from F．esculentum
性达到 92 ，与掌叶大黄(Rheum palmatum)、虎杖
(Polygonum cuspidatum)、银白杨(Populus alba)等
其它植物 CHS基因序列同源性达 75 以上。
用 DNAman对 FeChs推导的氨基酸基本性质
进行预测。该氨基酸序列相对分子质量为 43 099．7，
等电点为 5．86，二级结构中a螺旋占40．O5 ，折叠
片占21．17 ，无规则卷曲占38．78 ，在 366～388
位氨基酸处可能存在跨膜结构。用 SWISS-MOD—
EL对甜荞 CHS三级结构进行预测，其结构如图 4。
将 FeChs推导的氨基酸序列进行 BLASTP分
析，结果表明其与同为蓼科植物的金荞、苦荞 (Fa-
1 采tggcaccgacggtccaggagatcaggaaggctcagagggccgagggtccggccaccgtcctcgctatcggaacggccacaccgcccaa‘
M A P T v Q E I R K A Q R A E G P A T V L A I G T A T P P N
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A N
图 3 甜养FeChs cDNA ORF序列和推导的氨基酸序列
Fig．3 cDNA ORF sequences of FeChs and its deduced amino acid sequences
阴影部位表示高度保守活性位点；划线部位为 CHS标签序列 GFGPG。
Shaded areas denote the conserved active sites of CHS；The signature sequence is GFGPG is underlined
gopyrum tatar~cum)、掌叶大黄、虎杖的同源性均在
9O 以上，与不同科植物如葡萄(Vitis vinifera)、
银白杨、大豆(Glycine max)等也具有较高的同源
性。利用 DNAMAN软件将 FeCHS推导的氨基酸
序列与其它几种植物 CHS的氨基酸序列进行多序
列比对。分析表明，FeChs编码的氨基酸序列含有
。
D k6 b ∞ ggg
386 广 西 植 物 31卷
CHS高度保守的活性位点 Cys¨ 、Phe札。、His 和
Asn (Ferrer等 ，1999；Shomura等，2005)以 及
CHS的标签序列 GFGPG(图 3)，这些活性位点与
苦荞、金荞等 CHS活性位点比较相似，表明甜荞
CHS是 cHS蛋白质家族中的一员。
2．4分子进化分析
利用Clustal X1．81软件构建基于CHS氨基酸
序列的系统发育树(图 5)。可以看出甜荞麦与同为
蓼科的苦荞麦与金荞麦的同源关系最近，并与掌叶
大黄和虎杖构成一个分支，表明与它们的同源关系
较近，而与其它植物的同源关系较远。
图 4 预测 的甜荞 CHS三级结构
Fig．4 The predicted 3-D structure of CHS
图．5 CHS氨基酸序列构建的系统发育树
Fig．5 Phylogenetic tree based on amino
acid sequences of CHS
3 讨论
黄酮类化合物是植物在长期进化过程中应对紫
外辐射、高光强度、低温、干旱等不利生存因素而产
生的物质。黄酮类化合物的出现可能是植物进化选
择的一个标准(Stefan等，2005)。CHS作为黄酮类
物质代谢途径的关键酶，它的活性直接影响下游反
应 ，最 终 对 黄 酮 类 物 质 的 产 量 产 生 重 大 影 响
(Shelagh等，2001)。胡可等(2009)对不同品种瓜
叶菊(Senecio cruentUS)的结构基因表达差异进行研
究后发现，白色花与有色花的差异主要体现在于
Chs基因的是否表 达。当 Chs基 因的表达 被抑 制
后，转基因瓜叶菊 的花色会变为 白色或出现不规则
的白色 条纹。国外一些 学 者对 欧洲 女贞 (Ligus
trum vulgare)的研究 以及 我 国学 者对 玉 米 (Zea
mays)和大豆等的研究发现适当的光照条件和强度
可以提高植物组织中的黄酮类化合物的含量(Mas—
similiano等，2004；Agati等，2002；高炜等，2004；李
卫东等，2004；曾明等，1997)，低温有利于植物组织
中的黄酮类物质 的积累(徐文燕等，2006)。进一步
的研究表明Chs基因的转录水平受到光照条件的调
节。Fritz等 (1983)发 现紫 外辐 射 可 以诱 导 欧 芹
(Petroselinum hortense)Chs的 tuRNA瞬时大量表
达，Rhonda(1991)等 的研究发现拟南芥 (Arabidop—
sis thaliana)的 Chs的基 因表达水平与光照强度呈
正相关。Leyva等(1995)的研究表明低温以及较明
显的温差可以诱导 Chs的表达。此外，有研究表明
赤霉素可以降低 Chs的活性，进而抑制黄酮类物质
的合成(程水源等，2000)。
作为植物重要的次生代谢途径之一，苯丙氨酸
代谢途径的调控体系非常复杂，不仅受本体基因的
控制也受到外界条件的影响。基因工程的发展给人
类带来一个改造生命的有力武器，但是它也并非万
能。有报道称当外源Chs基因导人本身含有Chs基
因的植物时，会因为 Chs基因的高同源性会产生共
抑制现象 ，导致转基因植物的 Chs局部或全部不表
达(Vander Krol等，1990)。邵莉等(1996)对转基
因矮牵牛(Petunia hybrida)研究发现 ，转基 因植株
不仅花色发生明显变化，其育性也发生变化，出现雄
性不育植株。赵万苓等(2006)利用农杆菌将 Chs基
因导人大岩桐(Sinningia speciosa)，发现转基因植
株长势普遍稍低于野生植株，转基因植株的抗性也
降低了。所以在对传统甜荞进行改造时，要充分考
虑它的遗传效应和生理效应 ，一方面可 以通过基 因
工程技术增强植物体内Chs基因的表达，另一方面
可以探求增强 Chs基因表达的外部条件，在两者之
间寻求一个平衡点，以获得对甜荞最佳的改 良和最
3期 李成磊等：甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析 387
大的利益。当然，这些工作都是建立在对苯丙烷类
代谢途径的充分了解的基础上，所以对该途径的关
键酶一CHs的研究是一个好的起点也是一个重点。
本研究首次从甜荞基因组中克隆出 CHS的基因，
并对克隆的基因序列和其氨基酸序列进行了生物信
息学分析，为黄酮类化合物的研究补充 了数据和
资料 。
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