全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(4)：531— 535 2011年 7月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．04．021
姜荷花炭疽病病原茵分离与鉴定
赵 健 ，赵志国1，李秀娟1，张翠萍1，区 蝉 ，林 萌2，仇 硕
(1． 薯 广西植物研究所，广西桂林54106；2．桂林市石山绿化试验站，广西桂林54101)
摘 要：利用常规组织分离法对姜荷花炭疽病病原菌进行了分离，并对分离菌株进行培养 、纯化、回接和重新
分离 ，最后利用形态学和分子生物学技术对致病菌株进行了鉴定。结果表明 ：从感病叶片中分离得到 6株病
原菌 ，病原菌室外 回接发现只有菌株 Cum一3致病 ，Cum一3室外回接致病率 96．7％，室内回接致病率 100 。形
态学鉴定 ，Cum一3为镰孢酶属病原菌 ，菌落圆型，菌丝 白色，有 隔膜 ，有分枝；分生孢子有小型、大型和厚垣 3
种。对菌株 Cum一3进行 ITS序列分析 ，获得全长 528 bp的序列 ，该序列与 Genbank中已登陆的序列进行相似
性分析，并结合 田间致病症状 ，认为该致病菌为层 出镰孢菌。
关键词：姜荷花；炭疽病；分离；鉴定
中图分类号：$432 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)04—0531—05
Isolation and identification 0f pathogens that
1 一 - · ‘ ，⋯ 一
Cau ed Curcuma alismati，olia anthraCn0Se
ZHA0 Jian1，ZHAO Zhi—GuoI，LI Xiu-Juan1，ZHAN『G Cui-PingI，
oU Chan ，LIN Meng2，QIU Shuo1
(1．Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，
Guilin 541006，China；2．Limestone Greening Station of Guilin，Guilin 541001，China)
Abstract：The pathogens that caused Curcuma alismatifolia anthracnose were isolated using usual tissue isolation．
Strains were cultivated，purified，reinoculated in the field and laboratory．The strain that caused the anthracnose was
re-isolated．Morphological and molecular biological techniques were used to identify the strain．Results showed that 6
strains were isolated from infected leaves of C．alismatifolia，but only Cum-3 caused the anthracnose．The incidences
of Cum-3 disease reinoculated in the field and laboratory were 96．7 and 100 respectively．Cum-3 is a kind of fun—
gi belonging to the genus Fusarium，and its colonial morphology is a circular form，with white mycelium ，diaphragms
and branches．There are three kinds of conidia：microconidia，macroconidia and chlamydospores．At last，the sequence
of internal transcribed spacer(ITS)region of Cum-3 was analyzed，the length was 528bp and the sequence was tom—
pared with other species in the Genbank．The symptom in the field indicates that the pathogen of Curcuma alismati—
folia anthracnose is Fusarium proliferatum．
Key words：Curcuma alismatifolia；anthracnose；isolation；identification
姜荷 花 (Curcuma alismatifolia)是 姜科 (Zin—
giberaceae)姜 黄属 (Curcuma)多 年生 热 带球 根花
卉 ，原产 于泰 国清迈一带 ，现在美国、荷兰、I3本 、中
国等有种植 ，是优 良的鲜切花和盆栽花卉(张锦兴 ，
收稿 日期 ：2010—08—17 修回日期：2010—07—05
基金项目：广西自然科学基金(桂科自0991225)；广西植物研究所基本科研业务费项 目(桂植业 09018，桂植业 09008)[Supported by the Natural Sci—
ence Foundation of Guangxi(0991225)；Science Research Foundation of Guangxi Institute of Botany(09018，09008)3
作者简介：赵健(1963)，男，广西玉林人 ，副研究员 ，主要从事园林植物的引种栽培及开发工作，(Email)zhaoj@gxib．cn。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E—mail：qiushuo001@163．corn)
532 广 西 植 物 31卷
1997；刘启云 ，2005；林金水等 ，2003)。目前 ，国内外
对姜荷花的栽培管理 、切花保鲜、组培快繁 、新 品种
培育等研究 已有很多报道 (Supuk等 ，2006；Kanok
等，2004；叶秀仙等，2007；陆銮眉 ，2006；牟小翎等，
2006)。据研究报道 ，姜荷花易感染枯萎病 (Morita
等 ，1996；Kunopagan等 ，2005)、炭 疽病 (Supuk等，
2007)和叶斑病(Takeuchi等 ，1994)等病害，这些病
害严重影响切花的产量和品质 ，他们还对致病病原
菌分别进行了鉴定 ，而 国内未见有关姜荷花病原菌
分离与鉴定的报道。我们观察发现姜荷花发生的炭
疽病发病症状与 Supuk等(2007)报道的姜荷花炭
疽病发病症状不同，而病原菌是否相同还需要对其
分离和鉴定。为此，我们对姜荷花炭疽病病原菌进
行了分离和纯化 ，并利用形态学及分子生物学 的方
法进行了初步鉴定，旨在为该病害的有效防治提供
一 定理论依据。
1 材料与方法
1．1植物材料
姜荷花 品种 ‘清迈粉 ’(Curcuma alismatifolia
Chiang Mai Pink)，2009年 1月从广东东莞引进 ，种
植于广西植物研究所花卉中心苗 圃。
1．2实验方法
1．2．1病原茵的分 离、纯化 2009年 8月，从发病的
姜荷花植株上采下病叶后 ，参照常规组织分离法(方
中达 ，1995)分离。冲洗干净，在叶片的病健交界处
切下 5 mm×5 mm 的小块，用 75 的酒精消毒 3O
s，再用 0。1 浓度 的升汞溶液消毒 90 S后 ，用无菌
水冲洗干净后移置于 PDA培养基上，每个培养皿
(直径 9 cm)放 5～6个材料 ，25。C恒温条件下培养 ，
待长出菌丝后(7 d)，在各菌落边缘用无菌接种针分
别挑取约 2 mmx 2 mm带有菌丝的培养基一块 ，移
于 PDA培养基上 ，编号，继续放人 25℃恒温条件下
培养。
1．2．2病原茵的回接及重新分 离 (1)田问回接 ：选
择健康植株的叶片 ，利用解剖刀轻轻割伤叶片上表
面，面积约 5 mm×5 mm，取培养基中生长 良好的病
原菌菌落(约 5 mm×5 ram)，利用透明胶布粘附到
已割伤的叶片部位，长菌落的一面贴向叶片，以无菌
的 PDA培养基作对照，每个处理 5株 ，各 1片叶子 ，
每个叶片粘贴 2个菌落 ，共计 10个菌落 ，重复 3次。
7 d后统计感病菌落和发病率，发病率 一感病菌落
数／接种 菌落 数 ×100 。数 码 相 机拍 照 (型 号：
Cannon IXUS 870)。(2)室 内回接 ：对 田间回接致
病的病原菌进行室 内回接。选择健康植株的叶片，
洗净 、无菌水冲洗 ，剪取大约 7 am×8 am大小的叶
片置于铺有 4层吸水纸的培养皿(直径 9 cm)中，利
用解剖刀轻轻割伤叶片上表 面，面积约 5 mm×5
mm，取培养基中生长 良好的病原菌菌落 (约 5 him
×5 ram)，以无菌的 PDA培养基作对照 ，每个处理
3个叶片，每个叶片粘贴 4个菌落 ，重复 3次。4d后
统计感病菌落和发病率，发病率一感病菌落数／接种
菌落数 ×100 。数码相机拍照 (型号：Cannon IX—
US 870)。(3)重新分离：对田间回接致病病原菌进
行再次分离 ，分离方法同 1．2．1。
1．2．3病原菌的形态学鉴定 挑取生长良好的病原
菌菌落，大小约 2 mm×2 mm，置于含有 PDA的培
养皿(直径 9 cm)中，25℃恒温条件下培养，2 d后
观察菌丝体、分生孢 子的形 态，光学显微镜 (型号 ：
DIGICLASS)拍照，同时测量分 生孢子大小 (长 X
宽)及菌丝直径。根据真菌鉴定手册(魏景超 ，1979)
对病原菌进行初步鉴定。
1．2．4姜荷 花炭 疽 病病 原 茵分 子 生物 学鉴 定
DNA的提取 ：微波炉法提取 DNA(Cobb等，1994)。
PCR扩增 ：采用真菌 通用引物 对 ITS1／ITS4进行
PCR扩增(White等，1990)。’测序与比对：PCR产
物的纯化和测序由上海生工生物工程有限公司完
成，将所 得 序列 与 GenBank (http：／／www．ncbi．
nlm．nih．gov)中核 酸数据进行 BLAST分析，利用
Clustal X2．0进行 比对，通过 MEGA4xl进行 UP—
GMA分析生成系统发育树。通过同源性分析对病
原菌种进行分子水平鉴定(李若瑜等，2002)。
2 结果与分析
2．1病原菌的分离和纯化
从感病叶片 中分离得到 6株病原菌，编号分别
为 Cum一1、Cum一2、Curn-3、Cum-4、Curn-5、Curn-6，
分别在 PDA培养基上纯化 3次。
2．2病原菌的回接及重新分离
分别对 Cum一1、Cure一2、Cum一3、Curn-4、Curn-5
和 Cure一6等 6个菌株进行 田间回接 ，7 d后统计 发
病率(表 1)，与对照比，只有 Cum一3号菌株引起姜荷
花发病 ，发病率 96．7 ，接种部 位 中心黑 褐色 、干
枯 ，周围黄色(图 1：d，e)，症状表现同田间发病基本


4期 赵健等 ：姜荷花炭疽病病原菌分离与鉴定 535
AY21 3653
GQ855797
X94176
cure-3
GQ1 68841
GQ1 67232
AY21 3654
EU3261 93
EU68O539
GU445378
图 4 菌株 cure一3及其近源属种的聚类分析树状图
Fig．4 Phylogenetie tree of isolate CUITI一3 and its ho—
mologus based on ITS sequences AY213654(Fusarium
annulatum)；GQ855797(B0fr osp^ ⅡPr dothidea)；X94176
(F． fujikuroi)； GQ168841 (Gibberella moniliformis)；
GQ167232(F．proliferatum )； AY213653(F．acutatum)；
EU326193(G．fujikuroi)；EU680539(Sordariomycete sp．)；
GU445378(F．oxysporum)
trichum musae)(Supuk等 ，2007)，花苞 片和叶片 叶
斑病是 由顶孢霉属 的一种菌(Acremonium spp．)引
起 的(Takeuchi等，1994)。本文运用形态学和分子
生物学手段 ，对姜荷花炭疽病病原菌进行鉴定发现 ，
结合该病原菌对植物致病症状 ，认 为该病原菌是 由
层 出镰孢菌引起的，这与泰 国学者 Supuk等(2007)
年报道的炭疽病病原菌不同，他们发现 由香蕉炭疽
菌引起 的姜荷花叶片炭疽病最初症状是花瓣 出现极
小的水浸状 ，然后扩大呈 中间综褐色、周 围暗黑色斑
状，随后在花茎上形成综褐色溃疡等症状，而本研究
中姜荷花发生的炭疽病发病初期表现为叶片出现褐
色斑块，周 围黄色 ，随后整个叶片出现褐色斑块 ，并
呈烧焦状 ，直至全株干枯、死亡 ，但没有溃疡症状 出
现，这说明应该是不同病原菌引起 的姜荷花炭疽病 。
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