全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(1)：1l7— 121 2010年 1月
花烛体细胞胚胎发生过程中
相关生理生化特征研究
许传营，陈星旭，辛伟杰，王广东
(南京农业大学 园艺学院，南京 210095)
摘 要 ：以花烛品种 Amigo为材料 ，研究 了悬浮培养条件下花烛体细胞胚胎发生过程 中相关生理生化特征。
结果表明：POD、CAT在胚性愈伤组织阶段维持较高活性，而SOD在体胚发育后期阶段活性较高；可溶性蛋
白质含量在胚性愈伤组织阶段 出现高峰；可溶性糖含量变化表现为先上升后下降的趋势 ，而淀粉含量表现为
先下降后上升的趋势 ；SDS—PAGE电泳分析表明，胚性愈伤组织阶段蛋 白质表达量高，种类多 ，并 出现多种特
异蛋 白。分析认为胚性愈伤组织 阶段是调控花烛体细胞胚胎发生过程的关键阶段 。
关键词：花烛 ；体细胞胚胎发生 ；生理生化特征
中图分类号 ：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)01-0117-05
Some physiological and biochemical charateristics
of different developmental stages of somatic
embryogenesis in An thurium andraeanum
XU Chuan-Ying，CHEN Xing-Xu，XIN Wei—Jie，Ⅵ NG Guang-Dong
(College of Horticulture，№ ing Agricultural University，NaNing 210095，China)
Abstract：Using Anthurium andraeanum ev．‘Amigo’as material，some physiological and biochemical characteristics
of different developmental stages of somatic embryogenesis were studied．The results showed that the activity of POD
and CAT maintained at a high level at the stage of embryogenic callus，and SOD activity present a high level at the
later stage of somatic embryogenesis．The content of soluble protein was the highest at the stage of calus formation，
and the content of starch went down first and up later but the content of soluble sugar up first and down later contra—
rily during the somatic embryogenesis．SDS-PAGE analysis showed that there are some specific proteins and high ex—
pression proteins at the stage of embryogenic calus．It concluded that the embryogenic calus formation stage is im—
portant for the regulation of somatic embryogenesis in A．andraeanum．
Key words：Anthurium andraeanum ；somatic embryogenesis；physioloygical and biochemical charateristies
花烛(Anthurium andraeanum)又名红掌、安祖
花，为天南星 科 (Araceae)花烛 属 (Anthuriurn)植
物，是全球销量第二的热带花卉 (Laws& Galin—
sky，l996)。花烛种苗 生产 主要通过组织培养技术
进行，其离体培养技术最早由 Pierik等(1974)成功
建立并成为一种快速有效的繁殖方式。而花烛体细
胞胚胎发生途径最早 由 Kuehnle等 (1992)进行 了
报道 ，但 由于受到花烛体胚发生体系稳定性 以及发
育同步化调控技术的局限，目前尚未见大规模生产
应用。本实验室于 2004年对花烛 的体细胞胚胎发
生过程进行了探索和改进，并建立了花烛体细胞胚
胎的高频发生条件(辛伟杰等，2006)，在此基础上进
收稿日期：2008-06-23 修回日期 ：2009-01-12
基金项目：国家自然科学基金 (30300244)[Supported by the National Natural Science Foundation of China 130300244)~
作者简介：许传营(198I-)，男，山东济南人 ，硕士研究生，从事园林植物与观赏园艺研究，(E-mail)xuchuanying_001@163．corn。
。通讯作者(Author for corresp0ndence，E-mail：gdwang@njau．edu．cn)
118 广 西 植 物 3O卷
一 步探讨花烛体胚发生机理 ，为合理进行花烛体胚
发生调控提供依据。
植物体细胞胚胎发生过程的相关生理生化变化
在多种植物上已有报道，但关于花烛体胚发生的生
理生化特征尚未见报道。本试验在已建立的花烛体
细胞胚胎发生条件的基础上，对花烛体细胞胚胎发
生发育过程的生长指标 (生长动态和干鲜 比)、抗 氧
化酶活性(P0D、CAT、SOD)及碳水化合物含量(可
溶性糖、淀粉)和可溶性蛋白质含量进行 了测定与分
析，并对体胚发生发育过程各阶段的蛋白质组成进
行 SDS—PAGE电泳分析，明确体胚发生发育生理生
化特征 ，以期 为花烛体胚 大量培 养调控 提供理论
依据。
1 材料与方法
1．1试验材料
花烛胚性愈伤组织诱导以及体胚发育条件参考
辛伟杰等(2006)的方法。以花烛品种‘Amigo’无菌
苗叶片为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导培养基
I／2MS+2．0 mg·L- 2，4一D+0．5 mg·L一 KT+
3％蔗糖 ，pH5．5，暗培养 40 d，外植体边缘形成淡黄
色颗粒状胚性愈伤组织。将获得的胚性愈伤组织接
种于液体培养基中进行增殖培养，得到深黄色、颗粒
状胚性愈伤组织团。然后将增殖的胚性愈伤组织接
种于液体发育培养基中进行培养，30 d后形成结构
松散、淡黄色、较大颗粒的花烛盾形胚。将盾形胚接
种到液体发育培养基中20 d，体胚萌发产生白色透
明状胚根。液体条件下进行光照培养，20 d后胚根
变绿并伴有胚芽萌发。将体胚转接于固体培养基中
进行萌发成苗，30 d后胚根迅速伸长，并生有白色
根毛，胚芽端萌发出真叶。
将整个花烛体细胞胚胎发生过程分 为六个 阶
段：外植体阶段(A)胚性愈伤组织阶段；(B)体细胞
胚胎形成阶段；(C)胚根伸长阶段；(D)胚芽出现阶
段；(E)萌发成苗阶段(F)。
1．2试验方法
1．2．1抗氧化酶 POD、CAT、SOD活性测定 分别
准确称取花烛体细胞胚胎发生各阶段的新鲜材料
0．3 g，在冰浴上研磨，加入 PBS(pH7．8)缓冲液 1．6
mL，充分混匀后 ，12 000 r·min 离心 30 min，取上
清液冷藏备用，POD活性采用氧化愈创木酚法(李
合生等，2000)，以每分钟 A值增加 0．01为 1个活
性单位 ，结果以 U ·g (FW)·min- 表示；CAT活
性采用过氧化氢氧化法(Britton Maehly，1955)，
以每分钟 A值减少 0．01为 1个活性单位 ，结果以
U·g。(Fw)·min 表示；SOD活性测定采用 NBT
光还原法(李合生等，2000)，SOD活性单位以抑制
NBT光化还原的5O 为 1个酶活性单位，结果以U
· (FW)表示 ，所有测定均重复 3次。
1．2．2可溶性蛋 白质、可溶性糖及 淀粉含量测定
(1)可溶性蛋白质含量测定 ：利用 1．2．1提取的上清
液，采用考马斯亮蓝 比色法进行测定(李合生等，
2000)，结果以mg·g (Fw)表示。(2)可溶性糖含
量测定：利用干鲜比测定中制备的各阶段材料的干
样，分别准确称取各发育 阶段 干样 0．05 g进行研
磨 ，加人 5 mL蒸馏水 ，混匀后于 85℃水浴保温 30
min，冷却后 10 000 r·mif 离心 10 min，将上清夜
利用蒽酮 比色法测定可溶性糖含量(李合生等，
2000)，结果以mg· (Dw)表示。(3)淀粉含量测
定：将可溶性糖测定中各阶段离心后的残渣于8O℃
烘箱中烘干，加入 1．0 mL蒸馏水，于沸水浴中糊化
3O min，冷却后加入高氯酸制备提取液，蒽酮法 620
rim测定吸光度(Hal等，2001)，计算淀粉含量，结
果 以 mg· (DW)表示。
1．2．3各 阶段 SDS蛋 白质 电泳 SDS—PAGE电泳 一
参考萨姆布 鲁克等 (2002)的方法，采用 1O 分离
胶，图像采集及分析采用软件 bandscan 5．0。
2 结果与分析
2．1抗氧化酶活性变化
如图 1：A所示，POD活性在整个花烛体胚发
生过程中呈现急剧升高然后下降的规律性变化。由
外植体到胚性愈伤组织阶段(A—B)急剧上升，由愈
伤组织到体胚形成阶段(B—C)又迅速下降；随后各
阶段陆续平缓下降。由图 1：B可知，花烛体胚发生
过程中，从外植体阶段到胚根出现阶段(A—D)
CAT活性维持在较高水平，仅在体细胞胚胎形成阶
段略有下降；随后的胚芽出现阶段和萌发成苗阶段
CAT活性明显下降。由图 1：C可知，S0D活性在
花烛体胚发生过程中呈现先下降后上升随后又有所
下降的趋势。由外植体到体细胞胚胎形成阶段(A
—C)SOD活性下降 ，随后到胚芽出现阶段(C—E)
活性又上升至最高点；萌发成苗阶段又回落到和外
植体活性相当的水平。
1期 许传营等：花烛体细胞胚胎发生过程中相关生理生化特征研究 119
2．2可溶性蛋白质 、可溶性糖及淀粉含量动态变化
如图 2：A所示，花烛体细胞胚胎发生过程 中可
溶性蛋白质含量呈现先升后降的规律性变化。由外
植体阶段到胚性愈伤组织阶段(A— B)可溶性蛋白
质含量急剧上升 ；在随后的体细胞胚 胎形成阶段和
胚根伸长阶段 (B—D)含量迅速下降。图 2：B所示
为可溶性糖含量动态变化 ，可溶性糖含量呈现先上
升后下降的趋势。在胚根伸长阶段出现高峰；随后
含量迅速下降；萌发成苗阶段略有升高。淀粉含量
的动态变化如图 2：C所示 ，呈现先下降后上升的趋
势 。由外植 体到体细胞胚胎形成阶段(A—C)淀粉
含量处在相对较平稳的水平；胚根伸长阶段出现迅
A B C D E F
发育阶段 Deve Iopment stage
图 1 花烛体细胞胚胎发生过程中 POD、CAT、SOD活性变化
Fig．1 The change of POD，CAT and SOD activity during the somatic
embryogenesis of Anthurium andraeanum ．
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量
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加 ”
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终
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图 2 花烛体细胞胚胎发生过程中可溶性蛋白质 、可溶性糖、淀粉含量变化
Fig．2 The change of soluble protein，sugar and starch content during the
somatic embryogenesis of Anthurium andraeanum ．
速下降；胚根变绿胚芽出现阶段含量又迅速上升。
2．3各阶段蛋白质组成变化
花烛体胚发生各阶段的蛋白质电泳图谱表明各
阶段的蛋白质种类和含量存在明显差异(图 3)。蛋
白质含量在胚性愈伤组织阶段最 高，而在随后 的发
育阶段下降，这与所测定的可溶性蛋白质含量变化
趋势相一致。蛋白质种类在胚性愈伤组织阶段最
多，共有 12条蛋白质谱带出现，体胚形成阶段有所
减少，共有 9条蛋白质谱带；这两个阶段出现的蛋白
质谱带大致相同，但胚性愈伤组织阶段比体胚形成
阶段蛋白质表达量高且多出 3条特异蛋白质谱带。
自胚根伸长到萌发成苗阶段蛋白质谱带数目和蛋白
质含量迅速减少。胚根伸长阶段出现的蛋白质谱带
最少，仅为 5条；胚芽出现及萌发成苗阶段与外植体
阶段蛋白质谱带基本相同，仅在萌发成苗阶段多出
一 条蛋白质谱带。18KD、27KD、48KD左右的蛋白
质在所有 阶段均有表 达。143KD、82KD、41KD左
右蛋白质只在胚性愈伤组织中得到了特异性表达，
可能其与胚性愈伤组织形成有关。14KD、25KD左
右的蛋白质在体胚萌发阶段和外植体阶段得到特异
表达，可能与萌发成苗有关。55KD、38KD左右蛋
白质在体胚发生早期 (B—C)和后期萌发成苗及外
植体阶段表达，推测可能与体胚发生过程中的信号
传导及控制体胚发育进程有关。
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A B C D E F Marker
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l4400
图 3 花烛体细胞胚胎发生过程中各阶段
的蛋白质电泳图谱
Fig．3 Electroph0retic patterns of the proteins
during somatic embryogenesis of Anthurium
andraeanum
3 讨论
高浓度的活性氧对植物细胞内的膜系统产生伤
害，导致细胞死亡，抗氧化酶活性对清除植物体内的
活性氧具有至关重要的意义，通常与各种胁迫相关
(Larkindale& Huang，2004；Foyer & Noetor，
2000；Mittler，2002)。而植物组织培养中高浓度 2，
4一D和蔗糖等都对培养物产生胁迫作用。花烛体细
胞胚胎发生过程 中，POD、CAT活性在胚性愈伤组
织阶段都表现较高活性，POD更是在胚性愈伤组织
阶段出现活力高峰。推测可能与胚性愈伤组织阶段
培养基中添加的高浓度 2，4一D和高浓度蔗糖有关。
活性氧在信号转导和细胞分化方面也具有重要作用
(Guteridge& Haliwel，1990)；崔凯荣等(1998)
发现在枸杞体细胞胚胎发生过程中 SOD起到重要
作用，通过在分化培养基中加入 H。O ，大大提高了
愈伤组织中体细胞胚的发生频率，指出在胚胎发生
的早期阶段 SOD活力高峰可能提高了培养物内的
活性氧浓度，进而诱发了体细胞胚胎的发生。本研
究发现，在花烛体细胞 胚胎发生过程 中，POD、
CAT、SOD活性变化各不相同，其中POD活性在胚
性愈伤组织阶段出现高峰，随后即迅速下降，与詹园
凤等(2006)的研究结果基本一致。CAT活性在胚
性愈伤组织阶段维持较高水平，SOD活性在花烛体
胚形成过程中活性下降，在随后的胚根伸长和胚芽
出现阶段快速上升。推测在 花烛体胚 发生的早期
(胚性愈伤组织阶段)，培养物中高浓度的 2，4一D和
蔗糖胁迫促使了培养物体内活性氧浓度的提高，促
进了体胚的形成和发育。POD、CAT在胚性愈伤组
织阶段共同维持了培养物体内的活性氧代谢平衡。
植物体细胞胚胎发生过程的实质是基因顺序表
达的结果，在胚性细胞分化和发育过程中必然存在
有蛋白质含量 的变化和特异蛋 白质 的出现与消失
(崔凯荣等，2000)。本研究 中可溶性蛋 白质含量在
胚性愈伤组织阶段出现高峰，随后的体胚形成阶段
也维持相对较高的含量。这与詹园凤等(2006)和张
建瑛等(2007)的研究结果基本一致。各阶段的蛋白
质 SDS—PAGE电泳分析表明，胚性愈伤组织阶段蛋
白质含量高 ，且出现较多的特异蛋白。表明在体胚
发生早期，体胚发生相关基 因及某些特异基 因的表
达，促进了胚性愈伤组织的形成和增殖。可溶性糖
作为主要能量代谢中间产物能反映植株体内能量代
谢的快慢，而淀粉作为一种多糖储存物质，通常与可
溶性糖在代谢变化中出现相互关联的动态变化(李
华云等，2007)。可溶性糖和淀粉含量也呈现相关的
动态变化 ，淀粉含量在胚根伸长阶段出现波谷，而可
溶性糖含量在此阶段出现波峰，说明在胚根伸长阶
段能量代谢较为活跃，淀粉转化为可溶性糖用于能
量代谢。而部分植物的体细胞胚胎发生过程中会出
现淀粉的积累和可溶性糖含量的下降(杨金玲，
1998；詹园凤等，2006；李冬梅等，2005)，但本研究中
未出现此变化，可能与不同植物的代谢特征存在差
异有关 。
综上所述，在花烛体细胞胚胎发生发育过程中，
胚性愈伤组织阶段出现较高浓度的内含物，较高水
平的抗氧化酶活性，高水平的可溶性蛋白质含量，以
及出现较多的特异蛋白的表达，表明胚性愈伤组织
阶段是调控花烛体细胞胚胎形态发生过程中的关键
阶段，可以通过加入不同的渗透调节物以及有机添
加物来进一步优化花烛体细胞胚胎培养体系。
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