全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(1)：43— 46 2011年 1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142。2011．01．010
番红花 EST资源的 SSR信息分析
陈国庆
(湖北师范学院 生命科学学院，湖北 黄石 435002)
摘 要 ：从 NCBI公共数据库下载得到 6745条番红花 EST，通过前处理得到全长为 612．01 kb的无冗余 EST
1431条 。在这些序列中搜索出 108个 SSR，分布于 103条 EST中，出现频率为 7．55 。这些 EST—SSR的平
均分布距离是 5．67 kb。二核苷酸重复和三核 苷酸重复是 番红花主要的重复类 型，分别 占总 EST—SSR的
30．56％和 37．96 。AG／CT和 AAG／CTT是二 、三核苷酸重复 中的优势基元 ，分别 占二 、三核苷酸重复的
66．67 和 29．27 。本研究为番红花 EST-SSR标记的建立和进一步应用奠定了基础。
关键词：番红花；药用植物 ；EST；EST-SSR；微卫星
中图分类号：Q75 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)01-0043-04
Analysis 0f SSR information in EST res0lJ．ce
n n n ， 1 ． ● ＼
0t Sat tI．0n Cr0CUS L DC ． ttVUS
CHEN Gu0-Qing
(College 0_厂 fe Science，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China)
Abstract：6745 ESTs of saffron crocus in the public database of NCB1 were downloaded and analysed，resulting in
1431 non-redundant ESTs with total length about 612．01 kb．A total of 108 SSRs distrihuted in 103 ESTs were de—
tected，accouting for 7．55％ of the non—redundant ESTs．The average distribution distance of these EST-SSRs was a—
bout 5．67 kb．Dinucleotide and trinucleotide repeats were the main types in Crocus sativus，accouting for 30．56％ and
37．96％ of all the SSRs，respectively．AG／CT and AAG／CTT are the most frequent motifs，accounting for 66．67V0
and 29．27 in dinucleotide and trinucleotide repeats，respectively．The present study provides a base for the develop—
ment and further applification of EST-SSR markers in saffron crocus．
Key words：saffron crocus；medicinal plants；EST；EST-SSR；microsatelite
简 单 序 列 重 复 (Simple Sequence Repeats，
SSRs)，又叫微 卫星 (Microsatelite)或短 串联重 复
(Short Tandem Repeats)，通常是指由 l～6个碱基
组成的核苷酸重复基元。SSRs广泛分布于真核生
物基因组中，具有共显性表达、多态性高等优点，因
而得到 了越 来越 多 的应 用 (Powel等 ，1996；Toth
等 ，2000)。然而 ，SSR标记 的开发需 时长、花费高 ，
大大限制了该分子标记的使用；即使采用 SSR富集
方法可以提高产 出、减低成本 ，仍然需要投入大量的
人力和财力 (Kumpatla等，2004)。近年来，随着功
能基因组学 的发展 ，表 达序 列标 签 (expressed se—
quence tags，ESTs)已成 为开发新型分子标记 的重
要资源。EST—SSR的开发建立在生物信息学方法
的基础上，不但省肘，而且大大降低成本。相对于传
统的基因组 SSR(genomic SSR)，基于 EST的微卫
星标记(EST—SSR)具有独特的优越性：第一，序列
保守性高，通用性强，能在近缘属种间获得较好扩
增；第二，由于其本身来 自基因表达序列，可能与功
收稿日期：2010—04-19 修回日期 ：2010—10—29
基金项 目：国家自然科学基金(30900157)；湖北省教育厅青年项目(Q20082201)；湖北师范学院人才引进项 目(2007F13)[Supported by the National
Natural Science Foundation of China(3O900157)；the Youth Foundation of Hubei Educational Committee(Q20082201)；the Talent Introduction Funds of
Hubei Normal university(2O07F13)]
作者简介：陈国庆(1979一)，女 ，河北邯郸人，博士 ，研究方向为分子生态学 ，(E—mail)gqchenl001@yahoo．corn．cn。
44 广 西 植 物 31卷
能基 因表达有着直接或间接 的关系，可作为一种功
能性分子标记，因此也称基因 SSR(genic SSR)
(Varshney等，2O05)。
番红花 (Crocus sativus)又名藏红 花、西红花 ，
为鸢尾科番红花属植物，原产西班牙、希腊和伊朗等
国，引入我国已有 600多年历史。它是一种珍贵的
药用植物，具有镇静、祛痰、刺激、解痉、活血化瘀等
功效 ，用于胃痛、痛经，可治疗痢疾、麻疹、发热黄疸、
肝脾肿大、泌尿道感染及糖尿病等多种疾病(陈书安
等，2001)。由于仅以柱头人药，资源极其有限，故价
格昂贵，被誉为“植物黄金”。为充分合理地利用这
一 珍贵药用植物，开展番红花资源多样性研究势在
必行 。目前尚未见有关番红花基 因组 SSR标记 的
报道 ，而公共数据库中已积累了大量的番红花 EST
序列，为 EST—SSR标记的开发提供了契机。本研
究对现有番红花 EST中的 SSR信息进行了全面分
析，以明确其 EST—SSR的发生频率和特点，为进一
步筛选番红花 EST—ssR标记和探索其在遗传育
种、图谱构建中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1．1番红花 EST序列的来源
番红花 EST来自美国国家生物技术信息中心
(National Center for Biotechnology Information，NC—
BI)(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／entrez／query．fc—
gi)的GenBank数据库，共计 6 745条序列。
1．2 EST的前处理与片段重叠群(contig)分析
用 EST-trimmer软件(htp：／／pgrc．ipk-gatersle—
ben．de／misa／download／est—trimmer．p1)除去 5 端或
3 端5O bp内重复次数达 5次和 5次以上的polyT或
polyA；除去长度小于 100 bp的 EST序列；对于长度
大于 700 bp的 EST，则保 留其 5 端 的 700 bp。用
DNAStar软件(LASERGENE，DNASTAR，lnc．)对每
个物种的EST序列分别进行片段重叠群分析和聚
类。装配参数设置为：在至少 4O个核苷酸的重复区
域中，最小匹配百分比大于 95 9／6的 EST序列可以
进行拼接与延伸 。
1．3 EST-SSR的发掘
用 MISA 程 序 (htp：／／pgrc．ipk—gatersleben．
de／misa／)对经过前处理的无冗余 EST进行 SSR
查找。筛选标准为单核苷酸重复次数不小于12次，
二核苷酸重复次数不小于 6次，三至六核苷酸重复
次数不小于 5次。同时筛选和记录被少数碱基 (间
隔小于1O或等于10 bp)打断的不完全重复的SSR。
2 结果与分析
2．1番红花 EST-SSR出现的频率
从 NCBI公共数据库下载得到 6 745条来 自番
红花的 EST，总长度 约为 2．64 Mb，经过处理后得
到全长为 612．01 kb的无冗余 EST序列 1 431条，
可见数据库中存在大量的番红花冗余 EST序列。
对所得的无冗余 EST进行搜索，共检出 103条含有
SSR的EST序列，发生频率(含有 SSR的 EST数
目与 EST数 目的比值)为 7．2O (表 1)。其中只含
有 1个 SSR的 EST有 98条 ，含有 2个或 2个 以上
SSR的有5条，共计 108个 SSR，占无冗余 EST的
7．55 ，即为EST—SSR的出现频率。在5条含 2个
以上 SSR的EST中，相邻 SSR之间的距离均大于
1O bp。从分布情况来看 ，平均每 5．67 kb就 出现 1
个 SSR，但不同重复类型问差异很大(表 1)。
表 1 番红花不同重复类型的 EST-SSR分布
Table l Percentage of EST—SSR of different
repeat types in Crocus sativus
在不同核苷酸重复类型 中，最常见 的是二核苷
酸和三核苷酸重复，分别占总 EST—SSR的3O．56
和37．96 ；单核苷酸 SSR所占比例不足 2o％；四
至六核苷酸SSR总计约占13 ，所占比例随着重复
基元核苷酸数目的增大而降低(表 1)。
2．2番红花 EST—SSR的特性
在搜索出的番红花 EST—SSR中，共观察到 23
种不同的重复基元，其中单核苷酸重复仅 1种，二核
苷酸重复3种，三、四、五、六核苷酸重复分别 1O、4、
3、2种(表 2)。单核苷酸重复只检测到 A／T重复
基元 ，没有发现 C／G重复类型。二核苷酸重复 中，
AG／CT出现的频率最高，占所有二核苷酸重复的
l期 陈国庆 ：红花 EST资源的 SSR信息分析 45
AG／CT
66 67％
图 1 二核苷酸重复中不 同重复基元的比例
Fig．1 Percentage of different motifs in
dinucleotide repeats
66．67％，其次是 AT 重 复基 元 ，但是 没 有检 测 到
CG重复基元 (图 1)。三核苷酸重复 中，AAG／CTT
出现 12次，所占比例达29．27 ；其次是CCG／CGG
和 AGC／CGT，所 占比例均 为 12．2O％，仅次 于
AAG／CTT重复基元(图 2)。四、五、六核苷酸重复
的各种重复类型的 出现次数均 小于 5(表 2)。就所
有重 复基元 来看，所 占 比例最 高 的是 AG／CT
(20．37Vo)，其 次 是 A／T(18．52 )和 AAG／CTT
(11．11 9／6)(图 3)。
图 2 三核苷酸重复中不同重复基元的比例
Fig．2 Percentage of different motifs in
trinucleotide repeats
3 讨论
本研究对 GenBank中现有的番红花 EST进行
分析，结果表明 EST—SSR的出现频率为 7．55 ，
SSR—EST的发生频率为 7．2O 。分析得到的番红
花 SSR—EST发生频率高于 Kumpatla Mukho—
padhyay(2OO5)对 番红 花 553条 EST 的研究结果
(5．79 )。造成差别的原因可能有：(1)所分析的
46 广 西 植 物 31卷
EST数量过少，可能 导致结果 的偏差 。Kumpatla
Mukhopadhyay(2OO5)的分析仅针对 当时 Gen—
Bank中为数不多的 500多条番红花 EST。(2)数据
分析方法 的不 同造 成结 果 的差异 。Kumpatla＆
Mukhopadhyay(2005)首先在 ESTs中查找 SSR，再
对含有 SSR的 EST进行拼接 聚类来排 除冗余 的
SSR～EST；而本研究则先进行 EST拼接聚类 、去冗
余 ，再进行 SSR筛选 ，这样在片段重叠群聚类分析
中，可以将一些被打断的 SSR拼接起来，从而增加
SSR检出频率。葛佳等(2005)在对大 白菜 (Brassi—
ca campestris ssp．pekinensis)进行 EST～SSR分析
时发现，非冗余 EST中SSR总数比排除冗余前还
要高 ，证实了片段重叠群分析可 以拼接一些被打断
的SSR。(3)筛选 SSR的参数设置不同，也会造成
结果的差异 。Kumpatla& Mukhopadhyay(2005)
筛选 SSR的标准为单核苷酸重复次数不小于 15
次，二至四核苷酸重复次数不小于 5次；而本分析采
用标准为单核苷酸重复次数不小于 12次，二核苷酸
重复次数不小于 6次，三至六核苷酸重复次数不小
于 5次。我 们 采用 Kumpatla& Mukhopadhyay
(2005)的筛选标准进行重新分析，结果发现 133个
SSR分布于 125条无冗余 EST序列中，含有 SSR
的 EST 发生频 率是 8．74 ，SSR 的 出现频 率为
9．29 。这也 同时 表 明，SSR 筛 选 标 准 改变 时，
EST～SSR的分布频率和 SSR—EST的发生频率都会
随之改变。因此，将不同研究结果加以比较时，应当
采用同一标准。
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重复基元类型
图 3 基于重复基元类型的番红花 EST—SSR比例分布
Fig．3 Percentage of different motifs in
EST—SSRs of Crocus sativus
大多数植物的 EST—SSR以三核苷酸重复占主
导地位，其次是二核苷酸重复 (李永强等，2004；
Varshney等 ，2005)。番红花也表现出类似情况 ，筛
选出的 ESr_SSR 中三核 苷酸重 复所 占 比例最大
(37．96 )，二核苷酸重复也较多 (3O．56 )。番红
花二核苷酸重复中，AG／CT出现频率最高 ，与多数
植物中已报道的情况相同(李永强等，2004)；在三核
苷酸重复中，则 以 AAG／CTT重复为主，与拟南芥
(Arabidopsis thaliana)、柑橘 (Citrus)、大豆(Gly—
cinemax)等 植 物 类 似 (Cardle等，2000；Gao等，
2003；Chen等，2006)。CCG／CGG重复基元在番红
花三核苷酸重复类型 中所 占比例也较高(图 2)，这
种重 复 基 元 在 单 子 叶 植 物 大 麦 (Hordeurn vul—
gare)、玉米 (Zea mays)、水稻 (Oryza sativa)和高
梁(Sorghurn bicolor)中是 占据主导地位 的三核苷
酸重复类型 。这些 占优势的核苷酸重复基元可能与
其编码相应蛋白质的使用频率较高有关，这一点在
拟南芥中得到证实(范三红等，2003)。
番红花 EST数据的不断积累为 EST—SSR标记
的开发提供 了宝贵资源。当前分析表明番红花
EST—SSR出现频率较高、类型较丰富，因此，本研究
结果为进一步开发和筛选番红花 EST—SSR标记奠
定了基础，有助于该物种的遗传资源多样性评价、遗
传图谱绘制、分子标记辅助育种和比较基因组学等
相关研究。
参考文献 ：
Cardle L，Ramsay L，Milboume D，et a1．2000．Computational and
experimental characterizati0n of physicaly clustered simple se—
quenee repeats in plants[J]．Genetics，156：847-854
Chen CX，Zhou P，Choi YA，el a1． 2006． M ining and charac—
terizing microsateIlites from Citrus EsTs gJ]．Theor Appl
Oenet，112：1 248— 1 257
Chen sA(陈书安)，Wang XIX王晓东)，Zhao B(赵兵)，et a1．2001．
Advances in studies on Crocus sativus(藏红花的研究进展)[J]．
Ghin Trad Herb Drugs(中草药)，52(12)：1 137—1 139
Fan sH(范三红)，Guo AG(郭蔼光)，Shah Lw(单 丽伟)，et z．
2003．Analysis of genetic code preference in Arabidopsis thali—
nM(拟南芥基因密码子偏爱性分析)[J]．Prog Biochem Bio—
phys(生物化学与生物物理进展)，30(2)：221—225
Gao LF，Tang JF，Li HW ，et a1．2003．An alysis of microsatelites
in major crops assessed by computational and experimental ap—
proaches rJ_．Mol Breed，12：245—261
Ge J(葛佳)，Xie H(谢华)，Cui CS(崔崇士)，eta1．2005．Analysis
of expressed sequences tags(ESTs)derived SSR markers in Chi—
nese cabbage(Brassica campestris ssp．pekinensis)(3V白菜表达
序列标签 SSR标记分析)[J]．J Agric Bioteeh(农业生物技术
学报)，13(4)：423—428
Kumpatla SP，Manley MK，Horne EC，et a1．2004．An improved
(下转第 96页 Continue o12 page 96)
-L J_0 J_00＼∞《00《<
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96 广 西 植 物 3l卷
Feng JC(冯建灿)，Hu XL(胡 秀丽)，Mao XJ(毛训 甲)．2002．
Application of chlorophyll fluorescence dynamics to plant physi—
ology in adverse circumstance(叶绿素荧 光动力学在研 究植物
逆境生理 中的应用)EJ]．EconomFore Res(经济林研究)，20
(4)：14—18
HuXH(胡学华)，Pu GL(蒲光兰)，Xiao QW(肖千文)，et a1．
2007．Effects of water stress on chlorophyl fluorescence in lear—
as of plum(Prunus salicina Lind1．)(水分胁迫下李树叶绿素荧
光动力学特性研究)EJ]．Chine J Eco-Agri(中国生态农业学
报)，15(1)：75—77
Jiang CD，Gao HY，Zou Q 2003．Changes of donor and acceptor side
in photosystem 2 complex induced by iron deficiency in atached
soybearl and maize leaves[J]．Photosynthetica，41：267—271
Krause GH，Weis E．1988．Applications of chlorophyl fluorescence in
photosynthesis research[J]．Physiol Plant，74：566—577
Mommer L，Visser EJW． 2005． Underwater photosynthesis in
flooded terrestrial plants：a matter of leaf plasticity I-J]．Ann
B0￡，96：581—589
Panda D，Rao DN，Sharlna SG，eta1．2006．Submergence effect on
rice genotypea during seedling stage：probing of submergence
driven changes of photosystem Ⅱby chlorophyl a fluorescence
induction()_J—I_P transientsD]．Photosynthetica，44：69—75
Rohdeek K，Bartdk M．1999．Technique of the modulated chloro—
phyl fluorescence：Basic concepts，useful parameters，and some
applications[J]．Photosynthetica，37：339—363
Vyal YA，Dynkova GR，Leonova NA，et a1．2007．Adaptation of
the photosynthetic apparatus of the immature broadleaf trees to
the floodplain conditionsl,J]．RussJ Plant Physiol，54：58—62
Wang KF(王可玢)，Xu CH(许春辉)，Zhao FH(赵福洪)，et a1．
1997．The efects of water stress on some in vi7)0 chlorophyl a
fluorescenc parameters of wheat flag leaves(水分胁迫对小麦旗
叶某些体内叶绿素 a荧光参数 的影 响)[J]．Acta Biophysica
Sin(iV物物理学报)，13(2)：273—278
Wilbur KM ，Anderson NG．1948．日ectrometric and colorimetric de—
termination of carbonic anhydrase[J]．JBiol Chem，176：147—154
wei Y(魏媛)，Yu LF(喻理飞)，Zhang JC(张金池)．2007．Study
on biomass construction of Broussonetia papyri tem sprouting
population with diferent disturbed conditions in karst region(喀
斯特地区不同干扰条件下构树 萌株种群生物量构成)[J]．J
Na ing Fore Univ：NatSci Edi(南京林业大学学报 ·自然科
学版)，31：58—66
Wu YY(吴沿友)，Li XT(李西腾)，Hao JC(郝建朝)，eta1．2006．
Study on the difference of the activities of carbonic anhydrase in
diferent plants(不 同植 物 的碳 酸酐 酶活力 差异研 究)[J]．
Guihaia(广西植物)，26(4)：366—369
W u YY，Li PP，Zhao YG，et a1． 2007． Study on photosynthetic
characteristics of Orychophragmus violaceus related to shade
tolerancel,J]．Sci Horti，113：173—176
Wu YY，Liu CQ，Li PP，et a1．2009．Photosynthetic characteristics
involved in adaptability to karst soil and alien invasion of paper
mulberry(Broussonetia papyri ra)in comparison with mul—
berry(Morroalba)I-J]．Photosynthetica，47(1)：155—160
W uYY，W uXM ，LiPP，eta1．2005．Comparisonof photosynthet，
ic activity of Orychophragmus violaceus and oil-seed rapeEJ]．
Photossmthetica，43(2)：299—302
Wu YY，Zhao XZ，Li PP，et a1．2006． A study on the activities of
carbonic anhydrase of two species of bryophytes，Tortula sinensis
and Barbula convolnta，Cryptogamie Bryologie，27(3)：349-355
Yang XQ(杨晓青)，Zhang sq(张岁岐)，Liang ZS(梁宗锁)，eta1．
2004．Effects of water stress on chlorophyll fluorescence param —
eters of different drought resistance winter wheat cultivars seed—
lings(水分胁迫对不同抗旱类型冬小麦幼苗叶绿素荧光参数
的影响)rJ]．Acta Bot Boreal-Occident Sin(西北植物学报)，
24(5)：812—816
Yu LF(喻理飞)，Zhu SQ(朱守谦)，Ye JZ(叶镜中)，et a1．2003．
A study on evaluation of natural restoration for degraded karst
forest(退化喀斯特森林自然恢复评价研究)[J]．Sci Silv Sin
(林业科学)，36(6)：12—19
Zhang SR(张守仁)．1999．A discussion on chlorophyl fluores—
cence kinetics parameters and their significance(叶绿素荧光动
力学参数的意义及讨论)[J]．Chin Bull Bot(植物学通报)，16
(4)：444—448
(上接第 46页 Continue from page 46)
enrichment procedtare to develop multiple repeat classes of cotton
microsatelite markers[J]．Plant Mol Biol，22：85a一85i
Kumpatla SP，Mukhopadhyay S．2005．Mining and survey of sire-
pie sequence repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous
r门．Genome，48：985—998
Li YQ(李永强)，Li Hw(李宏伟)，Gao LF(高立峰)，et a1．2004．
Progress of simple sequence repeats derived from exp ressed se—
quence tags(基于表达序列标签的微卫星标记(EST-SSRs)研究
进展)[J]．J Plant Genet Res(植物遗传资源学报)5(1)：91—95
Powel W ，Machray GC，Provan J．1996．Polymorphism revealed
by simple sequence repeats[J]．Trends Plant Sci，1：215-222
Toth G，Gaspari Z，Jurka J．2000．Microsatellites in different
eukaryotic genomes：survey and analysis[J]．Genome Res，
10：967— 981
Varshney RK，Graner A，Sorrells ME．2005．Genic microsatel-
lite markers in plants：features and appIicati0ns[J]．Trends
Biotechnol，23：48— 55