全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：170— 173 2010年 3月
冰冻切片技术在海滨锦葵细胞学研究中的应用
李 贺，刘松梅，孙 艳，阮成江
(大连 民族学院 生物技术与资源利用国家民委教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)
摘 要：为解决普通石蜡切片观察植物样品繁琐与耗时长的问题，利用改进的蔗糖保护一液氮速冻切片法，
进行海滨锦葵不同器官细胞学研究。结果表明：(1)适合于海滨锦葵不同器官的最适蔗糖浓度不 同，适于含水
量较大的营养器官(根、茎和叶)的最适蔗糖浓度比含水量较小的花器官(柱头裂片、花柱、子房和花药)高。
(2)利用最适蔗糖浓度的蔗糖保护一液氮速冻切片方法，获得了完整而清晰 的海滨锦葵各器官组织细胞结构
的切片；海滨锦葵具有典型的双子叶草本植物营养器官的组织细胞结构特征，花柱为闭合型花柱，子房为多室
复子房。表明基于蔗糖保护～液氮速冻的冰冻切片技术在植物细胞学研究中具有广阔的应用前景。
关键词：冰冻切片技术 ；海滨锦葵 ；蔗糖保护一液氮速冻法
中图分类号：Q942．4 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)02—0170—04
Cryosectioning technique for cytological
studies in Kosteletzkya virginica
LI He，LIU Song-Mei，SUN Yan，RUAN Cheng—Jiang
(Key Laboratory of Biotechnology& Bio-Resources Utili~ation，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)
Abstract：To solve the fussy and long-time consuming problems in observing general parafin sections of plant speci—
mens，the method combining sucrose-protecting and liquid nitrogen frozen was used to study on cytology of different
organs of Kosteletzkya virginica．The results showed：(1)It is different for the diferent organs of K．virginica to op—
timal sucrose concentration．Optimal sucrose concentrations for more water content organs(root，stem and lear)are
higher than that of less water content organs(stigma lobe，style，ovary and anther)；(2)By the cryosectioning method
0f combining sucrose-protecting of optimal concentration with liquid nitrogen quick frozen．the integral and clear cryo—
sections were obtained，which could discriminate from organizational and celular structures of different organs in K．
virginica．This indicated K．virginica has typical structure characteristics of tissue cel of vegetative organs in dicoty—
ledonous herbaceous plants．Its style belongs tO solid style and ovary is multilocular ovaries．Cryosectioning technique
combining sucrose-protecting and liquid nitrogen quick frozen is useful for investigating plant cytology．
Key words：cryosectioning technique；Kosteletzkya virg inica；sucrose_pr0tecting and liquid nitrogen quick frozen
method
海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)为锦葵科海
滨锦葵属多年生草本植物，集油料、饲料、医药和观
赏价 值 于一 身 (阮成 江 等 ，2004，2005；郑 熙 等，
2007)，对其进行细胞学研究有重要理论价值与实践
意义。常规石蜡切片从取材固定到封片制成玻片标
本常需数 日(林月惠等 ，2001)，而冰冻切片可缩短常
规石蜡切片缓慢而复杂的处理过程，减少对样品组
织结构的损伤，更好地保存生物分子的活性(陈丹等，
2005)。本研究以海滨锦葵为材料，使用冰冻切片技
术研究其根、茎、叶以及花器官不同部位的组织细胞
收稿日期：2008-08-26 修回日期：2009—07—21
基金项 目：国家自然科学基金 (30500071)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(30500071)]
作者简介：李贺(1975一)，女，辽宁大连人，硕士，主要从事植物分子育种研究，(E—mail)lihe@dlnu．edu．cn。
通讯作者(Author for c0respondence，E—mail：ruan@dlnu．edu．cn)
2期 李贺等 ：冰冻切片技术在海滨锦葵细胞学研究 中的应用 171
结构，这不仅可为海滨锦葵发育生物学、组织免疫学、
分子生物学等方面的研究提供技术支持，而且可为冰
冻切片技术在植物学研究中的应用提供参考。
1 材料和方法
1．1材料
实验用海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)为种
植于大连民族学院温室内的一年生植株，研究材料
为其根、茎、叶、花药、柱头、柱头裂片、花柱和子房。
取材时期分别为：根、茎、叶取 自生长 3个月左右的
植株；花药采 自开花当天即将开裂的花粉囊；柱头、
柱头裂片、花柱、子房采 自开花当天未授粉花。
1．2最适蔗糖浓度选择
切取适 当大小 的新鲜 组 织投 入含 4％多聚 甲
醛、2．5 戊二醛、10 mmol／L磷酸缓冲液 (PBS，
pH7．2)的固定液中 ，经 2～3 h真 空处理后 ，于 4℃
下继续固定 5～6 h或过夜。样品经磷酸缓冲液浸
洗 2～3次后在由低到高(2 ～2O )的蔗糖一磷酸
缓冲液 中逐级渗透，每级浓 度的渗透时 间为 3O
rain。再分别取经每级浓度蔗糖溶液渗透的样品直
接用包埋剂包裹在样 品坨 上 ，置于一2O℃ 的切片机
中恒温切片(切片机型号 ：Leica CM 1100)，切片厚
度为 10 p-m。切片 自然晾干后在 Olympus BX51显
微镜下观察。通过比较切片效果选择适于不同器官
的最适蔗糖浓度 。
1．3冰冻切片
将切取的新鲜组织立即投入含最适蔗糖浓度的
的固定液中固定 (处理条件 同 1．2)，然后用 含有相
同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗 2～3次后直接包埋 ，
并迅速在液氮中冷冻约 20 S。经冷冻后的包埋块在
一 2O℃下 回温约 0．5 h后切 片 (切 片条件 同 1．2)。
切片 自然晾干后用 0．05 甲苯胺蓝染色或不染色 ，
Olympus BX5l显微镜下观察并摄影 。
2 结果与分析
2．1最适蔗糖浓度
不 同植物组织细胞结构不同 ，在冰冻切片过程
中选择最适蔗糖浓度至关重要。适合于海滨锦葵不
同器官的最适 蔗糖浓度各不相 同(表 1)，适 于含水
量较大的营养器官(根、茎和叶)的最适蔗糖浓度比
含水量较小的花器官(柱头裂片、花柱、子房和花药)
高。属于花器官的柱头处于花粉可授阶段，表面湿
润，适合柱头的最适蔗糖浓度与含水量较高的营养
器官相近。
表 1 海滨锦葵不同器官的最适蔗糖浓度
Table 1 Optimal sucrose concentration for
different organs of Kosteletzkya virginica
器官 Organ 最适蔗糖浓度 ( )
Optimal sucrose concentration
根 Root
茎 Stem
叶 Leaf
柱头 Stigma
柱头裂片 Stigma lobe
花柱 Style
子房 Ovary
花药 Anther
2．2营养器官的冰冻切片
蔗糖保护一液氮速冻法用于海滨锦葵营养器官
的冰冻切片获得了 良好 的切 片效果 ，组织细胞结构
完整而清晰(图版 I)。
海滨锦葵初生根(图版 I：1)的表皮由一层大小
相近 、排列 紧密 的细胞组 成，外 壁具一层厚的角质
层，向外有根毛衍生。皮层由 8～1O层形状不规则
的薄壁细胞组成。中柱由中柱鞘、初生木质部和初
生韧皮部组成(图版 工：2)。初生韧皮部与初生木质
部相间排列 ，其细胞排列形态呈放射状。
茎的初生结构 由表皮 、皮层和维管柱组成(图版
I：3，4)。表皮由大小相似、排列紧密、略呈方型的
一 层细胞组成，外壁覆有很薄的角质层。皮层分为
外皮层和皮层薄壁组织两部分。外皮层位于皮层最
外侧，由 1～2层较小细胞组成，其内侧为 3～4层类
圆形薄壁细胞组成的薄壁组织。维管柱由维管束、
髓射线和髓组成 。维管束为外韧 维管束 ，呈单轮环
状排列 ，由初生木质部、初生韧皮部和束中形成层组
成。髓射线是位于两个维管束之间连接皮层与髓的
薄壁细胞 ，由于初生维管组织排列成近似圆筒状 ，髓
射线有些难于辨认。髓区所 占比例较大，由排列疏
松的大型薄壁细胞组成，随着茎的发育，髓薄壁细胞
不断破毁，致使成熟茎的中央形成髓腔。
叶由表皮、叶肉和叶脉三部分组成(图版 I：5)。
表皮分上 、下表皮 ，各 由一层 大小不一 的细胞 组成 ，
覆有较薄的角质层；有气孔分布，属无规则型。叶肉
具栅栏组织和海绵组织之分 (图版 I：6)，二者 占叶
肉厚度比例约为 4：3。栅栏组织细胞呈长柱型，排
列较紧密，似栅栏状，细胞内含有大量叶绿体。海绵
加 8 0 0 0 ．_7．～ ～ ～ ～ ～ ～ ～6
172 广 西 植 物 3O卷
组织细胞呈不规则排列 ，较疏松 ，常形成一些气隙结
构，细胞内也存在叶绿体，但数量比栅栏组织少。叶
脉处叶片的上下面都有 明显 的凸 出。从横切面看 ，
叶脉由表皮 、基本组织 (厚角组织和薄壁组织)和中
央维管束组成。维管束为外韧维管束，木质部和韧
皮部之间有不发达的形成层 。
图版 I Ep：表皮 Pa：薄壁组织；xy：木质部；Ph：韧皮部；co：皮层；Vb：维管束；P：髓；Uep 上表皮；st；海绵组织i Pl：栅栏组织；s：
气孔；Lep：下表皮。1．海滨锦葵根横切片，×50；2．根中部横切片，×100；3．茎横切片，×1O0；4．茎横切片，X 200；5．叶片经过中脉部分
的横切片，×100；6．叶片横切片，×200。
Plate l Ep：Epidermis；Pa：Parenchyma tissue； ：Xylem；Ph：Phloem；Co：Cortex；Vb：Vascular bundie；P：Pith；Uep：Upper epidermis；Pt：Pali-
sade tissue；St：Spongytissue；S：Stoma；Lep：Lower epidermis．1．Transverse section of root ofKosteletzkyavirginica，×50；2．Transverse section of
centrepo rtion of root，×1O0；3．Transverse section of stem，×100；4．Partiallymagnifying section of stem from 3，×200；5．Traverse section ofleaf
past vein，X 100；6．Partially magnifying section of leaf from 5，×200．
上述结果表明，海滨锦葵具有典型的双子叶草
本植物营养器官的组织细胞结构特征。
2．3花器官的冰冻切片
蔗糖保护一液氮速冻法用于海滨锦葵花器官的
冰冻切片获得 了良好的切片效果 ，组织细胞结构完
整而清晰(图版 Ⅱ)。
海滨锦葵底部合生的五柱头裂片伸出单体雄蕊
管，形成特殊的柱头探 出式雌雄异位。柱头宽大的
表面被特化的腺质细胞一乳突覆盖(图版 Ⅱ：7-9)，
毛状乳突细胞下分布有排列紧密的数层腺质细胞。
与柱头相连的柱头裂片由表皮、皮层和引导组织构
成(图版 Ⅱ：10)。表皮 由排列紧密的厚壁细胞组成，
皮层由薄壁细胞组成，胞间隙较大，中心是腺质细胞
组成的引导组织 ，细胞排列紧密 。花柱(图版 Ⅱ：11，
12)为闭合型花柱，无中空花柱道，中央引导组织细
胞直径较小，细胞质浓厚，外周的皮层区由具分泌功
能的大型薄壁细胞组成。子房(图版 Ⅱ：l3)为五心
皮组成的多室复子房，每室 1胚珠，着生于中轴胎座
上。子房壁上分布有维管束。花药(图版 Ⅱ：14)中
部有药隔，两侧各有一个花粉囊，药隔内有维管束，
可见数量不等的圆形花粉粒。
3 讨论
冰冻切片技术具有操作简单、制片速度快并能
完整保存细胞 结构及生物大分 子活性 (如脂肪、酶
等)的特点，在动物和人体的研究中已被广泛应用
(Sathyanesan等，2002；Irina等，2003)，但仅在少数
植物器官和组织切片中应用(万恰震等，2001；An—
nie等，2002)。植物细胞具有细胞壁和大液泡，其细
胞含水量远大于相同体积的动物细胞，常规冰冻切
片法易形成冰晶损伤。快速冷冻是解决这一问题的
主要措施之一，而使用冷冻保护剂可以降低细胞内
溶 液 的 冰 点，减 小 形 成 冰 晶的 机会 (林 月惠 等，
2001)，冷冻保护和快速冰冻相结合的方法从理论上
讲能较好的保存植物样品的细胞结构，是未来植物
器官切片技术发展的趋势。
植物器官冰冻切片研究 中，一些学者采用甘油
2期 李贺等 ：冰冻切片技术在海滨锦葵细胞学研究 中的应用 173
作为冷冻保护剂(林月惠等，2001；刘剑峰等，2006)，
获得 了相对木质化、组织含水 量较小的植物器官的
清晰切片；另一些学者(陈丹等 ，2005)选用蔗糖作为
冷冻保护剂 ，也获得 了理想 的冰冻切片。甘油价格
较蔗糖昂贵，且不适用于各种植物组织器官(陈丹
等，2005)，但利用蔗糖作为冰冻保护剂时，最适蔗糖
浓度是影响切片效果的关键，蔗糖浓度过高，细胞易
收缩变形，蔗糖浓度过低则达不到冷冻保护的作用。
例如 ，陈丹等(2005)对烟草顶芽冰冻切 片的研究表
明 ，蔗糖浓度为 4O 时，虽然芽整体结构保持较完
整且分生组织不受影响，但分生组织周围的薄壁细
胞却有不同程度收缩；当蔗糖浓度为1O％ 时薄壁细
图版 Ⅱ Tt：引导组织；sp：表面乳突；Ep：表皮；Pa：薄壁组织；Co：皮层；Vb：维管束；Pg：花粉粒。7．海滨锦葵柱头纵切片，×100 8．柱头
纵切片，×200；9．柱头横切片，X100；10．柱头裂片横切片，×200；11．花柱横切片，×200；12．花柱横切片，×400；13．子房横切片，×50；
14．花药横 切片，×100。
Plate U Tt：Transmiting tissue；Sp：Surface papila；Ep：Epidermis；Pa：Parenchyma tissue；Co：Cortex；Vb：Vascular bundle；P窖：Polen grain．7．
A longitudinal section of stigma of Kosteletzkya virginica，×100；8．Enlargement of stigma，×200；9．A transverse section of stigma，X 100；10．A
transverse section of stigma lobe，×200；11．A transverse section of style，×200；12．A partially magnilying section of style from 5，×400；13．A
transverse section of ovary．×50；14．A transverse section of anther。× 100．
胞能保持原状，但芽的整体结构保持不完整。
本研究选择蔗糖作为冰冻保护剂 ，优选确定的
适于海滨锦葵花器官的最适蔗糖浓度 与陈丹等
(2005)对 4种植物花器官实验所得结果相近 。我们
对陈丹等(2005)建立的蔗糖保护一液氮速冻法进行
了一些改进 ，获得了组织细胞 结构完整且能保持原
状的植物器官切片。根据海滨锦葵的营养器官硬度
较大，延长了 1 h的真空处理和 2 h的固定时间，使
固定液更好地渗入组织细胞中，应用于花器官取得
了良好效果；根据实际情况将回温时间缩短为 0．s
h，避免了组织细胞的大量破损，获得了结构完整且
清晰的切片。本研究首次对多年生草本盐生植物海
滨锦葵营养器官的结构进行了详细分析，确定了闭
合花柱、引导组织等花部特征，为其授精机制提供了
细胞学方面的实验依据。
目前，冰冻切片技术在植物免疫组织化学、原位
杂交及酶定位等研 究 中 已被 广 泛应用 (Morin等 ，
1997；Gierth等，l999)。尤其在免疫组织化学染色
中，冰冻切片能较好地保存细胞的抗原性；冰冻切片
方法结合免疫荧光标记技术应用于植物微管骨架的
研究也取得了很好的效果(张新成等，2008)。本研
究表明，改进的蔗糖保护一液氮速冻法适合于植物
细胞学研究，而且此方法操作简单，实验周期短，对
植物冰冻切 片技术的推广具有重要意义 。
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(下转第 184页 Continue o12 page 184)
184 广 西 植 物 3O卷
3 讨论
对于腐生真菌，从子实体的组织分离获得分离
物，其分离物可靠性的验证最直接的方法是用该分
离物进行栽培出菇验证。但是对多数菌根真菌由于
其营养生理的特殊性，在纯人工条件下还无法进行
出菇验证，而形态学和细胞学鉴定结果可靠性较差，
因此用传统方法对菌根真菌分离物的鉴定就比较困
难。现代分子生物学的发展，特别是基因碱基序列
分析技术的应用，为菌根性真菌菌种的鉴定提供了
可靠、方便的技术手段(张志华等，2006)。而 ITS
序列分析因其保守性强，受环境因素影响较小(廖德
聪等，2005)更成为其 中的常用方法。刘春卉等
(2007)对金耳及其近似种的鉴定，熊涛等(2006)对
松乳菇的鉴定，王桂文等(2004)对红菇的鉴定，李海
波等(2007)对鹅膏菌的鉴定，所有这些都证明 ITS
序列已成为大型真菌菌种鉴定的重要工具。
我们通过 ITS序列 比较研究 证明获得 了真正
的松茸菌种，为后续的松茸菌丝体的营养生理特性，
松茸人工和半人工栽培试验，松茸菌丝体液体发酵
及代谢，原生质体单核化研究及交配型等遗传研究
提供了可靠的材料。
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