全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 212~220　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0508212
收稿 2014-11-14　　修定 2014-12-29
资助 国家“948”计划项目(2011-Z30)。
* 并列第一作者。
** 通讯作者(E-mail: guoyuqi@zzu.edu.cn; Tel: 0371-67767675)。
具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小
麦耐盐性的影响
韩坤*, 田曾元*, 刘珂, 张佳夜, 常银银, 郭予琦**
郑州大学生命科学学院, 郑州450001
摘要: 从盐生植物海滨锦葵块根中分离内生细菌43株, 经形态学特征和16S rDNA序列相结合的方法鉴定, 分属10个种属,
其中芽孢杆菌属是优势属, 其次是假单胞菌属和农杆菌属, 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni-
formis)是优势种。对海滨锦葵内生细菌ACC脱氨酶活性的测定显示, 其中5种菌明显具有ACC脱氨酶活性。用筛选到的5
种细菌接种盐胁迫下小麦根系并测定其对于小麦耐盐性的影响。结果表明, 蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus mega-
terium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌四种芽孢杆菌均能显著提高盐胁迫下小麦幼苗的干物质重和叶绿
素含量, 并能显著提高保护酶(SOD、POD、CAT)活性, 对盐胁迫的毒害有一定的缓解作用。绿针假单胞菌(Pseudomonas
chlororaphis)对小麦幼苗株高、根长、鲜重、干重、叶绿素含量和保护酶活性的提高也具有一定的作用。上述分析表明
从海滨锦葵块根中分离出的5株具有ACC脱氨酶活性的内生细菌均能提高小麦幼苗的耐盐性。
关键词: 内生菌; 海滨锦葵; 小麦; 盐胁迫; ACC脱氨酶
Effect of Endophytic Bacteria with ACC Deaminase Activity in Kosteletzkya
pentacarpos on Wheat Salt Tolerance
HAN Kun*, TIAN Zeng-Yuan*, LIU Ke, ZHANG Jia-Ye, CHANG Yin-Yin, GUO Yu-Qi**
School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
Abstract: 43 endophytic bacteria strains, isolated from roots of the halophyte Kosteletzkya pentacarpos, belong
to ten genus by 16S rDNA sequencing and the identification of morphological features. Among them, Bacillus
is the advantage genus, and then is Pseudomonas and Agrobacterium. Bacillus cereus and Bacillus licheniformis
are the advantage species. ACC deaminase activity of endophytic bacteria in Kosteletzkya pentacarpos has been
determined. Results revealed that five strains could produce obvious ACC deaminase activity. These five kinds
of bacteria were used to inoculate wheat roots under salt stress to determine their effects on the salt resistance
of wheat. Data showed that four strains, including Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus and
Bacillus licheniformis, could not only promote the wheat fresh weight, dry weigh and chlorophyll content under
salt stress, but also significantly raise enzyme activities of SOD, POD and CAT, showing elite alleviating capacity
to the salt toxicity. Additionally, Pseudomonas chlororaphis, to a certain extent, also showed the promotive
effects on wheat plant height, root length, fresh weight, dry weight and chlorophyll content. These suggested
that all the five endophytic bacteria isolated from Kosteletzkya pentacarpos with ACC deaminase can enhance
the salt resistance of wheat seedings.
Key words: endophyte; Kosteletzkya pentacarpos; wheat; salt stress; ACC deaminase
粮食紧缺和环境保护是全球性问题, 耕地面
积不足限制了粮食产量, 许多沿海滩涂由于含盐
量过高不适宜农作物的种植, 增强植物的耐盐性
是解决这一问题的关键途径之一。近年来的研究
表明 , 植物内生菌可以提高植物的逆境适应性
(Glick 2012), 益生菌菌肥的研发利用, 为这一问题
带来了希望(杨富等2014)。
植物内生菌是指存活于健康植物组织内部,
而不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物
类群, 主要包括真菌、细菌和放线菌(陈雪英等
2008)。内生菌多与植物形成互利共生的关系, 植
物为内生菌提供营养和适宜的生长环境, 内生菌
韩坤等: 具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小麦耐盐性的影响 213
则通过自身分泌物质或促进植物产生次生代谢产
物来增加植物的应激耐受性及促进宿主的生长(姚
领爱等2010), 这些有益内生菌被称为植物促生细
菌(plant growth promoting bacteria, PGPB), 其多存
在于土壤、根际、叶际(Glick 2005)。PGPB通常
有两种方式影响植物的代谢: (1) PGPB能够通过固
氮、溶磷并促进植物产生内源激素如生长素
(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)来提高抗
逆性, 包括干旱、盐胁迫、重金属毒害; 提高植物
保水能力, 促进侧根发育, 增强对氮、磷的吸收。
PGPB还能够调节植物体内离子浓度, 提高植物耐
盐性。近年来研究发现, 具有1-氨基环丙烷-1-羧
酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC)脱氨
酶活性的细菌可以协助植物抗逆, 促进逆境条件
下植物的生长。植物在逆境条件下会产生大量乙
烯, 会抑制植物生长、促进植物衰老。当植物受
到到逆境胁迫产生大量ACC时, ACC脱氨酶将乙
烯的合成前体ACC分解为α-酮丁酸和氨作为细菌
的碳氮源, 从而抑制乙烯的产生, 促进植物生长并
延缓植物衰老。(2)生物防治型PGPB (biocontrol-
PGPB)间接促进植物生长, 抑制有害病原微生物的
抑菌效果, 或通过改变宿主的代谢, 以增强其抵抗
病原菌感染的能力(李玫等2009)。
海滨锦葵是锦葵科锦葵属多年生宿根盐生植
物, 天然分布于美国东部沿海从特拉华州至得克
萨斯州的含盐沼泽地带(许爱华等2013), 1992年由
南京大学钦佩教授引进国内(郭予琦等2008)。海
滨锦葵最高耐盐浓度可达0.9%, 可在不适宜传统
作物生长的土地上生长, 对盐碱滩涂的利用有一
定意义(Vaughn等2013)。海滨锦葵的耐盐性可能
与其内生菌有一定关系, 本文分离了海滨锦葵根
部的内生细菌, 筛选具有ACC脱氨酶活性的细菌,
分析其对盐胁迫下小麦苗期的生长影响, 以鉴定
能促进植物生长的内生细菌, 旨在为菌肥研制提
供理论基础和技术保障。
材料和方法
1 试验材料
内生菌的分离材料取自由美国引进的中国大
陆种植的第一年生长的海滨锦葵[Kosteletzkya pen-
tacarpos (L.) Ledeb]块根。试验所用小麦(Triticum
aestivum L.)种子为‘豫观35’ (购于河南豫研种子科
技公司)。使用牛肉膏蛋白胨培养基分离内生细
菌, 细菌扩繁使用的是LB培养基。
2 试验方法
2.1 海滨锦葵内生细菌的分离
取新鲜海滨锦葵根, 用清水冲净, 无菌滤纸吸
去水分。无菌条件下去除根部表皮, 用70%乙醇清
洗1 min, 然后用5%次氯酸钠消毒2 min, 无菌水冲
洗数次去除残留。取最后一次无菌水涂布于牛肉
膏蛋白胨培养基上作为对照, 检测表面消毒是否
彻底。用手术刀将根切成5 mm见方小块, 每个牛
肉膏蛋白胨培养皿上均匀分布四小块。30 ℃恒温
培养2~3 d。对照组无任何菌落出现。将根块附近
细菌形态菌落接种至新的牛肉膏蛋白胨培养基
上。不断挑取不同形态菌落转移至新平板, 直至
所有平板菌落单一(杨清香等2010)。编号后, 斜面
培养基保存及甘油冻存管保存。根据《常见细菌
系统鉴定手册》, 从形态学上判断细菌分类情况
(东秀珠和蔡妙英2001)。
2.2 细菌DNA提取与鉴定
供试菌株接种于LB液体培养基中, 30 ℃ 150
r·min-1恒温振荡培养16~18 h, 菌液浑浊。每个菌株
取2 mL菌液于离心管中, 8 000×g离心1 min, 弃上
清, 收集菌体, 用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒
(生工生物工程有限公司)提取细菌基因组DNA。
采用细菌16S rDNA 通用引物27F (5′-AGAGTTT-
GATCCTGGCTCAG-3 ′ )和1492R (5 ′ -GGT-
TACCTTGTTACGACTT-3′) (Martin-Laurent等
2001)对提取的基因组DNA进行PCR扩增。50 µL
反应体系: 10×Buffer 5 µL, 2.5 mmol·L-1 dNTP 4
µL, Taq酶0.5 µL, 引物各1 µL, DNA模版2 µL, 用
ddH2O定容至50 µL。PCR反应程序: 94 ℃预变性2
min; 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 35个循环;
72 ℃延伸5 min。PCR产物用Goldview II型核酸染
色剂(北京索莱宝科技有限公司)染色, 2%琼脂糖凝
胶电泳检测。出现1 500 bp左右单一目的条带后,
将PCR产物送上海生工生物有限公司测序, 返回测
序结果在NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Blast.cgi)在线进行BLAST相似性比对, 确定分离
菌株的系统分类学地位。
2.3 具有ACC脱氨酶活性细菌的筛选
细菌ACC脱氨酶活性测定方法改进自Penrose
植物生理学报214
和Glick (2003), 所需试剂配制方法参照李郑义
(2011)。
(1)细菌菌体的制备和裂解。在10 mL离心管中
加入7.5 mL LB培养基和10 µL菌液, 30 ℃ 180 r·min-1
培养12~18 h。4 ℃ 8 000×g离心10 min, 去除上清
液。加入5 mL DF无氮培养基重新悬浮 , 4 ℃
8 000×g离心10 min, 去除上清液。加入7.5 mL DF-ACC
培养基, 重新悬浮后, 30 ℃ 180 r·min-1培养12 h。
4 ℃ 8 000×g离心10 min, 去除上清液, 加入5 mL 0.1
mol·L-1 pH 7.6的Tris-HCl重新悬浮沉淀, 4 ℃ 8 000×g
离心10 min, 去除上清液。重复上一重悬洗菌步骤,
离心后加入1 mL 0.1 mol·L-1 pH 7.6 Tris-HCl重新悬
浮在2 mL离心管中。16 000×g离心5 min加入600 µL
0.1 mol·L-1 pH 8.5 Tris-HCl将沉淀悬浮, 加入30 µL甲
苯, 高速振荡30 s。取出100 µL 4 ℃保存, 使用BCA
蛋白质定量试剂盒(AR0146, 武汉博士德生物工程
有限公司)测定菌液中蛋白含量。
(2) 2,4-二硝基苯肼比色法测定α-酮丁酸含
量。分别取2份加入甲苯震荡后的液体200 µL至
1.5 mL离心管, 一份加入20 µL 0.5 mol·L-1 ACC混
匀, 另外一份不加。30 ℃反应15 min, 加入1 mL
0.56 mol·L-1 HCl混匀, 16 000×g离心5 min, 均取800
µL上清加入2 mL离心管中 , 加入800 µL 0.56
mol·L-1 HCl 混匀。加入300 µL 2,4-二硝基苯肼反
应液30 ℃反应30 min, 加入2 mL 2 mol·L-1 NaOH混
匀, 使用美谱达UV-1800 (PC)紫外可见分光光度计
在540 nm处测量吸光度值(OD540)。加入ACC的计
为OD(α-酮丁酸+细菌提取物), 无ACC的计为OD细菌提取物。
(3) α-酮丁酸标准曲线绘制及ACC脱氨酶活性
计算。以0.1 mol·L-1 pH 8.5 Tris-HCl稀释0.1
mol·L-1 α-酮丁酸母液, 配制成0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5和3.0 mmol·L-1的α-酮丁酸标准样, 以0.1
mol·L-1 pH 8.5 Tris-HCl为空白对照, 分别取200 µL
加入2 mL离心管中。加入1.4 mL 0.56 mol·L-1 HCl
混匀, 加入300 µL 2,4-二硝基苯肼反应液反应30
min, 测量OD540。根据α-酮丁酸标准样OD值做出
标准曲线, 根据公式ODα-酮丁酸=OD(α-酮丁酸+细菌提取物) –
OD细菌提取物求出α-酮丁酸浓度。单位蛋白含量的
细菌菌体在单位时间内产生α-酮丁酸的量计为
ACC脱氨酶活性。
2.4 具有ACC脱氨酶活性的细菌对小麦的生长影响
培养容器采用直径为8 cm, 深度8 cm, 底部具
有直径1.2 cm圆孔的黑色塑料营养钵。光照强度
62.5 μmol·m-2·s-1, 光照16 h, 黑暗8 h。装入7 cm深,
事先121 ℃灭菌1 h的蛭石。每个营养钵中放入5粒
小麦种子, 覆盖蛭石1 cm, 待种子发芽后间苗使所
有营养钵内均有4株幼苗。将营养钵置于方形盘
内从底部加水使蛭石充分吸水, 后每2 d每钵浇灌
1/2Hoagland营养液20 mL。待小麦幼苗长至高度
15 cm, 进行细菌侵染试验。将各菌种按照1:1 000
的比例接种至LB培养基中, 30 ℃ 180 r·min-1培养
12~18 h, 至于50 mL离心管中4 ℃ 8 000×g离心10
min , 弃上清, 使用1/2Hoagland营养液重新悬浮
菌体, 以1/2Hoagland营养液为对照, 控制OD600在
1.0左右制成菌悬液。各菌分别设置对照组, 盐处
理组, 菌处理组, 菌盐处理组。菌处理组和菌盐处
理组每6 d使用菌悬液浇灌一次, 每钵20 mL。对
照组和菌处理组使用营养液浇灌, 每次每钵浇20
mL, 2 d一次; 盐处理组和菌盐处理组交替使用
1/2Hoagland营养液和含170 mmol·L-1 NaCl的
1/2Hoagland营养液浇灌 , 2 d一次(Nautiyal等
2013)。
待接种细菌处理15 d左右, 测量植株生理数
据。清水冲洗根部, 取出完整植株, 分别测量植株
的株高、根长, 滤纸吸取表面水分后测量植株鲜
重, 105 ℃ 20 min后80 ℃烘至恒重, 测量植株干
重。叶绿素含量测定参照岳彩鹏和黄进勇(2007),
植物保护酶(SOD、POD、CAT)活性测定参照张
蜀秋(2011)。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT
光氧化还原法测定; 过氧化氢酶(CAT)活性采用紫
外吸收法测定, 以每分钟OD240减少0.01为一个酶
活力单位; 过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法
测定, 以每分钟OD470增加0.01为一个酶活力单位。
3 数据处理
每处理设3个重复(n=3), 所有试验数据用
SPSS 19.0软件进行分析, 用Excel对试验数据进行
统计运算, 采用单因素方差分析(one-way ANOVA)
和最小显著极差法(LSD)进行不同数据间的多重
比较分析。
韩坤等: 具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小麦耐盐性的影响 215
实验结果
1 海滨锦葵块根内生细菌多样性
16S rDNA是细菌鉴定常用的方法, 16S rDNA
全长约1.5 kb。以分离的细菌DNA为模版扩增16S
rDNA基因, 得到的条带位于1 000至2 000 bp之间
(图1), 符合16S rDNA片段大小。测序结果与NCBI
网站16S ribosomal RNA sequences数据库进行比
对, 匹配结果见表1。测序比对过程中有3条序列
无法正确匹配合适的菌株, 因此标记为未鉴定成功。
(Agrobacterium tumefaciens)。其中大部分是芽孢
杆菌属, 其次是假单胞菌属和节杆菌属, 因此芽孢
杆菌属是海滨锦葵根部内生菌的优势种(图2)。
Bacillus cereus和Bacillus licheniformis在6% NaCl
浓度时OD600可达1.16和0.60, 具有很高的耐盐性,
这和甜土植物中分离的内生菌具有很大不同(Liu
等2012)。这可能与海滨锦葵长期生活在美国沿海
滩涂, 植物本身耐盐性较强有关, 因此其内生细菌
也具有较强的耐盐性。
表1 海滨锦葵中分离的内生细菌鉴定结果
Table 1 Identification results of endophytic bacteria from K. pentacarpos
菌株编号 鉴定结果 16S rDNA 基因鉴定 基因库登录号 序列长度/bp
Kp84 Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis strain DSM 13 NR_118996 1 545
Kp72 Bacillus pumilus Bacillus pumilus strain NBRC 12092 NR_112637 1 474
Kp5 Bacillus megaterium Bacillus megaterium strain NBRC 15308 NR_112636 1 477
Kp120 Bacillus cereus Bacillus cereus strain CCM 2010 NR_115714 1 535
Kp36 Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas chlororaphis strain NBRC 3904 NR_113581 1 462
Kp79 Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens strain IAM 12048 NR_041396 1 457
Kp69 Paenibacillus sp. Paenibacillus sp. HA48 KF011632 1 487
Kp50 Arthrobacter crystallopoietes Arthrobacter crystallopoietes strain R26 JN700085 1 407
Kp16 Pseudomonas mandelii Pseudomonas mandelii strain NBRC 103147 NR_114216 1 464
Kp89 Bacillus subtilis Bacillus subtilis strain DSM 10 NR_027552 1 517
鉴定为同种细菌的菌株, 选取其中一个编号作为代表。
图1 海滨锦葵块根内生细菌16S rDNA PCR产物电泳图
Fig.1 Endophytic bacteria of K. pentacarpos 16S rDNA PCR
electrophoretogram
图2 海滨锦葵内生细菌分离的多样性
Fig.2 Diversity of isolated endophytic bacteria
form K. pentacarpos
鉴定结果表明, 43株细菌分属于10个种属, 9
株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus), 8株为地衣芽
孢杆菌(Bacillus licheniformis), 6株为枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis), 各有4株为巨大芽孢杆菌(Bacillus
megaterium)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus), 3株
类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)菌株, 2株成晶节
杆菌(Arthrobacter crystallopoietes), 2株孟氏假单胞
菌(Pseudomonas mandelii)和1株绿针假单孢菌
(Pseudomonas chlororaphis)和1株根癌农杆菌
2 从海滨锦葵块根中分离的内生细菌ACC脱氨酶
活性
植物在逆境条件下会产生乙烯, 高浓度的乙
烯抑制植物生长, ACC脱氨酶可以通过降解乙烯合
成前体ACC来降低乙烯含量 , 从而促进植物生
长。在鉴定出的不同种属细菌中选取一个菌株测
量其ACC脱氨酶活性。结果显示Bacillus cereus具
有最高的ACC脱氨酶活性为12.36 mol·mg-1·h-1。
植物生理学报216
其余依次是Bacillus licheniformis、Bacillus pumilus、
Bacillus megaterium、Pseudomonas chlororaphis,
分别为9.27、6.60、2.45和1.02 mol·mg-1·h-1 (表2),
其余菌株未表现出ACC脱氨酶活性或者痕量未
检出。
3 具有ACC脱氨酶活性的细菌对小麦生长有明显
促进作用
接种细菌与加盐处理15 d后测量小麦株高(图
3)。在没有盐胁迫的条件下, 对照组小麦株高均
值为27.53 cm, Kp120和Kp5菌株处理的小麦株高
表2 海滨锦葵内生细菌ACC脱氨酶活性
Table 2 Endophytic bacteria ACC deaminase activity isolated from K. pentacarpos
菌株编号 菌株名称 革兰氏反应 ACC脱氨酶活性/mol·mg-1·h-1
Kp79 Agrobacterium tumefaciens - —
Kp50 Arthrobacter crystallopoietes + —
Kp120 Bacillus cereus + 12.36
Kp84 Bacillus licheniformis + 9.27
Kp5 Bacillus megaterium + 2.45
Kp72 Bacillus pumilus + 6.60
Kp69 Paenibacillus sp. +&- —
Kp36 Pseudomonas chlororaphis - 1.02
Kp16 Pseudomonas mandelii - —
Kp89 Bacillus subtilis + —
　　“ +”和“-”分别表示革兰氏反应阳性和阴性; 未检出ACC脱氨酶活性的细菌标注为“—”。
分别为31.2和30.9 cm, 相比对照分别提高了13.4%
和12.2%, 差异显著。在170 mmol·L-1 NaCl处理小
麦15 d后 , 测量盐对照组株高均值为24.9 cm,
Kp120、Kp84和Kp72菌株在盐胁迫中使小麦株高
恢复至无盐对照水平分别达到28.3、28.2和27.7
cm, 其中Kp84 和Kp120和盐对照组相比显著, 分别
提高了13.6%和13.2%。Kp5菌株在无盐环境中效
果显著 , 盐胁迫下未恢复至对照水平。Kp36和
Kp72菌株在无盐和有盐环境中均提高了植株高
度, 盐胁迫下未恢复至对照水平。
选取6株各处理的小麦幼苗, 洗净根部蛭石后,
舒展根部放置同一水平线上成像。从图4中可看
出Kp120处理组根株高和根长均较对照组有明显
提高, 且Kp120处理组小麦叶片更加厚重、须根更
加浓密。Kp120盐处理组小麦株高也明显高于盐
处理组, 根长也较盐处理组有一定提高。
接种细菌与加盐处理15 d后测量小麦根长(图
5)。对照组和盐对照组小麦根长分别为11.3和9.6
cm, Kp120和Kp72 在无盐处理时根长达到14.1和
13.9 cm, 与对照相比增加显著, 分别增加24.0%和
22.8%。Kp120处理组在盐胁迫条件下小麦根长达
到13.3 cm, 与盐对照组相比根长增长显著, 增加了
37.2%。170 mmol·L-1 NaCl盐处理时, 接种Kp120
菌株的小麦根长达13.3 cm, 相比无盐处理的对照
组增长显著。
接种细菌与加盐处理15 d后测量小麦鲜重与
干重(图6)。在没有盐胁迫的条件下, 对照组鲜重
图3 五种菌处理对小麦盐胁迫下株高的影响
Fig.3 Effects of five bacteria treatments on plant height of
wheat under salt stress
不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著; 编号Kp120代表蜡
样芽孢杆菌、Kp5代表巨大芽孢杆菌, Kp72代表短小芽孢杆菌, Kp84
代表地衣芽孢杆菌, Kp36代表绿针假单孢菌。图4~6同此。
韩坤等: 具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小麦耐盐性的影响 217
(图6-A)为0.68 g, 5种菌处理小麦幼苗与对照相比
均提高了小麦鲜重, 其中Kp120、Kp5、Kp72和
Kp84处理组小麦鲜重分别为0.90、0.80、0.82和
0.80 g, 与对照组相比增长显著, 与对照相比分别增
长了32.5%、17.4%、21.2%和17.4%。在170
mmol·L-1 NaCl处理条件下, 盐对照组小麦鲜重为
0.46 g, Kp120、Kp5、Kp72和Kp84组处理小麦的
鲜重分别为0.71、0.61、0.65和0.68 g, 与对照相比
分别提高了54.3%、32.6%、41.3%和47.8%, 增长
显著。
在没有盐胁迫条件下对照组小麦干重(图6-B)
均值为0.0744 g, Kp120、Kp5、Kp72、Kp84与对
图4 Kp120接种及盐胁迫处理的小麦生长
Fig.4 Inoculation of Kp120 and salt stress treatment
of wheat growth
图6 五种菌处理对小麦盐胁迫下鲜重和干重的影响
Fig.6 Effects of five bacteria treatments on fresh and dry weight of wheat under salt stress
图5 五种菌处理对盐胁迫下小麦根长的影响
Fig.5 Effects of five bacteria treatments on root length of
wheat under salt stress
照相比均显著 , 分别0.1212、0.088、0.1006和
0.0966 g, 与对照相比分别增加62.9%、18.2%、
35.2%和29.9%。在盐处理条件下对照组小麦干重
均值为0.0542 g, Kp120、Kp72、Kp84与盐处理对
照组相比均增加显著, 分别为0.0797、0.0789和
0.0698 g, 分别增加了47%、45.6%和28.9%。其中
Kp120、Kp72菌株在盐处理条件下使小麦干重恢
复到了无盐对照水平。
接种细菌与加盐处理15 d后测量小麦叶片叶
绿素含量(图7)。各组处理小麦叶片叶绿素含量在
无盐条件下相比于盐胁迫时均有显著提高。在无
植物生理学报218
保护酶活性(表3), Kp120、Kp5、Kp84在无盐和有
盐条件下, 与对照相比均显著提高了SOD活性, 在
无盐条件下分别提高了10.1%、9.4%和4.8%, 在有
盐条件下分别提高了25.2%、20.0%和28.2%。
Kp120和Kp5在在无盐和有盐条件下, 与对照相比
均显著提高了POD活性, 在无盐条件下分别提高
了20.6%和33.1%, 在有盐条件下分别提高了42.9%
和36.0%。Kp120、Kp5、Kp84在无盐和有盐条件
下, 与对照相比均显著提高了CAT活性, 在无盐条
件下分别提高了37.2%、43.6%和19.5%, 在有盐条
件下分别提高了75.2%、82.6%和23.1%。
总之, 具有ACC脱氨酶活性的5种内生细菌,
在没有盐胁迫条件及170 mmol·L-1 NaCl胁迫条件
下均能不同程度促进小麦的株高、根长、干重、
鲜重、保护酶(SOD、POD、CAT)活性, 以干重、
鲜重、叶绿素含量及保护酶活性的促进效果尤为
明显。蜡样芽孢杆菌Kp120和地衣芽孢杆菌Kp84
具有较高的ACC脱氨酶活性, 并同时能明显促进
小麦苗期营养生长各生理指标及抗逆相关的保护
酶活性, 因此可推断具有ACC脱氨酶活性的内生
细菌是通过促进植物的营养生长及抗逆保护酶活
性来促进植物生长提高植物耐盐性的。
讨　　论
从海滨锦葵根部共分离出内生细菌43株, 鉴
定结果显示分属于5个属, 其中芽孢杆菌属是优势
属, 蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是优势种。芽
孢杆菌属具有较高的耐盐性, 可能与海滨锦葵的
表3 五种菌处理对小麦盐胁迫下叶片保护酶活性的影响
Table 3 Effects of five bacteria treatments on wheat leaf protective enzyme activity under salt stress
　 处理　 SOD/U·g-1 POD/U·g-1·min-1 CAT/U·g-1·min-1
无盐 CK 228.47±3.39c 223.54±21.17c 249.60±17.64c
Kp120 250.17±6.33ab 269.78±13.67ab 342.47±20.54a
Kp5 251.74±2.09a 297.60±27.22a 358.68±25.35a
Kp72 202.02±9.69e 238.13±27.25bc 268.71±10.74bc
Kp84 239.45±4.23bc 262.38±22.40bc 298.35±18.47b
Kp36 215.25±8.27d 230.86±22.24bc 272.64±17.68bc
盐胁迫 CK+NaCl 162.50±6.74b 156.46±26.14b 158.66±16.57c
Kp120+NaCl 203.51±8.49a 223.61±33.05a 278.06±22.17a
Kp5+NaCl 195.13±10.77a 212.88±11.76a 289.71±23.08a
Kp72+NaCl 142.20±8.09c 170.08±16.06b 186.06±13.90bc
Kp84+NaCl 192.24±4.06a 159.06±13.57b 195.23±14.59b
Kp36+NaCl 151.30±9.19bc 167.83±7.59b 187.27±15.12bc
　　不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
图7 五种菌处理对小麦盐胁迫下叶片叶绿素含量的影响
Fig.7 Effects of five bacteria treatment on wheat leaf chloro-
phyll content under salt stress
盐时对照组小麦叶片叶绿素含量为1.98 mg·g-1,
170 mmol·L-1 NaCl处理时叶片叶绿素含量为1.45
mg·g-1。Kp120、Kp5、Kp72、Kp84各组处理在有
盐和无盐条件下分别与对照组相比叶绿素含量增
加均显著, Kp120、Kp5、Kp72和Kp84在没有盐胁
迫处理时叶片叶绿素浓度为2.48、2.56、2.28和
2.35 mg·g-1, 在无盐条件下相比对照增加25.1%、
29.2%、15.1%和18.7%, 在盐胁迫条件下叶片叶绿
素浓度分别为1.98、2.03、1.73和1.79 mg·g-1, 与盐
对照相比增加36.2%、39.8%、19.3%和23.4%。
Kp36在两种条件下则增加不显著。
接种细菌与加盐处理15 d后测量小麦叶片各
韩坤等: 具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小麦耐盐性的影响 219
盐生特性相关。已鉴定的菌种中50%具有不同程
度的ACC脱氨酶活性, 蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢
杆菌分别达到了12.36和9.27 mol·mg-1·h-1。将各菌
株接种海滨锦葵幼苗根部, 也发现对海滨锦葵幼
苗的营养生长和保护酶活性有一定的促进作用(结
果略), 因此接种于小麦幼苗加以验证。Kp120在
170 mmol·L-1 NaCl和无盐条件下, 均显著提高了小
麦的株高、根长、干重、鲜重及叶绿素含量。
Kp5、Kp72、Kp84和Kp36处理幼苗后也不同程度
的提高了小麦各生理数据 , 其中Kp36作用程度
最低。
ACC脱氨酶阳性菌可以促进豌豆生长, 并可
开发混合菌剂制作合成肥料, 减少对化肥的依赖
(Ahmad等2013)。内生菌不仅可以通过ACC脱氨
酶、分泌IAA等方式直接促进植物生长, 还可以保
护植物免受干旱、涝渍、盐以及金属和有机污染,
还有真菌病原体的入侵(Glick 2013)。不仅细菌还
有某些真菌如丛枝菌根真菌可以提高植物在温
度、水分、重金属和盐胁迫等方面的抗逆性(孙吉
庆等2012)。植物促生细菌还能提高不同盐浓度下
番茄的鲜重、干重和叶绿素含量, 并且有更多的
花和花蕾。应用含有ACC脱氨酶活性的PGPB可
以改善大多数陆地作物的盐害(Ali等2014)。从黑
麦草(Lolium perenne)中分离的29株内生细菌, 大多
数属于假单胞菌属, 大部分能促进植物生长和碳
氢化合物的降解, 对所有菌株进行测试均能产生
吲哚乙酸, 有10株发现具有ACC脱氨酶基因(Kukla
等2014)。有研究曾用枯草芽孢杆菌GB03浸种紫
花苜蓿种子, 发现其能在盐胁迫下促进紫花苜蓿
的株高、根长和生物量(韩庆庆等2014)。
在盐胁迫处理时, 植物叶片中的可溶蛋白含
量明显下降, 降低的程度随着胁迫加重而加剧, 接
种具有ACC脱氨酶活性的细菌, 提高了可溶蛋白
的含量, 使植物合成保护酶的速率加快, 增强了植
物抗逆能力。ACC脱氨酶通过减缓可溶蛋白降解,
使可溶性蛋白维持在较高水平, 并对细胞渗透势
调节有一定作用(任改弟2010)。与本文中具有
ACC脱氨酶活性的细菌提高了植物保护酶(SOD、
POD、CAT)活性相印证。将小麦生长指标的提高
与ACC脱氨酶活性比较可得, ACC脱氨酶活性与
促进小麦生长的程度有一定的相关性。已测定的
无ACC脱氨酶活性的内生菌是否也能促进植物生
长, 以何种方式促进, 还有待研究。
不同菌株对于同种植物、或同一菌株对不同
种植物而言, 其促生作用的机制可能是不同的, 对
植物产生的作用程度也有所差异, 本文发现具有
ACC脱氨酶活性的菌株能提高小麦的营养生长及
盐胁迫下保护酶活性, ACC脱氨酶活性与逆境下植
物保护酶活性增加的机理有待进一步探索。同时,
ACC脱氨酶活性菌株吸附在植物根系, 有助于促
进植物体内激素IAA的产生。通过增加根的长度,
促进了根系的发育, 加强了植物对养分的吸收利
用。从分子水平上检测植物生长过程中关键酶相
关基因表达情况, 才能更深入的探索ACC脱氨酶
活性菌株对于植株激素IAA产生的信号传导与应
答机理。
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