全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(5)：608— 612 2010年 9月
中国一越南柑桔黄龙病病原 16S rDNA
片段的序列分析
邓崇岭 ，陈传武l，赵小龙2，陈国平H ，邓光宙1，王明召1
(1．广西壮族自治区柑桔研究所，广西 桂林 541004；2．广西壮族 自治区农业厅，南宁 530022)
摘 要：采集广西、广东和越南的 8个柑桔黄龙病样品，利用黄龙病 的特异引物 OI1／OI2c对其 16S rDNA片
段进行PCR扩增，将其扩增产物纯化、回收，进行序列测定。利用DNAstar软件、clustalw2软件和MEGA4．0
软件进行同源性分析与系统发育分析。结果表明，越南黄龙病株系(Vietnam一0901和 Vietnam-0905)与除广
西样品 GX-1001和广东样品 GD-1002外所有亚洲种柑桔黄龙病病原的同源性都很高(97．6 ～100．0 )，而
与非洲种、美洲种和土豆斑马条纹病的同源性相对较低(分别为 96．o ／97．7 ，94．7％／96．4 和 96．2 ／
97，6 )。表明我国广东、广西和越南发生的HLB病原均属亚洲种，但在亚洲种之间不同地区的黄龙病病原
也发生了一定变异，广西样品GX一1001和广东样品GI~1OO2与其它亚洲种柑桔黄龙病病原的同源性较其它
亚洲种株系偏低，但聚类还是归在一个类群，表明相同地域内的黄龙病病原菌还存在一定差异。
关键词：中国；越南 ；柑桔黄龙病 ；16S rDNA；同源性 ；序列分析
中图分类号 ：Q789 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2010)05—0608—05
Sequence analysis of 1 6S rDNA of Huanglongbing
agents collected from China and Vietnam LIn
DENG Chong-Ling ，CHEN Chuan-Wu ，ZHAO Xiao—Long2，
CHEN Guo-Ping ，DENG Guang-Zhou ，WANG Ming-Zhao1
(1．Guangxi G￡r Research Institute，Guilin 541004，C~na；2．Department of Agriculture of GuangM，Nanning 530022，China)
Abstract：In this study，eight samples of Huanglongbing(HLB)trees were collected from Guangdong，Guangxi and
Vietnam．The HLB agent specific primer sets，OI1／OI2c was used tO amplify DNA from the loci of 16S rDNA．PCR
products were colected，purified，and sequenced．The sequences were compared to all published DNA sequences in
GenBank through BLAST(http：l{ww ncbi．nlm nih gov)for phylogenetic analyses The cluster analyses were
performed by MEGA software．It was concluded that eight of 1 6S rDNA sequences from different areas were phyl0一
genticaly most closely related to those of the published HLB agents．The similarities between the Vietnam samples
sequences Vietnam-0901和 Vietnam-0905 to that of Candida￡ s Liberibacter asiaticus(except GX-1001 and GD-
1002)were more hi gher(97．6 ～100．0 )，to that of Ca．L africanus were 96．O ／97．7 ，tO that of Ca．L．ameri—
canus were 94．7 ／96．4 ，and to that of Potato Zebra Chip were 96．2％／97．6％．The results indicated that the
HLB agents colected from Vietnam were Ca．L．asiaticus．But there are still some differences between these Las
samples．
Key words：China；Vietnam；Huanglongbing；16S rDNA；Sequence analysis
收稿日期：2010-05—28 修回日期：2Ol0—09—29
基金项目：科技部国际科技合作项目(2008DFA30900)；广西国际科技合作与交流项目(桂科合 0895001—3—3)；广西自然科学基金(桂科自0832187)i
广西农业重点科技计划项目(NK200827)[Supported by the International Cooperation Program of China(2008DFA30900)：International Sdentific Coopera-
tion and Exchange Program of Guangxi(0895001—3—3)；the Natural Science Foundation of Guangxi(0832187)fAgricu]tura}Science P1annjng Project of
Guangxi(NK200827)]
作者简介；邓崇岭(1962-)，男，F-ig~：NA ，副研究员，从事柑桔品种选育、无病毒苗木繁育和黄龙病防治等研究 ，(E-mail)eldeng88168@126．com。
通讯作者(Author for corespondence，E—mail：egp888888@126．com)
5期 邓崇岭等：中国一越南柑桔黄龙病病原 16S rDNA片段的序列分析比较 609
柑桔黄龙病 (Huanglon ing，HLB)是一种在
柑桔生产上危害极其严重的病害 。该病病原菌为韧
皮部杆菌(Candidatus Liberibacter)，属于难培养细
菌。迄今 ，该病原菌 已发现 3个种 ：即亚洲种 (Ca．
L．asiaticus，Las)、美洲种 (Ca．L．americanus，Lain)
和非洲种 (Ca．L．africanus，Laf)(Garnier等，2000；
Coletta—filho等 ，2005)，目前在 亚洲报 道．的黄龙 病
病原菌均为亚洲种 。近来也有报道称巴西发现有些
黄龙病症状与植原体 (Phytoplasma)相关 (Teixeira
等，2008；Chen等，2009)。亚洲种全基 因组 DNA
序列已成功获得(Duan等，2O09)，为进一步的研究
提供了有利的条件。Hansen等(2008)发现土豆斑
马条纹病(Potato Zebra Chip)的病原菌为(Ca．L．
psylaurous，Lps)，且该病原菌较美洲种与非洲种和
亚洲种相比有更高的同源性。
长期 以来 ，HLB在亚洲地 区发生严重 ，造成 了
巨大的经济损失，严重威胁着亚洲地区的柑桔产业。
越南与广西接壤，两地各柑桔产区都有柑桔黄龙病
发生。近年来广西加大了对黄龙病的防控力度，使
黄龙病发生率由2006年的3．9 下降到2009年的不
足 l 。越南从南到北都有柑桔黄龙病发生，而且较
为严重，据 2006年调查 ，越南各地 区柑桔黄龙病发生
率为 0．6 ～56．3 ，其中，与广西交界的东北区柑桔
黄龙病发生率为 11．8 。目前 ，越南在柑桔生产上也
存在一些薄弱环节，首先对柑桔黄龙病的认识不足，
包括一些大型农场的干部和相关研究单位技术人员
都不能辨认柑桔黄龙病及其危害症状；其次在茎尖微
芽嫁接脱毒及元病毒苗木繁育方面基础较为薄弱，柑
桔无病毒苗木在生产上应用推广所占比例很低。由
于柑桔黄龙病具有苗木(接穗)远距离传播及木虱传
播的特征，因此联防联控，控制两地间苗木运输，加
强检疫和木虱监控就显得格外重要。
近年来，16S rDNA序列分析已广泛用于黄龙
病的系统发育、分类和鉴定(冯震等，2006；廖晓兰
等，2004；单振菊等，2008；Jagoueix等，1996)。越南
与中国气候条件及地形均有一定差异，两国间柑桔
黄龙病病原是否完全相同，迄今尚未见报道，本研究
采用 PCR技术对采自中国广东、广西以及越南的柑
桔黄龙病 16S rDNA进行测序分析，利用 DNAstar
软件、clustalw2软件和 MEGA4．0软件对相关序列
进行同源性分析和系统发育分析。以期为中越两国
柑桔黄龙病病原的分子进化研究提供证据，并对两
表 1 用于黄龙病病原菌 16S rDNA分析的来 自不同地区、表现不 同症状的黄龙病材料
Table 1 Plant materials with different symptoms collected from different areas for 1 6S rDNA analysis of HLB Pathogen
国黄龙病的综合防控提供借鉴。
1 材料和方法
1．1材料
黄龙病病原样品采自广西、广东以及越南河内、
兴安、永隆省等地疑似黄龙病的8个柑桔样品(表 1)。
1．2总核酸的提取及 PCR扩增
取待检测样品的叶脉组织，用液氮磨碎后用改
进的CTAB法提取 DNA(Lin等，2008)。
用于 PCR扩增 的引物 由上海生工生物工程技
术有限公司合成(表 2)。以总 DNA为模板，采用
2O L反应体系 ，进行 PCR扩增 。其中含 1O×PCR
Buffer 2 L，2．5 mmol／L dNTP 2 L，5 L Taq酶
0．1 L，25 mmol／L MgC1z 1．2 L，10 mM 的引物
各 1 L。PCR反应条件为：94℃变性 5 min后，35
个循环(94℃变性 30 S，65℃／61℃退火 45 S，72℃
延伸 l rain)，最后 72℃再延伸 10 min(Jagoueix
等 ，1994；Lin等 ，2010)。每个反应重复 2次 ，最后
进行电泳检测，在凝胶成像系统下观察记录结果。
1．3柑桔黄龙病病原 16S rDNA基因的测序及分析
采用 Promega公司的胶回收试剂盒，对柑桔黄
龙病病原 16S rDNA的PCR产物进行纯化、回收，
由上海生工生物工程有限公司进行测序 ，所用测序
610 广 西 植 物 3O卷
表 2 用于 HLB检测及其病原菌 16S rDNA扩增的引物序列
．
Table 2 Primer sequences used for detection of HLB and amplification of 1 6S rDNA of the pathogen of HLB
图 1 不同来源 HLB样品 PCR扩增结果
Fig．1 Amplification result of PCR on HLB
samples from different areas
M．100bp Marker；1．阳性对照；2．阴性对照；
3-4．广西样品；5-7．广东样品；8-10．越南样品。
470 bp
仪器为 ABI—PRISM3730，测序试剂为BigDyeterrni—
nator v3．1。将测序结果在 GenBank上分析比对，
并通过DNAstar软件进行同源性分析，利用 clust—
alw2软件及 MEGA4．0软件进行系统发育分析。
2 结果与分析
2．1越南柑桔黄龙病的检测情况
用Las-O-F／Las-()_R引物对对来 自广西、广东
和越南采集的8个样品进行PCR检测，8个样品均扩
增得到了大小为 470 bp的特异 目的DNA片段(图
1)。所检测材料均为典型的斑驳及黄化症状样品。
2．2 PCR产物的测序和分析
用 OI1／OI2c引物对来 自广西、广东和越南的柑
桔黄龙病样品PCR扩增得到特异目的片段 1 160 bp，
将得到的PCR产物进行纯化、回收、序列测定(图2)。
利用 DNAstar软件将本研究所得到的越南及中
国广西、广东两省的柑桔黄龙病病原 16S rDNA的序
列与基因库中的亚洲种印度株系 L22532、亚洲种广
西株系 EU921616、重庆株系 DQ4320O4、福建株系
DQ431998、广 东 株 系 DQ4320o5、台 湾 株 系
DQ302750、湖 南 株 系 DO432002、贵 州 株 系
DQ157275、非洲种 L22533、美洲种 AY742824、土豆斑
马条纹病 GQ468843以及根瘤农杆菌 AB289608和根
瘤菌 HM768206进行同源性分析(表 3)。
1160bp
图 2 不同来源 HLB病原菌 16S rDNA扩增后纯化结果
Fig．2 Purified results of 1 6S rDNA of HLB
pathogen from different areas
M．DL2000 Marker；1-2．广西样品}
3-5．广东样品；6-8．越南样品。
由表 3可见，越南黄龙病株系(Vietnam-0901和
Vietnam-0905)与除了广西样品 GX-10Ol和广东样品
GD-1002外所有亚洲种柑桔黄龙病病原的同源性都
很高(97．6 ～1oo．oH)，而与非洲种、美洲种和土豆
斑马条纹病的同源性相对较低(分别为 96．oH／
97．7％，94．7 9／6／96．4 和 96．2 ／97．6 )。
2．3越南柑桔黄龙病病原与其它相关病原的系统发
育关系
利用 MEGA4．0软件进一步构建系统发育树
分析显示(图 3，图4)，用距离法(NJ)与最小进化法
(ME)构建的不 同 HLB株系 16S rDNA序列系统发
育树基本一致 ：越南 HLB病原菌株系与 HLB亚洲种
中国各株系病原菌遗传距离较近，印度株系稍远，非
洲种与土豆斑马条纹病病原菌次之，与美洲种最远。
由此可明确，在越南发生的 HLB病原属亚洲种。
广西样品 Gx_1001和广东样品 GD-1002与其
它亚洲种柑桔黄龙病病原的同源性较其它亚洲种株
系偏低，但聚类还是归在一个类群，表明相同地域内
的黄龙病病原菌还是存在着一定差异。
3 讨论
原核生物细胞中的 16S rDNA的碱基序列是十
5期 邓崇岭等：中国一越南柑桔黄龙病病原 16S rDNA片段的序列分析比较 611
表 3 不 同来源 的 16S rDNA的 同源性 比对 ( )
Table 3 The identical ratio of 1 6S rDNA gene sequences among 8 samples
1 2 3 4 5 6 7 l 叠 10 11 t2 3 t4 15 16 11 t矗 lg
_ 弧 9 2 9 O 9s 95 91 8 髓 4 9’7 91 5 g1 6 91 5 8B5 蚰4 965 坼e 拍2 791 785 1 GX-I~I sell
2 S2 _ 鹎_2 1ooO 蛔 1oo0 998 99 7 99曹 997 g孽7 99 7 ∞ 0 9口2 97 e 977 96．4 8B7 髓8 2 GX-I~2 ‘
3 O．e 49 _ 蛞2 钙 蝤3 921 7 g21 91 8 91 9 91 8 898 8g6 967 艇 1 87 3 8O3 796 3 GOd002seq
4 52 O_o 49 蚰2 ’oo_。 钧-8 ∞ 7 鹳 g 99 9孰B 997 。 O 驰2 97与 977 96_| 鸭 明了 ● GO-1∞3
S 5．1 ’g 51 1 0 —■ ∞_2 蚰O 97 g ∞1 97§ 髓0 97 g 驰上 976 。6_2 ∞O 驰7 87 1 870 5。 ViNlarn-09O1 seq
‘ 量1 O0 48 伍O 1．9 _ 瓣B 辨 7 999 妁7 蜩8 997 O旺O 992 976 7 蜩4 朗8 ∞叠 矗 懈 舯 姗 5啪
7 8．7 O_2 &3 Of2 21 O上 _ 孽重 996 的5 ∞5 99 5 99 3 鳙e 97 5 973 奢 7 盯_五 87，8 7 Las Chon~nLO0432004 seq
l 126 O3 11 03 2．2 O3 O9 ■墨 93 90 9复O 99O 96 99 O 974 975 981 84 88O ● Las U921616~
口 8．9 O1 8_3 1 2O 01 4 0．7● 99．4 99．4 ∞．4 99 5 硼 9 5 g 5 95．8 876 877 I l as Gl曲飒LD口1S7275．seq
10 9’ O3 87 O3 O 3 0_5 1 0 0．6羹 993 10．0 91 蚰6 974 971 拣● 87 3 873 a I鹄HI 湘执H320o2 seq
I1 9．0 O3 86 2 ZI O O5 1．0 O6 O7 —■ 993 g91 985 975 9 鲭．4 87 B7．3 1 Las_FuJtarLDQ431996．seq
2 9 03 87 O3 2．2 O3 O5 1．0 O 6 00 0．7 ■- j ．1 的 S ●74 971 惦4 g7 3 873 I2 Las_C,O_OQ4320~ seq
I3 125 00 ”0 OO 1 9 OO 07 0l 05 0 9 09 0．g_ 991 977 975 口6 蚰2 髓1 3 I．as_Tiw~n_DO3027503ea
¨ 127 O粤 ’1 3 O 8 25 O8 1 2 1．O 1 0 ‘ 4 1．4 O9●_ 箱 8 974 g5 7 880 875 14 曲 l 532 s．q
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17 154 37 14O 37 56 37 t4 4O 44 47 47 47 39 4 36 4．7_ 87 8 879 17 Lam．．AY／42824,seq
” 2‘ 1Z‘ 嚣2 12_‘ 11．3 122 ’3皇 128i13暑 141 1 7 141 13O 33 ’O ’ 7 ’35■■- 2 l q^ 瑚抽 抓．了‘拍曲cIef俘G簟冷_^殴B96响
伯 25¨7 122 24．1 123 14● 12．2 137 13 2 136 1●O 140 14 0 131 ’37 11 4 13 8 童● 5．0_ 9 呦 Ir『I H 682o6．seq
t 2 3 ● 5 6 7 0 9 10 1 2 13 ● 15 t6 I7 Il ●
jLas GD D0432005
tLas Hunan D0432002
Las Chongq i ng DQ432004
- Las GX EU921616
Las Guizhou DO157275
}-Las Fuj i an DQ431998
’JV ietnam-0905
GD-1003
GX一1002
88 Las Ta i wan 00302750
100
1002
：-1001
Agrobacter i um tumefac i ens
— Rhizobi um HM768206 100
图 3 用距离法(NJ)构建不同 HLB株系
16S rDNA序列系统发育树
Fig．3 Phylogenetic tree constructed by Neighbor
Joining(NJ)based on 16S rDNA of different
isolates of HLB pathogen
分保守的，分析原核生物细胞中的 16S rDNA的碱
基序列，比较与其它种属之间 16S rDNA序列的同
源性 ，可以真实地揭示 它们 亲缘关系 的距离和系统
发育地位(Ereik等，1995)。通过 MEGA4．0软件
对越南 HLB病原菌 16S rDNA 比对 、构建 系统发
育树分析显示：越南 、广东和广西的样 品与 HLB亚
洲种中国各株系病原菌遗传距离较近，与印度株系
稍远，与非洲种与土豆斑马条纹病病原菌次之，与美
96jLas GD D0432005
53 I’Las Hunan D0432002
’ Las GX EU921616
Las Ghongq i ng D0432004
Las Gu i zhou DQI57275
38 ILas Ta iwan DQ302750
IGD一1 003
”IVi etnam-0905
40 lGX一1002
Ias Fuj iarl DQ431998．txt
Las india L22532
广V i etnam-0901
- — — Laf L22533
ZC GQ468843
— — Lam AY742824
10O
100
GD-1002
一 GX-1 001
Agrobacter i um tumefac iens
— Rhi zobiurn HM768206
图 4 用最小进化法(ME)构建不同 HLB
株系 16S rDNA序列系统发育树
Fig．4 Phylogenetic tree constructed by M inimum
Evolution(ME)based on 16S rDNA of different
isolates of HLB pathogen
洲种最远。从分子水平上证明越南柑桔黄龙病病原
属于柑桔黄龙病病原亚洲种。
在系统发育树 中虽然所有亚洲种样品聚类都归
为一个组 群，但 Vietnam一0905、GD-1003和 GX一
1002三个样品与其它亚洲种差异很小 ，而同是来 自
越南 、广东 和广 西 的样 品 Vietnam一0901、GD-1002
和 GX一1001与其它亚洲种株系相比却有较大差异，
表明相同地域内的黄龙病病原菌还是存在着一定差
一一
612 广 西 植 物 30卷
异，由此推断在我国不 同地域 内可能存在着新的亚
种或株系 ，这可能与这些地方间苗木调运、木虱迁飞
造成的黄龙病传播相关，其存在株系的相关情况以
及是否还存在其它株系还有待进一步研究。
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