全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(6)：832—835 2011年 l1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．06．023
天然产物莪术醇单克隆抗体的制备
陈 旭1一，钟海雁1 ，王 娟 ，曾建红1，2
(1．中南林业科技大学，长沙 410004；2．桂林医学院 药学院，广西 桂林 541004)
摘 要：为制备小分子化合物莪术醇的单克隆抗体 ，先将莪术醇(curcumo1)与载体蛋 白牛血清蛋白(BSA)偶
联形成完全抗原，用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDI—TOF—MS)鉴定莪术醇人工抗原的偶联率，然
后采用杂交瘤技术获得杂交瘤株，并对其进行小鼠腹水的制备与纯化。结果表明：莪术醇半抗原与载体的偶
联比为 19．6，单克隆抗体的腹水效价为 1：51 200，获得的单克隆抗体只与莪术醇抗原发生特异反应，聚丙烯
酰胺凝胶电泳((sDs_PAGE)显示，单克隆抗体重链的分子量为 5 000，轻链的分子量为 2 500。得到了莪术醇
单克隆抗体 ，为利用免疫分析技术对莪术类药材进行质量控制与检测奠定了理论基础。
关键词：天然产物；莪术醇；单克隆抗体 ；制备
中图分类号 ：R932 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)06—0832—04
1 ‘ n 。 。 ‘’ 一 ‘ 。
ormation 0f monoclona1 anti btniy a~ainst
a major natural product curcumol
CHEN Xu ， ，ZHONG Hai-Yan ，Wang Juan2，ZENG Jian-Hong1,2
(1．Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，
China；2．Guilin Pharmaceutical School，Guilin 541004，China)
Abstract：To get monoclonal antibody(mAb)against crude drug curcumol，curcumol—carrier protein conjugates were
synthesized by the method that curcumol was conjugated with BSA．The ratio of hapten and bovine serum albumin in
an antigen conjugate was determined by matrix-assisted laser desorption／ionization mass spectrometry(MALDI-TOF-
MS)．A hybridoma secreting monoclonal antibody against cureumol was produced by hybfidorna technology，then prepa—
ration and purification of curcumol mAb use mice hybridoma ascitic fluid．Results showed that the ratio of hapten and
bovine serum album was 19．6，the ELISA titers in the ascite fluids of the curcumol mAb were 1：51 200。ELISA analysis
also proved that the curcumol mAbs reacted specificaly with curcuoml antigen，polyacrylamide gel electrophoresis((SDS-
PAGE)assay showed that the c~cumol heavy chain was 5．0×10 and the light chain was 2．5×10 ．Conclusion the spe—
cific anti-curcumol mAbs were prepared，which wodd lay a theoretical foundation for detection and qulity control and im-
munoassay of curcuma kwang siensis in Guang xi producing areas by Immunoassay．
Key words：natural product；curcumol；monoclonal antibody；preparation
莪术醇(curcumo1)又名姜黄环奥醇，姜黄醇，属
萜类化合物，是广西莪术挥发油中的重要成分，具有
抗癌、抗早孕、抗病毒、抗突变、保肝、活血化瘀等药
理作用(陈旭等，2008；曾建红等，2008)。随着莪术
醇在临床上的应用，以及人们对其药理药效研究的
深入研究，莪术醇引起了人们广泛的兴趣。然而由
基金项目：国家自然科学基金(30g6o498)；广西自~ (GXNSFA013252)；广西科技攻关与新产品试制(桂科攻0992003A-26)ISupported by
the Nati0na1 Natural Science Foundation 0f China(30960498)；the Natural Science Foundation of Guangxi(GXNSFA013252)；Key Scientific “d
1 chnol0gica1 Research and New Product Production of Guangxi(0992003A-26)J
E- ma il)zhon gha i yan 55l z1U *通讯作者：钟海雁 ，博士，教授，博士生导师，主要从事植物可食资源评价 、深度加工等研究与教学工作’ “ “
6期 陈旭等：天然产物莪术醇单克隆抗体的制备 833
于莪术醇在药材中的含量较低，且与其他挥发性成
分难分离，使得检测和分离的难度较大，检测时间
长。目前莪术醇的测定方法主要有比色法、红外分
光光度法、双波长扫描法、气相色谱法等方法，而上
述方法在快速、批量检测方面均存在一定的缺陷(郭
守军等，2010)。免疫分析方法因其具有操作简便、
灵敏、稳定、快速和高通量检测的特点(Jerome等，
2002；Yu等，2O10；Shu等，2007；Yu等，2009)，在中
药材的质量监测与评价方面具有较好的应用前景。
有与检测成分对应的抗体是免疫分析的关键，本实
验以小分子化合物莪术醇为研究对象，合成莪术醇
人工抗原(Cur—BSA)，制备抗莪术醇的单克隆抗体，
旨在为进一步制备莪术醇单抗试剂盒奠定基础。
1 材料与方法
1．1实验材料与试剂
4周龄雌性 BALB／c小 鼠由本 院 SPF级实验
动物中心提供；莪术醇购 自中国生物制品检定所
(100185—200506)，Cur—BSA抗原由本实验室制备，
(1)莪术醇琥珀酸单酯(Cur—HS)
O
oH+ l 、O
．o
DMAP
聚乙二醇(PEG)4000为 Roche公司产品；胎牛血清
为 GIBCO公司产品；小鼠骨髓瘤细胞 Sp2／0购自
于中国科学院上海生命科学研究所；细胞培养用
DMEM—F12液体为 Hyclone公司产品；弗氏完全及
不完全佐剂为 Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标
记的(HRG)鼠二抗为碧云天公司产 品，2，2 r_azino—
bis(3-ethylbenzo—thiazoline一6一sulfonic acid)diam—
monium salt(ABTS)、HAT和 HT为 sigma公司产
品，细胞培养用 96孔、24孑L板为 Costa公司产品；
其他试剂为国产分析纯产品。
1．2主要仪器
二氧化碳培养箱(311)、低温高速离心机(1egend—
microl7R)为 Thermo公 司产品，酶标 仪 (MLDEL
680)、电泳仪(DYCP-3IA)为美国Bio-Rad公司产品。
1．3莪术醇人工抗原的合成
以莪术醇为原料，用琥珀酸酐法将丁二酸酐与
莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur—HS)，得到
人工半抗原，然后将莪术醇的半抗原制备成吡啶水
溶液，然后使之与 BSA结合，制备出莪术醇的人工
抗原即 Cur—HS．BSA，其反应方程式为：
O
O
莪术醇 丁二酸酐 莪术醇琥珀酸单酯
(2)莪术醇人工抗原 Cur—HS—BSA
O
O
O
OH + BSA EDC O
O
O
OH
莪术醇琥珀酸单酯 牛血清蛋白 莪术醇人工抗原
1．4动物免疫及血清抗体效价的测定
选用健康雌性4周龄BALB／c小鼠作为免疫动
物，免疫方案如下：初次免疫采用 100 g莪术醇丁
二酸酯一BSA加弗氏完全佐剂，以后每隔2周进行 1
次加强免疫，使用 50 g免疫原加弗氏不完全佐剂
，
共 4次，均采用腹腔注射。每次加强免疫后 4 d眼
O
BSA
眶取血用 ELISA 检查 抗体 涌度 。用 直接 与 I司援
ELISA检测小鼠体内抗体，ABTS显色，测定405
am的吸光度(A值)。待测标本(P)与阴性对照(N)
的比值(P／N)大于2．1，则为阳性，以出现阳性反应
的最高稀释度作为血清抗体效价
。 将血清抗体效价
达到1×10 的小鼠用 100 g免疫原进行加强免疫
834 广 西 植 物 31卷
1次，3 d后用于细胞融合。
1．5细胞融合
免疫 3 d后处死小鼠后，取出小鼠脾脏，以5：1
的比例与 Sp2／0骨髓瘤细胞进行混合。融合后将
细胞接种到含饲养细胞的 96孔细胞培养板中，每孔
75 L，置 37℃，5 的CO 的培养箱中培养。融合
后第 2天每孔加入 2×的 HAT 75 L，3 d后用 1×
的 HAT半换液。
1．6杂交瘤细胞的筛选
用 EusA法筛选阳性孑L，ABTS显色，测定
405 nm的吸光度(A值)，筛选阳性孔，待测孑L(P)与
阴性对照孔(N)的比值(P／N)大于 2．1为阳性孔，
有限稀释法进行亚克隆化，经过3～4次亚克隆得到
单克隆杂交瘤细胞。
1．7抗体制备与纯化
杂交瘤腹腔注射前一周给 8周龄雌性 BALB／c
小鼠腹腔注射石蜡油，每只0．5 mL，诱导产生腹水。
10 d后收集腹水，离心得到小鼠腹水。腹水用 Pro—
tein—G蛋白分离柱纯化(刘树玲等，2011；Hiroyuki
Tanaka等，1999)，将收集的腹水，用 1 tool的 Tris
溶液将腹水的PH值调至7．0，然后通过蛋白分离柱，
用 10 mmol(pH7．O)的磷酸盐缓冲液清洗柱子，被吸
附的抗体用 i00 mmol(pH3．0)的柠檬酸盐缓冲液洗
脱下来，再用 1 M的Tris溶液中和，以pH7．4的PBS
对冲透析 3次，最后冻干。用间接 ELISA法检测腹
水和单抗细胞培养上清液的抗体效价。以l／,g／mL
单克隆抗体包被 96孔板，每孑L 100 I ，酶标记抗体
为 HRP标记的羊抗小鼠IgG。单克隆抗体的效价
用腹水和细胞培养上清液的稀释度表示。
2 结果与分析
2．1 Cu~BSA完全抗原 的 MALDI-TOF-MS检测结果
用 MALDI—TOF—MS鉴定莪术醇人工抗 原，如
图 1所示从 MALDI—TOF—MS图谱可明显看出
Cur—HS与BSA偶联形成了复合物，该复合物的相
对分子质量约为73 302；与BSA(66 713)以及Cur—
HS(336)~比我们可以求出Cur．一HS—BSA的偶联
比为19．6，本实验中人工合成的半抗原一蛋白复合
物Cu 一HS-BSA的偶联数值较大，每个载体蛋白分
子平均与 19．6个半抗原分子结合。
2．2免疫小鼠血清抗体效价检测
细胞融合前3 d小鼠眼眶取血，EL1sA分析小
鼠血清中抗体效价。判定标准(舒震等，2010)：阳性
血清 OD值在 1．0左右，同时与阴性血清 OD值差距
最大的抗体稀释度为最佳工作浓度。以空白孔调零，
待测孔 OD值大于或等于阴性对照孔的2．1倍为阳
性，阳性值中对应的最大稀释倍数即为血清效价。根
据方阵法确定 ELISA方法的最佳阳性血清最佳稀释
度为 1：6 400，血清效价达 1：100 000(表 1)。
10000 20000 30000 40000 50000 eOOoo 70000 @0000 90000 100000
№ ssfH
图 1 Cur—HS—BSA MALDI—TOF—MS谱图
Fig．1 M ALDI—TOF—MS picture of Cur．一HS-BSA
表 1 血清稀释度和效价测定结果
Table 1 The result of serum dilution and titre detection
2．3细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选克隆
融合后第 1O天采用间接 ELISA法和竞争
ELISA法进行阳性克隆的筛选，经过 4次亚克隆，
得到 1株能够稳定分泌莪术醇抗体的杂交瘤细胞，
命名为4-9B2。经过多次传代、冻存、复苏后仍具有
稳定分泌莪术醇抗体的能力。
2．4腹水效价澳I⋯ ⋯一鉴I定
用间接 ELISA法测得抗体效价为 1：51 200，
； ； ； 一 小小 小小 叭
。
一 一
4 4 4 9 5 5 9 5 5 4 4一零 Ⅲ m m ～ 蚰
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6期 陈旭等：天然产物莪术醇单克隆抗体的制备 835
细胞培养上清液效价为 1：1 600～1：3 200，所得
的单克隆抗体我们用竞争 ELISA法分析其特异性，
将所得抗体稀释 100倍后与莪术醇、莪术酮、吉马
酮、连翘甙、芦丁、小檗碱测试，ABTS显色后，仅与
莪术醇发生特异性反应，莪术醇组无颜色反应，其它
均出现蓝绿色光，405nm吸收值测定莪术酮、吉马
酮、连翘甙、芦丁、小檗碱的吸光度值与阴性组相比
差异无显著，吸光度值高达 0．653，而莪术醇的吸光
度值为 0．112，用 SPSS软件分析差异极显著。
我们将冻干抗体用蛋 白裂解液稀释，再采用
12 的sDS-PAGE进行了分析见图 2，重链相对分子
质量为 5 000，轻链为 2 500，均与电泳结果相符合。
49K0
35KD
26KD
1 9KD
一 重链
一 轻链
1 marker 2腹水纯化后
的单克隆抗体
图 2 莪术醇单克隆抗体的SDS-PAGE凝胶电泳图
Fig．2 The SDS-PAGE picture of curcumol
monoclonal antibody
3 结论
莪术醇为小 分子天 然化合物，相 对分子量
236．35，仅具有反应原性，而不具有免疫原性，因此
需要与大分子蛋白等偶联形成复合物后才能成为完
全抗原。小分子往往不直接与载体蛋白连接，通过
偶联剂与载体蛋白交联。本研究莪术醇结构中存在
C。羟基的特点，先将莪术醇制备成莪术醇琥珀酸单
酯(半抗原)，然后再与 BSA和 HSA偶联形成复合
物，从而成为完全抗原。半抗原与载体偶联后，还需
要进行对偶联好的完全抗原的偶联比率进行评价，
这直接关系到合成的成功与否以及抗体制备的质
量。偶联比率并不是越高越好，一般说来，载体与半
抗原分子的最佳偶联 比为 1：5～20(Robns等，
1986)。本实验通过 MALDI—TOF—MS检测到莪术
醇的偶联率为 19．6，这说明莪术醇的偶联效果比较
好。动物免疫实验也表明，制备的免疫原能够刺激
机体产生免疫应答，免疫 2次后的小鼠血清当中检
测到了效价较高的抗体。细胞融合是单克隆抗体的
关键步骤，血清的选择、培养基的选择、PEG的选
择、细胞状态、脾细胞的取出过程、脾细胞与骨髓瘤
细胞的比例、每孔接种的细胞数等都可以影响到细
胞融合的效果，本实验中 PEG的温度和加 PEG的
速度是融合成功的关键。有报道指出利用单克隆抗
体的ELISA法来测定天然药物活性成分的含量，结
果与高效液相色谱法得到的一致，但是操作过程简
单、快速、灵敏(Jing等，2006)，本次研究首次报道了
莪术的活性成分莪术醇单克隆抗体的制备，这为后
续的莪术醇 ELISA试剂盒的分析提供实验基础，同
时也为莪术醇含量的测定提供新的方法。
免疫分析因其具有快速、灵敏、精确和简便等特
点，可用于大规模生产的中药质量控制、中草药原料
药的鉴定、中药活性成分的体内分析及中草药有效
成分的纯化等诸多方面，本实验制备出的莪术醇单
克隆抗体为利用酶联免疫吸附方法对含莪术醇的中
草药进行定性或定量分析提供了可能，同时为完善
中药的质量评价体系和方法起到积极的作用。
参考文献：
Chen x(陈旭)，Zeng JH(曾建红)．2008．Efect of light intensity
on volatile oil and crucumol content in Curcuma kwangsiensis
(光照强度对广西莪术挥发油及莪术醇含量的影响)口]．
Guihaia(广西植物)，28(5)：694—697
Zeng JH(曾建红)，Chen X(陈旭)，Pan Yw(潘艳薇)，甜。f．
2008．Advances in curcumol(莪术醇的研究进展)[J]．J Chin
Med Mat(中药材)，31(1)：168—170
Guo SJ(郭守军)，Yang YL(杨永利)，She JB(佘建宝)．2010．
Determination of carbohydrates in seed gum of CromlaHa ITIucr—
onata by HPLC(高效液相色谱法分析猪屎豆种子胶多糖中的
单糖组成)[J]．30(3)：422—425
Jerome N，Andrea B，Carm elo T，et a1．2002．A competitive ELISA
tO Detect Brevetoxins from Kar~ia brevis(form erly gymnodinium
breve)in seawater，shelfish，and mammalian body fly,j]．Envi—
rorl Health PP —Pect，110(2)：179—185
Yu Z，Yan-SL，Feng GP，et a1．2010．De velopment of a new mon—
odonal antibody based direct competitive enzyme-linked immu—
nosorbent assay for detection of brevetoxins in food samples[J]．
Food Chem ，118：467— 471
Shu HZ，Osamu M ，Shinichi Shimokawa，et a1． 2007． Eastern
blotting and use of anti-saikosaponin a monoclonal antibodies for
detection of saikosaponins[J]．J Nat Med，61：178—183
Yu Z，Feng GP，Yan SL，et a1． 2009．Colloidal gold probe-
based immunochromatographic assay for the rapid detection
of brevetoxins in fishery product samples[J~．Biosens Bioel—
ectr，24：2 744— 2 747
(下转第 831页 Continue on page 831)
6期 韩素菊等：巫山淫羊藿愈伤组织细胞的悬浮培养条件优化的初步研究 831
度才有利于细胞的生长。
3．2不同种类的液体培养基对淫羊藿悬浮体系建立
的影响
不同种类的液体培养基对植物细胞的生长和次
生产物的形成有很大的影。目前，比较适合多种植
物的一般营养条件的培养基，有多种配方可供选择，
如 MS，KC，White，B ，N。，LS等，有的研究表明降
低培养基中氮源的总浓度能促进黄酮类化合物的合
成(Yamakawa，1983)。本实验结果也表明含低浓
度铵的 B 培养基有利于巫山淫羊藿细胞生长及黄
酮类化合物的合成。
综上所述，利用松脆的胚性愈伤组织，可很容易
地建立起理想的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。悬
浮体系保存在B5基本培养基中并附加 1．0 mg·L
2，4一D和0．2 mg· BA，蔗糖浓度 40 g·L ，接种
量每 30 mL为 2 g，这样建立起的悬浮细胞培养体
系能获得高产黄酮的含量可接近淫羊藿黄酮的含
量。说明建立悬浮细胞培养系研究细胞生长和次生
代谢产物积累规律对于植物细胞培养放大和提高次
生代谢产物的得率具有重要意义，也是未来植物细
胞培养生产次生代谢产物发展的主要方向。
参考文献：
王海波．1994．植物组织及细胞培养通用分析模式的探索ED]．
北京 ：中国农业科学
王海波．1991．组织培养中的细胞状态调控[J]．作物杂志，3：
3— 6
朱朝德，张转平，孙全明，等．1998．箭叶淫羊藿叶中总黄酮及
淫羊藿甙含量的动态变化研究[J]．中国中药杂志，23(1)：
2】一 26
朱朝德，胥道宝．1993．5种淫羊藿中淫羊藿甙含量的比较[J-1．
中国中药杂志 ，18(6)：332
李文魁，林新，罗崇念，等．1995．近年来国内淫羊藿甙研究概况
fJ]．西北药学杂志，10(3)：138—140
国家药典委员会．2000．中华人民共和国药典(一部)ES]．北
京 ：化学工业出版社 ：267
胡筱 ，魏毅 ，沙玫．2004．淫羊藿中总黄酮的超声提取工艺 的研
究[J]．海峡药学，16(4)：88—89
韩素菊，黎云祥 ，胥晓，等．2007．箭叶淫羊藿胚性愈伤组织诱导
及其黄酮类化合物的总含量测定[J]．中国中药杂志，32
(23)：2 551—2 553
颜秋生，张雪琴，腾胜，等．水稻原生质体培养技术体系的建立
[A]．华南农业大学，农业科学集刊编辑委员会．农业科学集
刊第二集：农作物原生质体培养
Chen CS(陈崇 顺)，Robert J．1994．Acquisition of friable cali
from stems and establishment of the cell suspension cultures of
Prunus armeniaca cv．Canino and Luizet(杏茎脆散型愈伤组织
的获取及细胞悬浮体培养的建立EJ]．J Plant Res Environ(植
物资源与环境)，3(2)：22—26
Dornenburg H，Seydel P．2008．Effect of irradiation intensity on
cel growth and kalata B1 umulation in Oldenlandia affinis cul—
turesEJ]．Plant Cell Tissue Organ Cult，92：93—99
Guo BL(郭宝林 )，Xiao PG(肖培根)．1999．The flavonoids in
Epimedium and their taxonomic significance(淫羊藿属植物 中
的黄酮类成分及其分类学意义)[J]．Acta Phytot Sin(植物分
类学报)，37(3)：228—243
u SS(李士生)，Zhang YL(张玉玲)．1990．Studies on tissue cul—
ture of wheat immature inflorescences and the differention of cali
(小麦幼穗的组织培养及愈伤组织的分化研究)_J]．J Wuhan
Bot Res(武汉植物学研究)，8(4)：349—354
JJ(李晶晶)，Yu SF(于世凤)，Li TJ(李铁军)，et a1．2002．In
vitro study of the effects of Epimedium on osteoclastic bone re—
sorption in various oral mineralized tissue(淫羊藿对 口腔各矿化
组织破骨细胞性骨吸收的体外实验研究)[J]．China J Store—
atol(中国口腔 医学杂志)，37(5)：391
Wu LQ(武利 勤)，Guo SX(郭顺星)，Xiao PG(肖培根)．2005．
Cel suspension cultuire and flavonoids production in saussurea
involucrate(新疆雪莲细胞悬 浮系 的建立和黄酮类活性成分
的产生)[J]．ChinJ Stomatol(中国口腔医学杂志)，30(13)：
965— 968
Yamakawa T，Kato S，Ishida K，et a1．1983．Production of antho—
cyanins by vitis cels in suspension culture[J]．Agric Biol
Chem，47(10)：2 185—2 190
Yang F(杨帆)，Zhao J(赵君 )，Zhang ZW(张之为)，et a1．2010．
Advances in plant suspension cels(植物悬浮细胞的研究进展)
[J]．LiSe Sci Res(生命科学研究)，14(3)：257—262
(上接第 835页 Continue from page 835)
Shu z(舒震)，Hou DY(侯登勇)，Li J(李 晶)．2010．Preparation
and Identification of Anti-Human B7～H1 Monoclonal Antibody
(抗人B7一H1单克隆抗体的制备和鉴定)EJ]．Lea Biotech(生
物技术通讯)，21(4)：531—534
Liu SL(刘树玲)，Yang XX(杨 秀旭)，Li H(李浩)，el a1．2011．
Preparation and characterization of murine monoclonal antibodies
against ESAT一6 antigen of mycobacterium tuberculosis(结核分枝
杆菌ESAT一6抗原鼠单克隆抗体的制备及初步鉴定)[J]．Lett
Biotech(生物技术通讯)，22(2)：258-260
Hiroyuki T，Noriko F，Yukihiro S，eta1． 1999．Formation of m0n—
oclonal antibody against a major ginseng component，ginsenoside
Rbl and its characterization[J]．Cytotechnology，29：115—120
Robns RJ． 1 986。 The Measurement of Low—Molecular—
Weight，Non—Immunogenic Compunds by Immunoassay
[M]／／Lnskens HF(eds)．Immunology in Plant Sciences
Berlin：Springe—Verlag：86—108
Jing Z，Gang L，Baomin W ，et a1． 2006． Development of a
monoclonal antibody-based enzyme—linked immunosorbent
assay for the analysis of glycyrrhizic acidEJ]．Anal Bioanal
Chem ，386：1 735—1 740