全 文 ：AB
图 3　丹皮酚 、二妙丸(不含内标)气相色谱图
A.丹皮酚　B.二妙丸(不含内标)挥发油
并中的含量均高于合煎的含量 ,说明两味药合煎对
小檗碱 、巴马汀 、药根碱的含量均有一定影响。可能
是因为苍术中含有十六烷酸 、[ Z, Z] -9, 12-十八碳二
烯酸等有机酸性成分[ 3] ,与黄柏中的生物碱成分结
合成盐 ,从而减少游离的生物碱的含量。
表 3　 大鼠足肿胀试验结果
组别 原发性肿胀率 /% 继发性肿胀率 /%
空白 28.569 0 29.548 0
单煎合并组 22.019 0 23.594 0
合煎组 13.508 1 15.680 0
阳性对照组 21.150 0 22.757 0
　　通过药理实验发现 ,在对佐剂所致的大鼠关节
炎足肿胀的抑制作用试验中 ,二妙丸单煎合并水煎
液的作用与合煎水煎液的作用有很大不同 ,合煎的
作用明显好于前者 。见表 3。
参考文献:
[ 1] 　李　霞 ,杨静玉 ,孟大利.麸炒北苍术挥发油成分的分析和镇
痛活性的研究 [ J] .中草药 , 2000, 34(10):886-887.
[ 2] 　朱爱兰 ,潘　扬 ,张　弦.二妙丸 、三妙丸 、四妙丸中 β-桉叶醇
和茅术醇的含量测定 [ J].南京中医药大学学报 , 1999, 15(1):
30-32.
[ 3] 　孟　青 ,冯毅凡 , 郭晓玲 , 等.苍术有效部位化学成分的研究
[ J] .中草药 , 2004, 35(2):140-141.
RP-HPLC测定气管炎 4号中莪术醇和小叶枇杷素 -2的含量
卫晓晓 1 , 　焦海胜 2＊
(1.兰州大学药学院 ,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学第二医院药剂科 ,甘肃 兰州 730030)
收稿日期:2008-07-28
基金项目:兰州市科技园转公关计划(041217)
作者简介:卫晓晓(1982-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:药物新剂型与临床药学。
＊通讯作者:焦海胜 ,男 ,教授 ,研究方向:药物新剂型与临床药学。 Tel:(0931)8942571
关键词:RP-HPLC;莪术醇;槲皮素;气管炎 4号
摘要:目的:建立 HPLC法测定气管炎 4号中莪术醇和小叶枇杷素-2(槲皮素)含量的方法。 方法:采用 RP-HPLC法对制
剂中的两种组分分别测定 ,以 PhenomenexC18柱(150 mm×4.60mm, 5 μm)为固定相 , 莪术醇:流动相:甲醇-水(85∶15);
检测波长:210 nm;流速:1.0 mL/min;柱温为室温。槲皮素:流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液(51∶49);检测波长:254 nm;流
速:1.0 mL/min;柱温为 30°C。结果:莪术醇对照品在 6.32 ～ 66.00μg/mL,槲皮素在 5.76 ～ 57.60μg/mL范围内具有良
好的线性关系 , r分别为 0.999 52, 0.999 78。 平均样品加样回收率分别为 97.80%, 96.80%, RSD分别为 1.67%,
1.82%。结论:本方法专属性强 , 结果准确 , 重复性好。
566
2009年 4月
第 31卷　第 4期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
April2009
Vol.31　No.4
中图分类号:R927.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2009)04-0566-04
　　气管炎 4号是兰州大学第二医院的自制制剂 ,
主要由黄芩 、淫羊藿 、小叶枇杷 、莪术等药材组成 ,经
30多年的临床应用证实 ,具有清热解毒 、化痰平喘 、
止咳解痉的作用 ,治疗慢性支气管炎 、支气管哮喘有
较好的疗效 [ 1] 。为了控制气管炎 4号的质量 ,保证
临床疗效 ,本试验采用反相高效液相色谱法测定其
中的莪术醇和小叶枇杷素 -2(槲皮素)的含量 。
1　仪器与试药
1.1　仪器
　　Agilent1100高效液相色谱仪 (美国安捷伦公
司),吉尼斯系列电子分析天平(德国赛多利斯仪器
系统有限公司),恒温干燥箱(上海新正机械仪器制
造有限公司), CQ50超声波清洗器(上海超声波仪
器厂), HPD-25减速真空泵(天津市恒奥科技发展
有限公司)。
1.2　药品与试剂
　　莪术醇对照品(批号:100185-200506 ,中国药品
生物制品检定所提供), 槲皮素对照品 (批号:
100181-200406 ,中国药品生物制品检定所提供),气
管炎 4号(兰大二院自制),甲醇为色谱纯 ,水为纯
净水 ,其余试剂均为分析纯 。
2　方法学考察
2.1　测定波长的选择
　　取莪术醇和槲皮素的对照品溶液在 190 ～ 400
nm的波长范围内用二极管阵列检测器扫描[ 2] :莪
术醇在 210 nm处有一最大吸收 , 槲皮素在 203、
254、370 nm处有 3个吸收峰 ,故莪术醇的最大吸收
波长选定在 210 nm,考虑到测定溶剂的干扰 ,槲皮
素的最大吸收波长选定在 254nm处[ 3] 。
2.2　色谱条件
　　PhenomenexC18柱(150mm×4.60mm, 5 μm),
莪术醇:流动相:甲醇 -水(85∶15)[ 2] ,检测波长:210
nm,流速:1.0 mL/min, 柱温为室温。进样量:20
μL;保留时间为 5.392 min;理论塔板数按莪术醇峰
计算不低于 2 000。
槲皮素:流动相:甲醇 -0.4%磷酸溶液 (51 ∶
49),检测波长:254 nm,流速:1.0 mL/min,柱温为
30 ℃。进样量:20 μL;保留时间为 10.031 min;理
论塔板数按槲皮素峰计算不低于 2 000。
2.3　对照品溶液的制备
　　精密称取莪术醇对照品 1.58 mg、槲皮素对照
品 5.76 mg,分别置 10 mL棕色量瓶中 ,加甲醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得浓度为 158 μg/mL的莪
术醇对照品溶液和 576 μg/mL的槲皮素对照品溶
液。
2.4　供试品溶液的制备
　　取气管炎 4号片剂 20片 ,精密称定 ,研细 ,取粉
末约 0.8 g,置 50 mL锥形瓶中 , 加甲醇 20 mL,称
重 ,超声处理 30 min,放置至室温 ,用甲醇补足减失
的重量 ,摇匀 ,滤过 ,精密量取续滤液 50 μL,置 1.0
mL的具塞离心管中 ,加甲醇 200 μL,摇匀 ,用孔径
为 0.45 μm的微孔滤膜过滤 ,即得莪术醇的供试品
溶液 。
取气管炎 4号片剂 20片 ,精密称定 ,研细 ,取粉
末约 0.5g,置圆底烧瓶中 ,加甲醇-25%盐酸溶液(4
∶1)25mL,加热回流 60 min,冷却 ,摇匀 ,滤过 ,精密
量取续滤液 50 μL,置 1.0 mL的具塞离心管中 ,加
甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,用孔径为 0.45 μm的微孔
滤膜过滤 ,即得槲皮素的供试品溶液[ 4] 。
2.5　阴性对照品溶液的制备
　　以相同处方比例 ,按制备工艺方法制备不含莪
术药材和不含小叶枇杷的阴性对照品 ,再按 “2.4供
试品溶液的制备 ”项下方法制备 ,即得阴性对照品
溶液 。
2.6　系统实用性试验
　　分别吸取上述莪术醇和槲皮素对照品溶液 、供
试品溶液以及阴性对照品溶液 ,照 2.2项色谱条件 ,
各进样 20 μL,记录 HPLC图谱 ,结果见图 1和图 2。
　　结果:在选定的色谱条件下 ,莪术醇和槲皮素与
样品中其它组分的色谱峰实现了基线分离 ,分离度
大于 1.5,理论塔板数在 2 000以上 ,且阴性对照品
无干扰 ,表明可以用此色谱条件对两组分进行含量
测定 。
2.7　线性关系的考察
　　将莪术醇对照品溶液稀释至 6.32、 9.48、
12.64、25.28、31.60、66.00 μg/mL, 即得一系列浓
度的对照品溶液 。照 2.2项色谱条件吸取上述溶
液 ,分别进样 20 μL(各进 3次),记录峰面积 。以峰
面积(Y)为纵坐标 ,莪术醇对照品溶液浓度(X)为
横坐标 , 绘制标准曲线 , 得回归方程为:Y=
16.747 88X-19.368 35, r=0.999 52。结果表明莪
术醇在 6.32 ～ 66.00 μg/mL的范围内线性关系
良好 。
　　将槲皮素对照品溶液稀释至 5.76、 11.72、
567
2009年 4月
第 31卷　第 4期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
April2009
Vol.31　No.4
23.04、34.56、 46.08、 57.60 μg/mL,即得一系列浓
度的对照品溶液 。同上操作 , 回归方程为:Y=
34.207 79X-15.892 76, r=0.999 78。结果表明槲
皮素在 5.76 ～ 57.60 μg/mL的范围内线性关系
良好 。
A
B
C
图 1　莪术醇 HPLC色谱图
A.莪术醇对照品　B.气管炎 4号样品　C.缺莪术的阴性对照
1.莪术醇
A
B
C
图 2　槲皮素 HPLC色谱图
A.槲皮素对照品　B.气管炎 4号样品　C.缺小叶枇杷的阴性对照
1.槲皮素
2.8　实验方法学考察
2.8.1　精密度试验
取莪术醇对照品溶液(C=31.60 μg/mL)和槲
皮素对照品溶液(C=23.06μg/mL),分别连续进样
6次 ,每次 20μL,记录峰面积 ,莪术醇峰面积积分平
均值为 692.85, RSD=1.84%;槲皮素峰面积积分平
均值为 764.88, RSD=1.06%。由此得出:本分析方
法精密度良好 。
2.8.2　重复性试验
取同一浓度供试品 6份 ,精密称定 ,按 2.4项供
试品溶液制备方法制备 ,照上述色谱条件分别进样
20 μL(各进 3次),按莪术醇质量分数计算 , RSD=
1.24%,按槲皮素的质量分数计算 , RSD=1.63%。
由此得出 ,本分析方法重复性良好 。
568
2009年 4月
第 31卷　第 4期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
April2009
Vol.31　No.4
2.8.3　稳定性试验
取样品溶液分别在 0、2、4、6、8、10、12、24 h后
测定 ,记录峰面积 ,莪术醇峰面积的 RSD=1.93%,
槲皮素峰面积的 RSD=1.54%。由此得出 ,供试品
溶液在 24h内稳定 。
2.8.4　样品加样回收率试验
取已知含量的样品粉末 ,共 6份 ,精密称定 ,分
别按 3种比例(0.8∶1 , 1∶1, 1.2∶1)精密加入对照
品溶液 ,按 2.4项供试品溶液制备方法制备 ,进样
20 μL,记录峰面积 ,计算平均加样回收率 ,结果见表
1和表 2。
表 1　 莪术醇样品加样回收率实验结果(n=6)
已知样品中
含量 /μg
加入莪术
醇量 /μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
9.20 7.584 16.22 96.64
9.18 7.584 16.79 100.13
9.24 9.480 18.45 98.54
9.25 9.480 18.22 97.30 97.84 1.67
9.31 11.376 19.78 95.60
9.19 11.376 20.32 98.84
表 2　 槲皮素样品加样回收率实验结果(n=6)
已知样品中
含量 /μg
加入槲皮
素量 /μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
6.109 4.872 10.674 97.20
6.162 4.872 10.438 94.62
6.242 6.090 11.761 95.61
6.134 6.090 11.992 98.17 96.80 1.82
6.203 7.308 13.011 96.38
6.132 7.308 13.373 99.59
2.9　样品含量测定
　　取 6个批号的样品 ,依 2.4项供试品溶液的制
备方法分别制得供试品溶液。按照 2.2项色谱条件
分别进样 20 μL,记录峰面积 ,计算 6批供试品中莪
术醇和槲皮素的含量以及 RSD,每个批号的样品平
均测 3次 ,结果见表 3。
表 3　 样品含量测定结果(n=6)
批号 莪术醇含量/(mg/片)
平均含量
/(mg/片)
RSD
/%
槲皮素含量
/(mg/片)
平均含量
/(mg/片)
RSD
/%
080311 0.310 1.168
080410 0.295 1.173
080515 0.304 0.301 2.32 1.183 1.158 2.92
080617 0.307 1.156
080627 0.292 1.091
080719 0.297 1.175
3　讨论
3.1　本试验刚开始计划对两种组分的含量同时测
定 ,但是因为莪术醇为挥发油萜类 ,槲皮素为黄酮类
化合物 ,两者极性差别较大 ,若采用同一比例的流动
相 ,槲皮素的保留时间较短 ,而莪术醇的保留时间很
长;若采用梯度洗脱 ,在本试验所用的色谱柱上当流
动相比例发生改变 ,基线不平。最终还是采用两种
组分分开测定 。
3.2　莪术醇性质不稳定 ,易被氧化成莪术酮 ,在存
放过程中应注意避氧和避光 [ 5] 。
3.3　槲皮素为黄酮类化合物 ,结构中含有多个酚羟
基 ,酸性较强 ,在高效液相测试中容易发生拖尾。我
们考察加入不同种类的酸 ,如醋酸 、磷酸 、磷酸盐缓
冲溶液 ,它们均能一定程度地改善拖尾 。考虑到药
典中在测定槲皮素含量时常加入磷酸溶液[ 6] ,所以
选择加入磷酸。观察流动相为 0.1% ～ 0.4%磷酸
溶液的试验结果可知 , 0.1% ～ 0.4%磷酸溶液均能
够使色谱峰分离良好 ,不会出现拖尾现象 ,而且酸度
也在色谱柱允许范围。因此 ,选择甲醇 -0.4%磷酸
水溶液(51∶49)为流动相。
3.4　据文献报道[ 7] ,槲皮素 HPLC法含量测定选用
的测定波长多为 360 nm,但在试验中发现 , 360 nm
测定时供试品色谱中一相邻的杂质峰吸收较强 ,影
响测定的准确性 ,经二极管阵列检测器对槲皮素对
照品溶液于 190 ～ 400 nm进行吸收光谱扫描 ,结果
在 254nm处有较强的吸收 [ 7] ,而在此波长下供试品
中该杂质峰的吸收极弱 ,因此将本品中槲皮素含量
测定的检测波长定为 254 nm。
参考文献:
[ 1] 　杨　飞 ,焦海胜.气管炎四号质量标准的研究 [ J].中成药 ,
2008, 30(2):292-294.
[ 2] 　游　剑 ,于英伟 ,李青坡 ,等.莪术油微球的含量测定 [ J] .中成
药 , 2005, 27(1):25-28.
[ 3] 　曾常青 ,黄样增.HPLC测定轻身消胖丸中槲皮素的含量 [ J].
中国中医基础医学杂志 , 2007, 13(7):542-544.
[ 4] 　龙凤荣 ,孙　敏.HPLC测定热林清胶囊中槲皮素的含量 [ J].
中成药 , 2007, 29(4):613-615.
[ 5] 　张西如 ,胡孟魁 ,姜建国.莪术醇对照品中相关物质的高效液
相色谱-电喷雾电离-质谱分析 [ J].药物鉴定 , 2004, 13(5):34-
35.
[ 6] 　中国药典 [ S] .一部.2005:147.
[ 7] 　屠万倩 ,马　开 ,张留记.HPLC测定清热散结片中槲皮素的含
量 [ J] .中成药 , 2007, 29(1):144-146.
569
2009年 4月
第 31卷　第 4期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
April2009
Vol.31　No.4