全 文 ：书广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ ３２（５）：７１０－７１４ ２０１２年 ９ 月
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０５．０２７
烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征
马娅萍１，黄龙全１，张剑韵２＊
（１．安徽农业大学 茶与食品科技学院，合肥２３００３６；２．安徽农业大学 生命科学学院，合肥２３００３６）
摘 要：采用硫酸铵沉淀、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤和ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｃ－２５阳离子交换柱层析等步骤，对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明：该酶被纯化了１１９．６
倍，得率为２８．４９％，经凝胶过滤和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得该酶的全分子量为４９．６ｋＤａ，亚基分子量约为２５ｋＤａ；该
酶最适温度为５０℃，最适反应ｐＨ为５．５；Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等对该酶有激活作用，金属离子螯合剂ＥＤＴＡ对
酶有抑制作用，加入 Ｍｇ２＋后抑制作用得到解除；在最适反应条件下，测得反应底物磷酸吡哆醛（ＰＬＰ）和磷酸
吡哆胺（ＰＭＰ）的Ｋｍ 值分别为０．２３ｍｍｏｌ／Ｌ和０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ。
关键词：烟草；磷酸吡哆醛；水解酶；纯化；酶性质
中图分类号：Ｑ９４５．１４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０５－０７１０－０５
＊ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ
ＭＡ Ｙａ－Ｐｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｌｏｎｇ－Ｑｕａｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ－Ｙｕｎ２＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｅａ ＆Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｆｅｉ ２３００３６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．
Ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｈｅｒｅｉｎ，ｌｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ
ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ １１９．６－ｆｏｌｄ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ２８．４９％ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ４９．６ｋＤａ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗａｓ ａｐ－
ｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ２５ｋＤａ；Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｄ ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ａｔ ５０°Ｃ ａｎｄ ５．５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｂｙ Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋ ａｎｄ Ｍｎ２＋，ｙｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ＥＤＴＡ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｒｅｌｉｅｖｅｄ ａｆｔｅｒ ａｄｄｅｄ
Ｍｇ２＋；ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ Ｋｍｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）ａｎｄ ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓ－ｐｈａｔｅ
（ＰＭＰ）ｗｅｒｅ ０．２３ｍｍｏｌ／Ｌ，０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ；ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
维生素Ｂ６（ＶＢ６）是一组吡啶化合物的总称，２－
甲基－３－羟基－５－羟甲基吡啶是它们共同的母体，吡啶
环第四碳位被羟甲基、氨甲基、甲酰基取代后分别形
成吡哆醇（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ，ＰＮ）、吡哆胺（Ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ，
ＰＭ）和吡哆醛（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ，ＰＬ），三者相应磷酸酯形
式为磷酸吡哆醇（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＮＰ）、
磷酸吡哆胺（Ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＭＰ）和磷
酸吡哆醛（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）。ＰＬＰ作为
多种酶的辅酶，参加催化涉及氨基酸的代谢反应。
酸性磷酸酶是一组在酸性条件下水解各种磷酸
＊ 收稿日期：２０１２－０４－０７ 修回日期：２０１２－０７－２８
基金项目：安徽省自然科学基金重点项目（ＫＪ２０１０Ａ１１６）［Ｓｕｐｐｏｒｔ ｂｙ Ｋｅｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（ＫＪ２０１０Ａ１１６）］
作者简介：马娅萍（１９８５－），女，山东潍坊人，硕士研究生，从事烟草ＶＢ６ 代谢方面的研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｓｄｍｙｐ２００７＠１２６．ｃｏｍ。
＊通讯作者：张剑韵，博士，教授，主要从事维生素学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｊｉａｎｙｕｎ２１８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。
酯的酶，在生物磷代谢中起着重要作用（Ｄｕｆｆ等，
１９９４）。Ｍａｒｇａｒｅｔ（１９９２）从人体红细胞中纯化出
ＰＬＰ－磷酸酶，证实其为一种酸性磷酸酶，参与人体
中ＰＬＰ的代谢调控。ＰＬＰ作为重要的功能型ＶＢ６，
在生物体内其含量受到严格调控，磷酸吡哆醛水解
酶是其关键性代谢调控酶，这对生物体内生理功能
有条不紊的进行非常重要（Ｇａｏ等，１９９４）。目前，在
哺乳动物（Ｌａｗｒｅｎｃｅ等，１９７５）和细菌（Ｍａｓａａｋｉ等，
２００５）中对磷酸吡哆醛水解酶均有研究，而植物体内
磷酸吡哆醛的水解代谢尚不明确。烟草作为一种模
式植物，广泛用于植物生理生化研究。本文以烟草
为材料，对磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化和酶
学性质分析，以期为磷酸吡哆醛水解酶的进一步研
究和应用提供依据。同时，也为烟草体内磷酸吡哆
醛代谢调控机制的研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１材料和主要试剂
烟草鲜叶（实验室栽培，品种为云烟２１）。磷酸
吡哆醛（ＰＬＰ）、磷酸吡哆胺（ＰＭＰ）、二硫苏糖醇
（ＤＴＴ）、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、对硝基苯磷酸二钠
（ｐＮＰＰ）、柠檬酸、柠檬酸三钠等均购自上海生物工
程公司（Ｓａｎｇｏｎ）。
１．２烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化
称取烟草鲜叶１５０．０ｇ，组织捣碎机捣碎，按固
液比１∶２的比例加入预冷的缓冲液Ⅰ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ
柠檬酸－柠檬酸三钠缓冲液，ｐＨ５．５，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＭＳＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５０％甘油），４℃、８ ０００ｒ／
ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。将粗酶液的
（ＮＨ４）２Ｓ０４ 饱和度调到４０％，４℃下搅拌１ｈ，相同
温度下８ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清液继续加入
（ＮＨ４）２Ｓ０４ 至６０％的饱和度，相同条件离心。目的
蛋白存在于饱和度为４０％～６０％的（ＮＨ４）２Ｓ０４ 沉
淀中，用１０ｍＬ缓冲液Ⅱ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸－柠
檬酸三钠缓冲液，ｐＨ５．５，０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、２
ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２、５０μｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ）悬浮沉淀。将
重悬液上样于ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ离子交
换柱中（柱长３００ｍｍ，直径２０ｍｍ），用缓冲液Ⅱ和
ＮａＣｌ（０～０．６ｍｏｌ／Ｌ）进行连续梯度洗脱，洗脱速度
为２．０ｍＬ／ｍｉｎ，收集具有酶活性的洗脱液放入透
析袋中，于４℃用缓冲液Ⅰ透析，每４ｈ更换１次透
析液。将透析后的酶液用聚乙二醇（２００００）浓缩，上
样于Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤柱中（柱长５００ｍｍ，
直径２０ｍｍ），用缓冲液Ⅱ进行洗脱，洗脱速度为
０．３５ｍＬ／ｍｉｎ，收集具有酶活性的洗脱液放入透析
袋中，于４℃用缓冲液Ⅰ透析，每４ｈ更换一次透析
液。将透析后的酶液用聚乙二醇（２００００）浓缩，上样
于ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５离子交换柱中（柱长６００ｍｍ，
直径１２ｍｍ），用缓冲液Ⅱ和ＮａＣｌ（０～０．６ｍｏｌ／Ｌ）
进行连续梯度洗脱，洗脱速度为０．５ｍＬ／ｍｉｎ，最后
收集具有酶活性的洗脱液。
１．３磷酸吡哆醛水解酶酶活性的测定
酶活性测定参考 Ｍａｒｇａｒｅｔ（１９９２）的方法，略作
修改。反应体系３ｍＬ，添加０．２ｍＬ 酶液，０．２
ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＬＰ，４ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ５．５柠檬酸－柠檬酸三钠缓冲液在３７℃下反应
１５ｍｉｎ，３９１ｎｍ下测定吸光度。酶活力单位（Ｕ）定
义为每分钟每毫克蛋白消耗ＰＬＰ的纳摩尔数。
１．４蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度测定采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）的方法，
以牛血清白蛋白为标准蛋白。
１．５磷酸吡哆醛水解酶纯度和分子量测定
采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤
层析测定其分子量（Ｇａｂｒｉｅｌ，１９７１）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝
胶电泳分离胶浓度为１２％，浓缩胶浓度为４％。
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶过滤以牛血清白蛋白 （６７
ｋＤａ）和溶菌酶（１４．７ｋＤａ）为标准蛋白。
１．６磷酸吡哆醛水解酶部分性质的测定
１．６．１酶的最适温度和最适ｐＨ 分别在ｐＨ５．５，３７
℃条件下测定烟草磷酸吡哆醛水解酶在不同温度
（２０～８０℃，间隔１０℃）和不同ｐＨ 值（４．０～７．０，
间隔ｐＨ０．５）条件下的酶活力。以最适条件下的酶
活力作为１００％，其余测得酶活力与之相比为相对
酶活力。
１．６．２酶的温度稳定性和ｐＨ稳定性 将酶液分别
放置于不同温度（２０～８０℃，间隔１０℃）及不同ｐＨ
值（４．０～７．０，间隔ｐＨ０．５）条件下，每隔５ｍｉｎ，测
定酶液的酶活力。温度稳定性以３７℃下的酶活力
为１００％，ｐＨ 稳定性以反应体系中缓冲液ｐＨ５．５
时测得的酶活力作为１００％，其余测得的酶活力用
相对酶活力表示。
１．６．３化学试剂对烟草磷酸吡哆醛水解酶酶活性的
影响 测定不同化学试剂（二价阳离子，金属离子螯
合剂等）对烟草磷酸吡哆醛水解酶酶的促进或抑制
作用 （Ｄｊａｒｙ 等，２０１０）。分别添加 １ ｍｍｏｌ／Ｌ、４
１１７５期 马娅萍等：烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征
ｍｍｏｌ／Ｌ的化学试剂于反应体系中，在 ３７ ℃，
ｐＨ５．５缓冲液中反应１５ｍｉｎ，测定酶活力。等量酶
液与不加金属离子的该缓冲液混合作为对照组。
１．６．４底物特异性及酶反应动力学参数 底物特异
性及酶反应动力学参数的测定采用 Ｈｅｉｎｏｎｅｎ ＆
Ｌａｈｔｉ（１９８１）的方法。底物特异性：测定不同化学试
剂（ｐＮＰＰ、磷酸苯基二钠、ＡＴＰ、ＦＭＮ、焦磷酸钠、植
酸钠、ＰＬＰ、ＰＭＰ、ＰＮＰ）作为底物时的酶活力，并予
以比较。酶反应动力学参数 Ｋｍ 测定：配制不同浓
度的底物（ＰＬＰ和ＰＭＰ）溶液，分别与酶液在酶活测
定条件（３７ ℃，ｐＨ５．５）下反应，采用 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅ
（１９３４）的双倒数法确定其Ｋｍ 值。
表１ 烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
处理
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
总活力 （Ｕ）
Ｔｏｔａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
总蛋白 （ｍｇ）
Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
比活力 （Ｕ／ｍｇ）
Ｓｅｐｅｃｉｆｉｖ ａｃｔｉｖｉｔｙ
纯化倍数
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ
得率 （％）
Ｙｉｅｌｄ
粗酶液Ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ３８９６．９６ ４２０ ９．２８ １．０ １００
硫酸铵沉淀 Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
３７０３．８０ ６３．６ ５８．２４ ６．２８ ９５．０４
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ． ２３３２．９１ ８．４ ２７７．７３ ２９．９３ ５９．８７
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ １４１０．７２ １．７ ８２９．８４ ８９．４４ ３６．２０
ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５ １１１０．０９ １．０ １１１０．０９ １１９．６４ ２８．４９
图１ 磷酸吡哆醛水解酶纯化的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ．蛋白 Ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；１．粗酶液样品Ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ；２．ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．；３．Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００；４．ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５．
２ 结果与分析
２．１酶的分离纯化
烟草磷酸吡哆醛水解酶采用硫酸铵沉淀、ＤＥ－
ＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－
１００凝胶过滤和ＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５阳离子交换柱层
析分离纯化后，所得到的纯化倍数和得率等相关参
数见表１。
２．２分子量测定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表示纯化的酶蛋白为单一区带，亚
基分子量约为２５ｋＤａ（图１）；经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝
胶过滤测得酶分子量为４９．６ｋＤａ（图２）。结果显示
图２ 磷酸吡哆醛水解酶的凝胶层析分离图
Ｆｉｇ．２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
Ａ．牛血清白蛋白６７ｋＤａ；Ｂ．溶菌酶１４．７ｋＤａ；Ｃ．目的蛋白。
Ａ．Ｂｏｖｉｎｅ ａｌｂｕｍｉｎ ６７ｋＤａ；Ｂ．Ｌｙｓｏｚｙｍｅ
１４．７ｋＤａ；Ｃ．Ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．
烟草磷酸吡哆醛水解酶由两个相同的亚基组成。
２．３磷酸吡哆醛水解酶的部分性质研究
２．３．１酶促反应的最适温度和温度稳定性 反应
缓冲液ｐＨ５．５，在２０～８０℃下测定酶活力，该酶的
最适温度为５０℃（图３）。酶液在２０℃、３０℃和４０
℃保温 ３０ ｍｉｎ 后，残留活力分别为 ９８．３７％、
９８．５０％和９９．３３％，保温１ｈ，残留活力分别为
９３．４７％、９５．１３％和９６．９８％；在５０℃保温３０ｍｉｎ
后，残留活力为 ５９．８４％，１ｈ 后残留酶活力为
４７．９３％；在６０℃、７０℃和８０℃保温３０ｍｉｎ后，残
留活力分别为５２．６６％、２１．４３％和１８．１８％，１ｈ后，
活力 分 别 为 初 始 活 力 的 ４７．８３％、１３．２７％ 和
０．０９％。
２１７ 广 西 植 物 ３２卷
图３ 温度对酶活性的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
图４ ｐＨ值对酶活性的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｉ－
ｄｏｘａｌ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
２．３．２酶促反应的最适ｐＨ和ｐＨ稳定性 ３７℃条
件下，在ｐＨ４．０～７．０反应缓冲液体系中测定酶活
力，该酶的最适ｐＨ为５．５，且在ｐＨ ５．０～６．０范围
内酶活力较大（图４）。ｐＨ值５．０和６．０范围内酶
活力较为稳定，３０ｍｉｎ后酶活力仅分别下降了
８．６８％和９．９８％，而在ｐＨ值４．０和７．０条件下，酶
活力下降较大，分别下降了１６．９６％和１７．８３％。
２．３．３化学试剂对酶活性的影响 （１）金属离子对
酶活性的影响：二价阳离子和金属离子螯合剂对酶
活性具有不同程度的促进和抑制作用（表２）。其中
４ｍｍｏｌ／Ｌ的 Ｍｇ２＋ 催化作用最强，其次是 Ｃａ２＋、
Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋和Ｃｕ２＋。ＥＤＴＡ对磷酸吡哆醛水解酶
酶活性具有抑制性，加入 Ｍｇ２＋后抑制作用得到解
除。（２）化合物对酶活性的影响：反应产物（磷酸三
钠和 ＰＬ）对酶活性具有很强的抑制性，ＡＴＰ和
ｐＮＰＰ也具有较强的竞争性抑制作用（表４）。且对
于大部分化合物（钼酸钠和碘乙酸钠除外）来说，高
浓度（４ｍｍｏｌ／Ｌ）比低浓度（１ｍｍｏｌ／Ｌ）具有更明显
的抑制作用。
表２ 二价阳离子和金属离子螯合剂对酶活性的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ
ａｇｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｃｉｄ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
试剂
Ｒｅａｇｅｎｔ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
相对活性
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
（％）
Ｃｏｎｔｒｏｌ ０ １００±１．０
Ｃｕ２＋ １ １１０．５±１．８
４ １２１．６±２．８
Ｚｎ２＋ １ １３８．９±２．４
４ １５０．６±１．５
Ｍｎ２＋ １ １５６．８±３．０
４ １５９．７±３．８
Ｃａ２＋ １ １７３．７±２．２
４ １６９．４±３．５
Ｍｇ２＋ １ ２１１．６±２．２
４ ２３８．４±２．３
ＥＤＴＡ １ ８１．０±３．０
４ ６６．３±２．０
ＥＤＴＡ＋ Ｍｇ２＋＊＊ １ １８９．５±２．８
４ １７２．５±３．０
＊＊表示实验组添加的ＥＤＴＡ和 Ｍｇ２＋为同一标注浓度。
＊＊Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ａｄｄｅｄ ＥＤＴＡ ａｎｄ Ｍｇ２＋ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ
ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
表３ 不同化合物对酶活性的抑制作用
Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
化合物
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
相对活性
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
（％）
Ｃｏｎｔｒｏｌ ０ １００±１．０
氟化钾 １ ５４．３±１．７
４ １４．０±１．０
钼酸钠 １ ３．０±０．３
４ ４．９±０．５
碘乙酸钠 １ ７６．８±１．０
４ ８８．７±０．８
咪唑 １ ９０．１±１．３
４ ８６．９±１．３
磷酸三钠 １ １８．８±１．０
４ １５．５±１．３
ＰＬ １ １９．１±０．８
４ １１．５±１．０
ＡＴＰ １ ２８．７±０．７
４ ２４．４±１．０
ｐＮＰＰ １ １．７±１．０
４ １．５±０．８
２．３．４底物特异性及酶反应动力学参数的测定
（１）底物特异性：由表４可见，ｐＮＰＰ、磷酸苯基二钠、
３１７５期 马娅萍等：烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征
ＡＴＰ、焦磷酸钠和ＰＬＰ作为底物时，磷酸吡哆醛水
解酶表现出较强的酶活性，而ＦＭＮ、植酸钠和ＰＭＰ
作为底物时，该酶具有相对较小的催化活性。（２）烟
草磷酸吡哆醛水解酶的酶反应动力学参数 Ｋｍ 测
定：在３７℃，ｐＨ５．５条件下，采用Ｌｉｎｅｖｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ
作图法，以ＰＬＰ和ＰＭＰ为反应底物，测得其Ｋｍ 值
分别为０．２３ｍｍｏｌ／Ｌ（图５）和０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ（图６）。
表４ 烟草磷酸吡哆醛水解酶的底物特异性
Ｔａｂｌｅ ４ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｃｉｄ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
底物Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ 相对活性 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）
ｐＮＰＰ １００±１．０
磷酸苯基二钠 ８８．６±０．７
ＡＴＰ ９３．９±１．３
ＦＭＮ ３９．２±２．０
焦磷酸钠 ９８．５±１．７
植酸钠 ２．９±１．０
ＰＬＰ ６１．３±１．３
ＰＭＰ ２９．６±１．７
图５ 以ＰＬＰ为底物时的Ｋｍ值
Ｆｉｇ．５ Ｋｍ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＰＬＰ ａｓ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
３ 结论与讨论
本文采用硫酸铵沉淀、离子交换柱、凝胶过滤柱
层析等分离纯化技术对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行
了纯化，纯化出的酶为双亚基结构，亚基分子量约为
２５ｋＤａ。该酶最适温度为５０℃，与高亚朋等（２０１１）
和陆珊（２００６）的研究报道相似。植物酸性磷酸酶的
最适ｐＨ一般低于６．０（Ｃａｒｍｅｎ，１９９８；Ｍａｒｉｕｓｚ等，
１９９７）。本实验测得烟草磷酸吡哆醛水解酶的最适
ｐＨ为５．５。
研究结果还表明，Ｃｕ２＋和Ｚｎ２＋对烟草磷酸吡哆
图６ 以ＰＭＰ为底物时的Ｋｍ值
Ｆｉｇ．６ Ｋｍ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＰＭＰ ａｓ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
醛水解酶的激活作用较弱，而 Ｍｇ２＋对酶的激活作
用最强。Ｍｇ２＋可能与ＰＬＰ中的磷酸基团结合形成
Ｍｇ·ＰＬＰ复合物，再参与酶的催化反应。金属离
子螯合剂ＥＤＴＡ对烟草磷酸吡哆醛水解酶有抑制
作用，加入 Ｍｇ２＋后，ＥＤＴＡ的抑制作用解除，这可
能是 Ｍｇ２＋与ＥＤＴＡ之间存在竞争或拮抗作用。
另外，烟草磷酸吡哆醛水解酶可以水解多种底
物（ｐＮＰＰ、磷酸苯基二钠和 ＡＴＰ等）。以ＰＬＰ和
ＰＭＰ作为底物，酶的Ｋｍ 值分别为０．２３ｍｍｏｌ／Ｌ和
０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ。结果表示烟草磷酸吡哆醛水解酶更
容易催化ＰＬＰ的水解。
参考文献：
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（下转第６０９页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ６０９）
４１７ 广 西 植 物 ３２卷
白色或淡黄色，近辐状，花冠筒极短，花冠裂片卵状
长圆形或长圆状披针形，长约３ｍｍ，宽约１ｍｍ，顶
端略钝；副花冠双轮，着生于合蕊冠上，外轮成环状
或杯状，膜质，具５稜，顶端截平或短５裂，内轮为５
裂片，远比外轮为长，裂片扁平，长圆状，基部被外轮
的副花冠所包围；花药顶端的膜片直立；花粉块下
垂，基部弯；柱头短圆锥状，平头。蓇葖披针状圆柱
形，长约１５ｃｍ，直径约１ｃｍ，外果皮薄而平滑；种子
阔卵形，扁平，长约３ｍｍ，宽约２ｍｍ，顶端的白色
绢质种毛长约２ｃｍ。花期２～１１月，果期冬季至翌
年春季。
广西（Ｇｕａｎｇｘｉ）：北海市，合浦县，沙田镇，英罗
港，海边沙地，路边灌木丛，罕见，海拔１ｍ，２０１１年
１月１３日，黄俞淞、林春蕊等Ｈ１１０１０１（ＩＢＫ）；同地，
２０１１年５月１４日，黄俞淞、林春蕊等Ｙ０３５４（ＩＢＫ）。
分布：海南；印度、缅甸、尼泊尔、泰国和越南亦
有分布。为广西首次记录。
野外调查发现，近年来广西海岸带生物资源与
环境受人类活动影响严重，尤其是围垦养殖使红树
林大面积锐减（范航清，２０００），一些海岸带生物衰退
甚至面临灭绝威胁。本次调查发现的肉珊瑚只分布
于合浦县沙田镇英罗港海边沙地灌木丛中，缠绕在
打铁树 Ｍｙｒｓｉｎｅ ｌｉｎｅａｒｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｐｏｉｒ．和变叶裸实
Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒｉａ ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ Ｍａｘｉｍ．植株上，其它伴
生植物主要有无根藤Ｃａｓｓｙｔｈａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ Ｌ．、牛眼
睛Ｃａｐｐａｒｉｓ ｚｅｙｌａｎｉｃａ Ｌ．、青皮刺Ｃ．ｓｅｐｉａｒｉａ Ｌ．、
露兜树Ｐａｎｄａｎｕｓ ｔｅｃｔｏｒｉｕｓ Ｓｏｌａｎｄ．、仙人掌Ｏｐｕｎ－
ｔｉａ ｓｔｒｉｃｔａ（Ｈａｗ．）Ｈａｗ．ｖａｒ．ｄｉｌｌｅｎｉｉ（Ｋｅｒ Ｇａｗｌ．）
Ｌ．Ｄ．Ｂｅｎｓｏｎ、光 叶 柿 Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｄｉｖｅｒｓｉｌｉｍｂａ
Ｍｅｒｒ．ｅｔ Ｃｈｕｎ、鹊肾树Ｓｔｒｅｂｌｕｓ ａｓｐｅｒ Ｌｏｕｒ．、毛马
齿苋 Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｐｉｌｏｓａ Ｌ．、白鼓钉 Ｐｏｌｙｃａｒｐａｅａ
ｃｏｒｙｍｂｏｓａ（Ｌ．）Ｌａｍ．等。值得关注的是，这次发现的
肉珊瑚其个体数量稀少，且生长在路边，周边地区正
在实施工程建设，随时可能因此而被铲掉、消失。
肉珊瑚是绿色、无叶、肉质的藤本植物，形态独
特，其花序聚伞状，花朵晶莹漂亮，且花期长，具有较
高的观赏价值。此外，肉珊瑚全株可供药用，具有收
敛、止咳、催乳等功效（吴征镒，１９９０；Ｇａｎ，２００５）。
建议开展肉珊瑚的迁地保存或园艺、药用栽培利用，
重视与加强海岸带生物多样性保护研究。
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檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴
２０２
（上接第７１４页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ７１４）
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ
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Ｃｈｅｍ，２２：１５ ９７８－１５ ９８３
Ｍａｒｉｕｓｚ Ｏ．１９９７．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ｐｈｏｓ－
ｐｈａｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｙｅｌｏｗ ｌｕｐｉｎ（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，１０５：１ ３０１
Ｍａｓａａｋｉ Ｔ，Ｋｅｉｋｏ Ｉ，Ｔａｔｓｕｏ Ｈ．２００５．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ－５′－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ
［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，６９（１２）：２ ２７７－２ ２８４
９０６５期 刘杰恩等：广西萝藦科一新记录属———肉珊瑚属