全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(5)：671—674 2008年 9月
杜仲细胞悬浮培养生产绿原酸的初步研究
王亚琴，叶青华，朱 媛
(华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 510640)
摘 要：对影响杜仲细胞悬浮培养及其次生代谢物绿原酸产生的几种主要因子进行了研究。结果表明，在杜
仲细胞悬浮培养生产绿原酸的过程中，第 15天绿原酸的含量达到最大值。35 g／L的蔗糖为最适碳源，MS培
养基为最适悬浮培养基，pH为 5．3时利于绿原酸的合成，2，4一D、NAA对绿原酸合成的促进效果不大，添加
1．0 mg／L的6-BA绿原酸的合成效果较好。
关键词：杜仲；细胞悬浮培养；绿原酸；影响因子
中图分类号 ：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2008)05—0671—04
Preliminary study 0n the cell suspension culture
of Eucommia ulmoides and secondary
metabolite-chlorogenic acid
Ⅵ NG Ya_Qin，YE Qing-Hua，ZHU Yuan
(College of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 5 10640，China)
Abstract：Some major factors affected the cell suspension culture of Eucommia ulmoides and the production of chloro—
genic acid were investigated．The results showed that the concentration of chlorogenic acid was the highest on 15th
day，sucrose was better than glucose and maltose for cell growth and chlorogenic acid synthesis and the optimum con—
centration was 35 g／L．The optimal media was MS media and the proper pH value was 5．3．Some exogenous hor—
mones such as 2，4-D and NAA had little effect on chlorogenic acid synthesis，but 1．0 mg／L 6-BA could promote the
production of chlorogenic acid．
Key words：Eucommia ulmoides；cell suspension culture；chlorogenic acid；factors
随着生物技术的发展，应用植物细胞培养发酵生
产药用物质正发展成为一门新型的产业体系。在植
物细胞培养中，影响细胞生长和次生代谢物形成的因
子如植物激素、气体成分、光照和培养基成分等在水
母雪莲、三七、人参和红豆杉中多有研究(孑L祥海，
2005；唐建军等，1998)，但在药用植物杜仲中很少报
道。杜仲(Eucommia ulmoides)是重要的中药材，其
药用成分包括绿原酸、桃叶珊瑚甙、总黄酮等。其中，
绿原酸(Chlorogenic acid，以下简称 Cha)是一种重要
的生物活性物质，具抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝
利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中
枢神经系统等作用，它是许多中药材的有效成分之
一
，又是某些成药的质量指标。其应用非常广泛，主
要为医药、日用化工和食品行业。绿原酸主要存在于
杜仲叶、皮中，含量较低，提取量有限，并存在农药残
留和重金属残留等问题，因此，目前多采用组织培养
技术，在组织和细胞水平上促进绿原酸的生物合成。
本文对影响杜仲细胞悬浮培养及其次生代谢物绿原
酸形成的几种主要因子如碳源、培养基、pH、激素等
进行研究，初步得出生产绿原酸的优化条件，为通过
收稿日期：2006—12—24 修回日期：2007-06—26
基金项目：广州市科技计划项目(2004J1一C0231)；广东省国际合作项目(20041350201021)[Supported by the Funds of Science and Technology Project of
Guangzh0u(20。4J1一C0231)；the Funds of International Cooperation Project of Guangdong Pro~nce(2004BS0201021)]
作者简介：王亚琴(1972一)，女，山西忻州人，博士，讲师，从事植物基因工程与生物制药等研究，(E—mail)yqwang@scut．edu．en。
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细胞培养大规模生产次生代谢物绿原酸奠定了基础。
1 材料和方法
1．1实验材料
供试材料为采 自广东乐昌县杜仲基地的种子。
1．2愈伤组织的诱导
杜仲愈伤组织由杜仲种子萌发的无菌苗真叶诱
导。诱导的愈伤组织接种于含有 2O mL B5(附加
0．5 mg／L 2，4一D、0．5 mg／L 6-BA和 20 g／L蔗糖)
固体培养基的 50 mL三角瓶中。置于 GXZ型智能
光照培养箱中(25±2℃)培养，光照 10 h／d、黑暗
14 h／d，光照强度 72／~mol·m。·s- 。愈伤组织每
15～2O d继代 1次，经过半年的驯化培养得到无性
细胞系。
1．3细胞悬浮培养体系的建立
将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转
移到液体培养基中，置于摇床中进行悬浮培养，摇床
转速为 110 r／rain，培养温度 25±2℃，全天光照，光
照强度72 mo1．m-。·s～。培养 2～3周后，培养液
中即有悬浮单细胞或小细胞团出现。继代培养时，
加入等量的新鲜培养液，摇匀，稍静置，待大细胞团
沉降后分瓶，不需过滤，即可得到不含大细胞团块的
培养物。这样通过 3～4次继代培养，即可得到只含
单细胞或小细胞团的培养物。
1．4悬浮细胞生长的测定
悬浮培养细胞经尼龙网过滤，蒸馏水洗涤 3次，
抽滤去表面水分，称量鲜样质量 Fw(g／L)，50℃烘
干后称量干样质量 DW(g／L)。细胞增长率一(收
获细胞量一接种细胞量)／接种细胞量×100 。
1．5悬浮细胞培养物中绿原酸含量的 HPLC法测定
参考杨小梅等(2003)的方法。样品准备：将收集
的杜仲于细胞置于 i00“1L锥形瓶中，加人 5O 9／6甲醇
40 mL，密封后称量，超声处理 6O min，放至室温，用
5O 甲醇补充至4O mL，摇匀，过滤，取滤液用 0．22 m
微孔滤膜过滤，滤液供 HPI￡分析用。HPLC条件：流
动相 乙腈 ：0．1 磷酸=15：85，流速 l1 0 mL／min，柱
温25℃，进样体积 2O L，检测波长 327 rlin，色谱柱
XDB-CI8 Analytical 4．6×250 mm 5—1V~cron。
2 结果与分析
2．1杜仲悬浮细胞生长曲线与绿原酸含量的变化
在相同的培养条件下，分别于第 3～21天每3 d
随机抽取 6瓶培养物，测定培养细胞的干重和其中
绿原酸的含量，结果见图 1。由图 1可知，杜仲悬浮
培养细胞生长曲线基本为S型，经历了4个阶段：迟
滞期、快速生长期、生长平衡期和衰亡期。在培养前
期，绿原酸的含量随细胞增长而逐渐增加，第 15天
时达到最大含量。基于本研究目的是为了获得高产
量的次生代谢物绿原酸，因此，宜选取生长到第 l5
天时的细胞作为种子液。
14
12
10
8
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4
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图 1 杜仲悬浮细胞生长曲线和绿原酸含量变化曲线
Fig．1 Growth curve of suspension cell and chlo～
rogenic acid content curve of Eucommia uhnoides
1 2
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图 2 碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量的影响
Fig．2 Effect of different carbon sources on
the growth of suspension cell and content of
chlorogenic acid of Eucommia ulmoides
2．2碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量的影响
2．2．1不同碳 源对杜仲 悬浮细胞生长和绿原酸含量
的影响 糖类是影响植物组织培养成功与否的关键
之一，糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和
生长量，而且影响其代谢水平和次生代谢物的合成
(韩建萍等，2003)。本实验比较了蔗糖、葡萄糖、麦
芽糖等不同碳源对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量
的影响，其中不同碳源的浓度为 20 g／L。由图 2可
知，无论是细胞生长还是绿原酸的积累，蔗糖作为碳
源最为合适。

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加 1．0 mg／L的 6-BA绿原酸的合成效果较好。
3 讨论
影响悬浮细胞培养物中次生代谢物含量的因素
很多，如外植体种性、生育状态、培养方法、培养条件
等内外因素。内在因素主要指物种的特性，外界因素
主要是培养条件如培养基类型、碳源、pH、激素等，这
些均能显著影响细胞培养过程中次生代谢物的累积。
本实验结果表明杜仲细胞生长量最大的培养基配方
其绿原酸的积累量不一定最大，N6培养基更利于细
胞生长，而 MS培养基更有利于绿原酸的合成。由此
可见，适合细胞生长的培养基不一定利于次生代谢物
的累积，这与吴晓玲等(2005)、曹孟德等(2002)对黄
芩、香荚兰细胞培养的研究结果一致。就杜仲细胞培
养而言，应采用两步培养法，前期细胞增殖用 N6培
养基，绿原酸积累应采用 MS培养基。
表 1 外源激素对杜仲悬浮细胞生长和绿原酸含量的影响
Table 1 Effect of exogenous hormone on the growth
of suspension cel and content of chlorogenic
acid of Eucommia ulmoides
2，4-D
2．4一D
2，4-D
2，4-D
NAA
NAA
NAA
NAA
6一BA
6一BA
6一BA
6一BA
5．8
10．3
5．8
4．9
5．3
9．4
5．8
3．7
12．6
7．0
10．1
2．5
CH—concentrationof hormone l DWC-dry weight of the cell；CCA
concentration of chlorogenic acid．
培养基的pH值作为细胞悬浮培养的重要因素
对细胞生长及次生代谢物的合成起重要作用，这是
因为培养基的酸碱度对培养基中各种营养成分(如
Fe盐中的铁离子等)的活性有直接影响，进而影响
细胞对其的吸收利用。实验表明，pH值对绿原酸
的合成影响较大，当pH值为 5．3时，绿原酸的含量
最大。
细胞悬浮培养过程中，细胞生长曲线大多为 S
形(阮茜等，1999)，各时期乃至整个生长周期的长短受
到植物种类、起始细胞密度、营养成分种类与配比等多
种因素影响。吴晓玲等(2005)报道黄芩的细胞培养周
期为9 d，而红豆杉细胞培养周期从 12～18 d不等
(Fett-Neto等，1994；Wickremesinhe& Arteca，1994；
Gibson等，1993)。本实验结果表明，杜仲悬浮培养细
胞生长曲线基本为 S型，经历了4个阶段：迟滞期、快
速生长期、生长平衡期和衰亡期。在培养前期，绿原
酸含量基本随细胞增长而逐渐增加，第 15天时达最
大含量，即培养周期为 15 d。与同是乔木的药用植物
红豆杉结果相近，适合大规模培养生产次生代谓 物绿
原酸。
外源激素常作为诱导和调节细胞生长的重要因
素而用于次生代谢产物的研究，其中生长素和细胞分
裂素的作用大不相同。一定浓度的外源激素可明显
促进细胞生长，同时会抑制次生代谢物的产生，如
NAA促进桔叶鸡眼藤悬浮培养物中蒽醌的产生，而
2，4一D则完全抑制蒽醌的合成(杨世海等，2005)。本
实验比较了三种不同浓度的外源激素 2，4一D、NAA
和6一BA对杜仲悬浮细胞生产绿原酸的影响，结果显
示 1．0 mg／L的 6-BA促使绿原酸合成的效果最好。
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摘 要：长效油菜素内酯TS303和二氢茉莉酸丙酯(PDJ)浸种能增强花生对低温的忍耐能力，二者显著降低低
温诱导的丙二醛含量和电解质渗漏率。低温降低超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及相对含
水量，但增加过氧化物酶(POD)活性以及可溶性糖和脯氨酸含量。TS3O3和PDJ以及它们的混合物 TNZ都能
延缓低温伤害引起的s0D和 CAT活性下降，并能通过增加可溶性糖和脯氨酸含量来提高相对含水量。TS303
在延缓SOD和CAT活性降低方面效果比PDJ好，但 PDJ在增加可溶性糖和脯氨酸含量方面效果比TS303强，
由于TS303和PDJ作用机理不同，二者混合使用表现出加成或协同效应。
关键词：油菜素内酯；二氢茉莉酸丙酯；花生；低温
(上接第 674页 Continue from page 674)
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