全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(3)：404— 407 2009年 5月
一 个水稻 OsWNK基因的分离及表达分析
王小兰r，刘顺枝 ，何光存2，田长恩1
(1．广州大学 生命科学学院 植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广州 510006；
2．武汉大学 生命科学学院 植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要 ：在褐飞虱取食后的水稻 cDNA差减文库 中筛选 到与拟南芥 AtWNK1激 酶基因高度 同源的 EST
(GenBank登录号：BU57231O)，以该EST为探针，从褐飞虱取食后的水稻 eDNA文库中分离到OsWNK基因
的全长eDNA，该基因编码一个含 677个氨基酸残基的蛋白激酶，与以前克隆出的一种拟南芥蛋白激酶基因
(GenBank登录号 ：DQ837532)只有 3个氨基酸残基的差异 。Northern杂交结果显示，在褐飞虱取食后 ，该基
因的表达上升。表明该激酶基因参与褐飞虱取食的应答反应，可能与水稻抗褐飞虱有关．
关键词 ：褐飞虱；OsWNK；cDNA筛选 ；水稻
中图分类号：Q966，Q786 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2009)03—0404—04
Isolation and expression an alysis
of an OsWNK gene in rice
WANG Xiao—Lan ，LIU Shun-Zhil，HE Guang-Cun2，TIAN Chang-En
(1．Guangzhou Key Laboratory for Functional Studies on Plant Stress-Resistant Genes，School of Life Sciences，
Guangzhou University，Guangzhou，510006，China；2．KeyLaboratory of the Ministry of Education for Plant
Developmental Biology，Colege of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：BPHiw008，an EST (expressed sequence tag)which is highly homologous with Arabidopsis WNK 1(with
nO lysine kinase)，has been screeded from the rice cDNA SSH library．Using this EST as probe to screen the cDNA
library induced by brown planthopper sucking，a ful length of cDNA with 2．4 Kb in size was isolated and named as
OsWNK．OsWNK is deduced to encode a 677一amino-acid protein OsWNK through BLAST．Only 3 amino-acid resi—
dues of OsWNK are different from those of AtWNK1．Result of RNA gel blot analysis showed that OsWNK was
up—regulated in brown planthopper—sucked rice，indicating that OsWNK may play a role in resistance to brown plan—
thopper of rice．
Key words：brown planthopper；OsWNK；cDNA screening；rice
褐飞虱 (brown planthopper)是一种严重 的农
业害虫，常引起水稻减产甚至绝 收(杨长举等，
1999)。随着环保意识的增强及对褐飞虱防治方法
的拓展，人们正在减少杀虫剂的用量，把更多的精力
放在培育抗虫水稻新品种和通过遗传工程手段提高
水稻的抗性方面，并取得了一定的效果。但培育出
的某些水稻新品种往往只在 2～3年内对褐飞虱表
现出较好的抗性，之后就会逐渐被褐飞虱适应，从而
成为褐飞虱危害的新对象。要有效地解决这个问
题，了解褐飞虱与水稻的互作机理是非常必要的。
蛋白激酶是一类胞内信使依赖的、在蛋白质磷酸化
过程中起中介和放大作用并帮助完成信号传递过程
的酶，广泛存在于植物和其他生物体内(Hanks，
1991)。植物中的蛋白激酶广泛参与了植物的抗病
收稿日期：2008—10—22 修回日期：2009—02—09
基金项目：广东省自然科学基金(05006754)[Supported byNatural Science Foundation ofGuangdongPr0vince(O5。O6754)]
作者简介；王小兰(1973一)，女．江西泰和县人，博士，主要研究方向为植物遗传学研究。
。通讯作者(Author for corespondence，E-mail：changentian@yahoo．com．en)
3期 王小兰等：一个水稻 WNK基因的分离及表达分析 405
与抗逆反应。WNKEwith no lysine(K)]激酶是一
种丝／苏氨酸蛋白激酶。Xu等(2000)在研究细胞外
信号调节蛋白激酶家族时从大鼠大脑 cDNA文库
中克隆了一种新的哺乳动物丝／苏氨酸蛋白激酶基
因，并命名为 wNK 1。Verissimo Jordan(2001)
发现人体中也含有一系列与大鼠 WNKI激酶具有
同源催化结构域并具有相同特征的蛋白激酶，并成
功克 隆 到 了人 的 wNK1，wNK2，WNK3和
WNK4基因。
本研究组运用抑制性差减杂交法(sSH)鉴定了
100多个与水稻抗褐飞虱取食反应相关的差异表达
cDNA克隆(王小兰等，2005)。其 中，BpHiw008(登
录号：BU572310)与拟南芥 中的一个 wNK激酶基
因 AtWNK1(GenBank登录号 ：DQ837532)相似性
最高，故推测该克隆可能编码水稻中的一个 WNK
激酶。已有的研究表明，哺乳动物中的 WNK激酶
参与调节 细胞间的离子转运过程 (Gamba，2005)。
而关于植物 WNK激酶的研究则主要集中在拟南
芥，其 WNK激酶被证明参与昼夜节律的调控以及
和V ATPase C亚基的互作(Murakami—Kojima等，
2002；Hong—Hermesdorf等，2006)。但 是 ，水 稻
WNK激酶的功能目前还不是很清楚，关于该激酶
在植物抗虫等反应中所起作用的研究则未见报道。
本研究旨在克隆鉴定水稻中该基因的全长 cDNA
序列，分析其在水稻中的表达特性，为进一步研究其
在植物抗虫与抗逆反应中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1 B5 cDNA文库 褐飞虱2—3龄若虫取食 B5
cDNA文库由王小兰构建(王小兰，2003)。
1．1．2工具酶及试剂 DNA序列分析试剂盒以及
[弛P]一dCTP均购自Perklin—Elmer公司。T 和 T7
通用引物由上海生物工程公司合成。TRlzol试剂
购自Gibcol公司。氨苄青霉素等均为国产针剂，其
它试剂均为分析纯。
1．1．3水稻材料 选用来源于栽培稻与药用野生稻
(Oryza officinalis Wal ex Watt)间杂交后代的一
个高抗褐飞虱的稳定品系B5(王小兰，2003)为研究
对象。
1．1．4褐飞虱 实验中所用的褐飞虱均为发育至 2
～ 3龄的若虫。褐飞虱在武汉大学遗传所以台中 1
号饲养繁殖。
1．1．5探针 以王小兰(2003)构建的 B5材料抑制
消 减 杂 交 文 库 中 筛 选 得 到 的 BPHiw008
(BU572310)为探针，进行 cDNA文库的筛选。
1．2方法
1．2．1褐飞虱取食 选取发芽 良好的抗褐飞虱水稻
品系 B5种子 ，以每杯 2O粒 的密度播种于 10 cm×
10 cm的塑料杯中。待秧苗长至 3叶期时，按每株
1O头放入褐飞虱。
1．2．2总 RNA分 离 三叶期 的 B5在褐飞虱取食
48 h后，提取总RNA。总RNA采用 TRIzol试剂，
根据试剂盒说明书来提取 ，取 25 g的总 RNA在
1．2 甲醛变性胶上电泳 4 h后检测其完整性。
1．2．3 OsWNK cDNA 克隆的筛选 用 SSH 筛选
得到的抗褐飞虱相关基 因 BpHiw008(王小兰，
2003)，对噬菌体文库进行原位杂交，放射自显影后，
从膜中选出阳性的嗜菌斑区域，取出后进行第二轮
杂交，得到可能的纯化的阳性嗜菌斑，溶于 100 L
SM buffer，吸 1 L作模板进行 PCR扩增。对扩增
结果为两条带或以上的阳性嗜菌斑，进行第三轮杂
交，得到纯化的阳性嗜菌斑。
1．2．4阳性克隆的体内剪接 用灭菌的牙签挑取阳
性嗜菌斑后，再悬浮于 200 L SM缓冲液和2O L
氯仿中。取100 L阳性嗜茵斑与100 L XLI—Blue
(OD一1．0)和 0．5 L辅助噬菌体(>1×10 pfu／
L)在 37℃培养 15 rain后，再加入 3 mL LB一培养
基继续摇动孵育 3 h，细菌经 7O℃ 20 min灭活，含
有 pBlueseript质粒的上清再感染 SOLR宿主菌，在
含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
挑取单克隆继续在含氨苄青霉素的LB液体培养基
上扩大培养。
1．2．5 Northern blot 提取褐飞虱取食 (T)48 h和
未取食(C)的两叶一心时期的B5幼苗总 RNA，其
提取方法同1．2．2。BpHiW008全长cDNA的PCR
产物为探针，进行 Northern杂交分析，探针标记及
杂交方法参照何青等(2005)的方法。
2 结果
2．1 BpHiw008 cDNA克隆的筛选
以BpHiw008 EST作探针，对所构建的褐飞虱
诱导的B5 cDNA文库进行噬菌体原位杂交筛选，第
一 轮筛选时每皿储有噬菌体 30 000个左右，共有 3
406 广 西 植 物 29卷
张膜，在高强度条件下(1×SSC／0．1 SDS，15
min；0．5×ssc／0．1 SDS，15 rain)洗膜，从两张重
复的膜中挑选均出现的阳性噬菌斑，共有 1O个如图
1的第一次筛选结果中箭头所示的候选噬菌斑，其
杂交信号的强度和密度均大于周围背景的为阳性克
隆，用牙签将这区域噬菌体取出后，进行第二、三轮
筛选，每个斑对应一个平皿，每皿储 100个左右噬菌
体，洗膜条件同上，放射自显影结果如图 1所示。经
过三轮原位杂交，将挑选的单个噬斑 PCR检测，都
是一条带，说明经三次筛选后，基本上是纯化的单克
隆，且插入片段各不相同，选取插入片段较大的三个
阳性克隆，将这些阳性噬菌斑分别挑出后，进行体内
第一次筛选 第二次筛选 第三次筛选
图 1 eDNA文库的筛选
Fig．1 Screening of cDNA library
剪切，形成含有 wNK基因的大肠杆菌菌落。
2．2全长 eDNA的分离
挑取一个长约 2．6O kb已转化成质粒的cDNA
片段进行测序，发现这个 cDNA包含一个由 2031
个碱基编码的 677氨基酸残基的开放阅读筐(图
2)。将此测序产物进行蛋白质数据库(国际生物技
术信息中心，BLAST，http：／／www．ncbi．nlm．nih．
gov／)搜索，发现与拟南芥 WNK1(DQ837532)存在
99 的同源性。
2．3 Northern杂交结果分析
将对照及接虫 B5水稻植株的 RNA样品进行
电泳分离和转膜后 ，以 OsWNK 为探针进行 North—
ern杂交。结果如图 3示，可以看出在褐飞虱取食
后， wNK 的表达量高于对照，说明 OsWNK 可
能在水稻对褐飞虱的防卫反应中起作用。
3 讨论
褐飞虱是亚洲最严重的水稻害虫之一，除了对
水稻作物产生直接的伤害外，它还是水稻病毒病的
传播媒介(杨长举等，1999)。尽管取食植物韧皮部
的昆虫多种多样，但是植物抗性反应分子生理及抗
性机理信息却相 当匮乏。因此 ，本研究具有重要意
义。在长期的进化过程中，植食性昆虫与其宿主形
成了相互竞争、相互适应及相互制约的互作机制，植
物形成了多种能减轻因昆虫刺激所造成危害的防御
机制。由蛋白激酶所催化的蛋白磷酸化作用在这些
防御机制中起着重要作用，蛋白激酶因而广泛参与
了植物的抗病与抗逆反应(Shigemi等，2007)。与
其它蛋白激酶一样，WNK也具有激酶活性，且能够
自身磷酸化，是生物体内一种重要的信号调节酶，可
以被上游信号激活，并调控下游作用底物的活性，是
细胞生理过程中的重要调控子(Shigemi等，2007)。
我们发现，在抗虫水稻 B5中， WNK基因受褐飞
虱取食诱导而表达增强(图 3)。提示该基因的编码
产物可能参与水稻对褐飞虱取食所引起的胁迫和损
伤的反应，进而可能引发系列反应 ，基因表达的变化
产生直接或间接的抗虫效应。就我们所知，这是第 1
个关于OsWNK涉及水稻对褐飞虱的反应的报道。
至于褐飞虱取食后 OsWNK在信号传递过程中如何
起作用或是到底起没起作用还需要进一步研究。
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Il IK，I t L L cI11l L ctt ，l l“K 【ft rL IK r_1I L lI1t
图 2 水稻 wNK基因 cDNA的核苷酸序列
及推导的编码的氨基酸序列
Fig．2 The nuc1eotide sequence of C Vpr~K cDNA and
the deduced amin0一acid sequence encoded by this gene
BpHi柏08
r烈A
C T
一
图 3 BpHiwo08(0sWNK)在
褐飞虱取食后的水稻的表达
Fig．3 The expression of BpHiwOO8
(O wNK)in BPH fed rice
C．褐飞虱未取食的 B5植株的 RNA； 褐
飞虱取食的B5植株的RNA。
C．represented the RNA from the contr0】B5 plant
represented the RNA from the BPH B5 plant．
Murakami—K 0jima M，Nakamichi N，Yamashino r， Ⅱf．2OO2．
The APRR3 Component of the clock—associatedA PRRI／
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