全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(3)：329— 331 2008年 5月
藓类植物 RNA提取方法研究
闫苗苗1，魏光成 ，沙 伟2*，吕凤香2
(1．滨州医学院，山东 烟台 264003；2．齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘 要：根据提取 RNA质量等方面比较了 4种 RNA提取方法提取东亚砂藓正常生长和干燥处理后的组织的总
RNA的效果。结果表明改良的SDS法能提取高质量的RNA。该方法还可用于紫萼藓等藓类植物RNA的提取。
关键词：藓类 ；东亚砂藓 ；RNA；提取
中图分类号：Q94-3 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2008)03—0329—03
Study on extraction methods of
YAN Miao-Miao ，WEI Guang-Cheng ，SHA W ei ，Ln Feng-Xiang2
(1．Department ofBasic Medical Science，BinzhouMedical Colege，Yantai 264003，China；2．Department of
Biology，Colege of Life Science and Enginee~ng，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract：4 methods for RNA extraction from normal and dried Racomitri m japonicum tissues were evaluated upon
time consumption，yield and quality of RNA isolation．A modified SDS method was found tO be the best one among
the 4 methods evaluated．The method was found tO be also suitable for extracting RNA from bryophytes such as
Grimmia pilifera etc．
Key words：moss；Racomitriumjaponlcum；RNA；extraction
耐旱藓类植物强大而特别，甚至有极端的抗旱能
力，使耐旱藓成为研究抗旱机理和相关基因克隆的模
式植物。提取多种处理耐旱藓的高质量的总RNA是
进行点杂交、Northen杂交分析、I PCR和 cDNA文
库构建等许多分子生物学研究的必要前提。
藓类植物 RNA提取的难点在于藓类植物含有
较多的酚类、萜类等次生化合物(吴鹏程，1998)，在
匀浆的过程 中，酚类物质会释放出来，氧化后与
RNA稳定的结合，形成难溶的胶状物；同时萜类化
合物和 RNase会分别造成 RNA 的化学降解和酶
解。本文选用 的东亚砂藓 (Racomitrium japoni—
cure)经干燥处理后除酚类物质大量增加外，还有大
量的其它次生代谢物，使提取高质量的东亚砂藓
RNA变得更困难。本实验针对这些难题，对现有的
几种方法进行改 良，并在此基础上综合比较不同方
法对不同处理东亚砂藓中 RNA提取的效果，以期为
针对不同植物材料选择 RNA提取方法提供指导。
1 实验材料与方法
1．1实验材料
材料为采自五大连池的东亚砂藓，选取长势较
好的用蒸馏水洗净后进行培养，室温培养待其恢复
生长，对其进行不同时间的自然干旱处理后，迅速保
存于一8O℃冰箱中。
1．2实验方法
(1)Trizol RNA一步法：应用北京鼎国生物技
术有限公司生产的植物总 RNA提取试剂盒提取植
物总 RNA。
(2)改 良CTAB法：取 0．5 g材料，迅速放人一8O
收稿日期 ：2006—11-14 修回日期；2007—03—16
基金项 目：黑龙江省教育厅海外学人合作项目(1151hz022)[Supported by Overseas Scholar Cooperation Project of Education Department of Heilong]iang
Province(1151hz022)]
作者简介：罔苗苗(1981一)，女，山东省蓬莱市人，硕士研究生，助教 ，主要从事植物遗传方面的研究．
。通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：shwl129@263．net)
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33O 广 西 植 物 28卷
℃冷冻研钵中并加入适量 PVP，研成粉末；迅速转入
含有 2～6 mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液和 120
巯基乙醇的 1O mL离心管中，浸提 2O rnin；冷却
至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，4℃，
12 000 g，10 rnin；取上清，再加入等量的氯仿：异戊醇
(24：1)，混匀，4℃，12 000 g，10 min，并重复此步骤1
～ 2次；取上清，加 1／4体积 10 mol／L LiC1，-20℃，过
夜；4℃，12 000 r／rain，离心 15 Tnin；去上清，沉淀用2
tool／L LiC1洗涤；4℃，12 000 r／rain，离心 10 rnin；沉
淀溶于 DEPC处理水中，加入 1／1O体积的3 tool／L
NaAc(pH5．2)和 2．5倍体积的无水乙醇(-2O℃预
冷)，-80℃沉淀 1 h；4℃，12 000 r／rain，离心 15 rnin；
沉淀用75 乙醇清洗，干燥，适量DEPC处理水溶解，
用普通非变性琼脂糖凝胶检测其浓度、纯度和完整性
(曲桂芹，2001；侯义龙等，2003；Chang等，1993)。
(3)改良SDS法(Frederick等，1999)：1．5 mL的
无菌离心管中加 600 t．L SDS提取液，200 L水饱和
酚和4O L 巯基乙醇，65℃预热 5 min。取0．5 g材
料，迅速放人一8O℃冷冻的研钵中并加入适量的PVP
研成粉末，迅速分装于步骤(1)的离心管中，混匀后放
人 65℃水浴中浸提 15 min，期 间不时轻轻的颠倒混
匀。冷却至室温，依次加入 100 L 3 tool／L KAc，
150 L无水乙醇，混匀后加入 400 L氯仿混匀，4
℃，12 000 r／rain，离心 15 min。取上清液，加入等体
积的氯仿：异戊醇(24：1)混匀，4℃，12 000 r／rain，离
心 10 rnin；取上清，加 1／4体积 lO mol／L LiC1，一2O
℃，过夜；4℃，12 000 r／rain，离心 15 rnin；沉淀用
75 乙醇清洗，干燥，100 t．L DEPC处理水溶解；加入
1／10体积的3 mol／L NaAc(pH5．2)和2．5倍体积的
无水乙醇(一2O℃预冷)，一8O℃沉淀 1 h左右。4℃，
12 000 r／rain，离心15 min。沉淀用75 乙醇清洗，干
燥，适量DEPC处理水溶解，用普通非变性琼脂糖凝
胶检测其浓度、纯度和完整性。
上述提取过程除了浸提在65℃下进行外，其它
步骤均在冰浴条件下进行。
(4)Tris一硼酸法(略)：具体参照文献(史公军，
2004；Lpez& Lim，1992)。
1．3两种藓类植物总 RNA的纯化
提取的 RNA中经常有核 DNA的存在，为了防
止核 DNA干扰随后的 cDNA扩增，必须对其进行
DNaseI处理，彻底除去 RNA中的 DNA。程序如
下：(1)将下列成分混合，37℃水浴 30 min；RNA：
约 5O～8O pig；DNaseI(1o U／t~L)：2 t．LL；10×buff—
er：lO t．LL~25 mmol／L MgC12：4 t-LL~RNaSe inhibitor
(40 U／t~L)：0．5 L；加水补足 100 t-L~(2)加等体积
的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，立即放冰上 10 rain~4
℃，12 000 g，10 min；(3)取上清，加 1／lo体积 3
mol／L NaAc，2倍体积无水乙醇，-70℃ 1 h；4℃，
12 000 g，5 min；(4)去掉上清液，75 乙醇洗沉淀，
晾干，适量的 DEPC处理水溶解，用普通非变性琼
脂糖凝胶检测纯度、浓度和完整性，-20℃保存。
1．4反转录和 RT-PCR实验
在 eDNA第一链的合成过程中，本实验用了
M-MLV反转录酶来 自于鼠源 ，所用 的锚定 引物为
T13A。具体步骤按试剂盒说明提示的方法进行，但
转录时间由 30 min增加到 2 h。然后用不同方法提
取的总 RNA为模板合成 eDNA，利用相同锚定引
物 ，随 机 引 物 (HAP28 AAGCTTACGATGC)和
Taq酶等进行 PCR反应，通过合成的片段数量间接
检测所提取的总 RNA质量。
2 实验结果分析
2．1 RNA质量分析
Trizol试剂一步法是一种常用总 RNA提取方
法，由于它的简便、快捷(整个提取过程在两小时内
完成)，已经成为许多实验室常用的方法，并已成功
从动物组织、人体组织和许多植物(如小麦)组织、细
胞中获得了高质量的总 RNA。我们用 Trizol试剂
分别提取正常生长的以及 自然干燥的东亚砂藓的总
RNA。但不论是正常生长的还是自然干燥的，Gene
Spec检测和琼脂糖凝胶电泳检测结果都很不理想。
Gene Spec检测的A26。／A28。比值在 1．0左右。琼脂
糖凝胶检测，EB染色根本检测不到。因此，Trizol
一 步法不适合东亚砂藓总 RNA的提取。
相 比于 Trizol试剂 一步法 ，改 良 CTAB提取
法、改良SDS提取法和 Tris-硼酸提取法都提出了
总RNA，但提取的效果相差较大。Tris-硼酸提取
法提取的总 RNA电泳检测时降解严重。用改 良
CTAB提取法和改 良 SDS提取法提取 的总 RNA，
Gene Spec检测的 A26。／Az8o比值在 1．8以上。但改
良 CTAB提取法虽然提取的总 RNA，在 EB染色的
琼脂糖凝胶检测时发现，提取的总 RNA中有较多
的DNA，为后续实验中 DNA的去除带来了不便。
改 良 SDS提 取法提 取的总 RNA，不但 Gene Spec
检测的A： 。／A： 。比值在 1．8以上，而且 EB染色的
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3期 闫苗苗等：藓类植物 RNA提取方法研究 331
1 2 3 4 1 2 3 4
图 1 不同提取法提取的东亚砂藓总RNA的电泳图谱
Fig．1 Electrophoresis of Racomitrium
．
口ponicum total RNA isolated by different methods
Tris一硼酸提取法(1，2泳道为正常生长条件下的；3，4泳道为干燥处理 3 d和5 d的)；B．改良SDS法(1泳道为Marker；2泳道是正常
生长条件下的；3，4泳道为干燥处理 3 d和 5 d)；C．改良CTAB法(2泳道为正常生长条件下的}1，3泳道为干燥处理3 d和 5 d的)。
Tris—method(Lane 1，2：Normal；Lane 3，4；dried 3 d and dried 5 d)；B．Modified SDS(La ne 1：Marker；La ne 2：Normal‘
I．~ne 3，4；dried 3 d and dried 5 d)；C．Modified CTAB(Lane 2：Normal}La ne 1，3：dried 3 d and dried 5 d)．
1 2 3 4 5 6 7
图 2 DNaseI消化后的 RNA(1泳道为干燥处理 5 d
的；3泳道为 Marker；7泳道为正常生长条件下的)
Fig．2 RNA digested by DNaseI(Lane 1：dried
5 d；Lane 3：Marker；Lane 7：Norma1)
琼脂糖凝胶检测时可以看出 DNA 的含量相对较
低，而且 RNA两条带都较为清晰且无降解。
2．2 RNA纯化
从图 1看出，改良 SDS提取法提取的总 RNA
有较好的 28S和 18S两条带，基本上保证了 eDNA
的完整性，各组 RNA的 A： 。／A：。比值在 1．7以上，
表明 RNA质量已达到要求。但从图中也可看出，
提取的RNA中混有一定量的 DNA，为了后续实验
的顺利进行 ，需进行 RNA纯化，即用 DNaseI去除
RNA中的 DNA。
从图2看出，去除 DNA后的用品仍保留了两
条 RNA带，基本上无降解。在去除 DNA的同时，
进一步用氯仿抽提掺杂在 RNA 中的蛋白质。此
外，用 75 的乙醇洗几次沉淀，可以减少其它杂质
的含量。去除 DNA的过程都有不同程度的 RNA
损失，反转录时将模板浓度调到相同，以便后续实验
的顺利进行 。
3
图 3 RT—PCR电泳图
Fig．3 Electrophoresis of RT—PCR
A．改良SDS法 (1泳道为正常生长条件下；2泳道为 Marker)；B．改良CTAB(1泳道为正常生长条件下；3泳道为 Marker)。
A．Modified SDS (Lane 1；Normal；Lane 2：Marker)；B．Modified CTAB (Lane 1：Normal；Lane 3；Marker)．
2．3 eDNA第一链的合成
eDNA第一链的合成按照试剂盒中的说明操作。
本实验中用的 M-MLV反转录酶来 自于鼠源，该酶的
(下转第 294页 Continue on page 294)
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294 广 西 植 物 28卷
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(云霄)，276—6 1160(PE)；ibid，R．T．Zhang(张娆挺)
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Dongguan(东莞)，z．F．Wei(卫兆芬)122075(PE)；
Longfeng(隆丰)，z．F．wei(卫兆芬)12l18O(PE)；Gao—
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西)：Fangcheng(防城 )，Hepu Exped．of the Chinese
Academy of Sciences(中国科学院合浦调查对)2575
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Academy of Sciences(中国科学院合浦调查队)2337
(PE)．Hainan(海南)：Haikou(海I：1)，X．L．Hou&W．
Q．Wang(侯学 良和王文卿)994(AU)；Wenchnag(3C
昌)，X．L Hou& W．Q．Wang(侯学 良和王文卿)9100
(AU)，9101(AU)．Hong kong(香港)：New Territery，
Y．Tsiang(蒋英)169(PE)；S．Y．Hu(胡秀英)12782
(PE)，13544(PE)．
致谢 在标本查阅和野外调查 中得到中国科 学
院植物标本馆和 海南东寨港国家级 自然保护区的支
持和帮助 ，深表谢意。
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(上接第 331页 Continue from page 331)
特点是转录过程中转录比较稳定，得到的 cDNA片段
比较完整，但是转录结合性能弱，因此在实验过程中
将反应时间由 1 h增加到3 h，得到了很好的结果。
2．4 RT-PCR
在相同的条件下四种方法中的 Trizol RNA一步
法和 Tris一硼酸法提取的 RNA进行 PT-PCR，没有看
到条带，而剩下的两种方法进行 RT-PCR，结果如图3
所示，用 SDS法提取的 RNA在琼脂糖凝胶上得到了
较为清晰的7条带，而 CTAB法得到了2条带。
综上所述 ，本研究的 4种 RNA提取方法 中，总
体而言以改良的 SDS法最优。我们用该方法还成
功地提取了紫萼藓、塔藓等藓类植物的总 RNA。
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