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A modified method of genomic DNA extraction and establishment of AFLP systems in Rhus chinensis

盐肤木基因组DNA提取方法改进及AFLP体系的建立



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 31(1):36— 38 2O11年 1月
DOI:10.3969/j.issn.1000—3142.2011.O1.008
盐肤木基因组 DNA提取方法改进
及 AFLP体系的建立
庞雅文1,段立柱1,宋德应2,任竹梅
(1.山西大学 生命科学学院,太原 030006;2.湖北五峰土家族 自治县林业局 ,湖北 五峰 443400)
摘 要:经过反复试验,摸索出一种提取高质量植物基因组 DNA的方法:改 良的 4×CTAB法。以盐肤木叶
片为实验材料 ,提取到高质量的基因组 DNA,建立了酶切、连接 、预扩增 、选择性扩增的 AFLP反应体系。通
过两种引物组合“E+3/M+3”和“E+2/M+3”策略筛选出 8对条带分辨率高、多态性好的引物组合,优化了
盐肤木的 AFLP银染反应体系,得到了清晰的 AFLP指纹图谱,为盐肤木种群遗传多样性研究奠定了基础。
关键词:盐肤木;DNA提取 ;4×CTAB法 ;AFLP技术
中图分类号:Q943.2 文献标识码 :A 文章编号:1000—3142(2011)01—0036—03
A modified method of
establishment of舰
genomic DNA extraction and
P systems in Rhus chinensis
PANG Ya—W en1,DUAN Li-Zhu1,SONG De-Ying2,REN Zhu-Mei1
(1.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Bureau
ofForestry of Wufeng County,Wufeng 443400,China)
Abstract:A modified method(4×CTAB)was used tO extract the effective genomic DNA from the leaves of Rhus
chinensis,and the systems of DNA restriction reaction,ligase reaction,pre-amplification and selective amplification re—
action were established in this study.Using the two kinds of primer-combined methods(E+3/M+3 and E+2/M+
3),8 pairs of primers were finally selected to amplify the genomic DNA of R.chinensis,and clear bands with high ge—
netic polymorphism and difference were obtained.The present results provided a strong foundation for the further ex—
amination of population genetic diversity and structure of R.chinensis using AFLP method.
Key words:Rhus chinensis;DNA extraction;4×CTAB method;AFLP technology
高质量基因组DNA的提取是进行分子生物学
研究的基础和关键。各种植物所含的物质成分及含
量不 同,其 DNA 提 取 的 方 法 也 不 同 (李 荣 等,
2006),目前 主 要采 用 CTAB法 和 SDS法 ,其 中
CTAB法多用 于木本植物 DNA 的提取 (王军等,
2006;黄绍辉等,2007)。盐肤木(Rhus chinensis)属
漆树科(Anacardiaceae)盐肤木属 (Rhus),又名五倍子
树、五倍柴、盐肤子等,具有较高的药用价值和经济价
值(郑勉等,1980)。近年来 ,国内外对漆树科植物做
了大量的研究,但主要集中于漆树、丰亡果等经济价值
较大的植物(Kuo等,1999;Rayne&Mazza,2007;Vir—
uel等,2005),对盐肤木的研究 主要集 中在形态结构
特点、种苗繁育、生理生化等方面(Fujimoto等,2000;
Tangpu&Yadav,2004;赵军等,2006;王琼等,2008),
其分子遗传多态性方面的研究仅有少量报道(Yi
等,2004;Ren等,2008;李继变等,2009)。
扩增片断长度多态性(AFLP)是一种十分理想
的、有效的、先进的检测 DNA多态性的分子标记技
收稿日期:2010—04—25 修回日期:2010—11-03
基金项 目:国家自然科学基金(30670361);山西省自然科学基金(2007011078)[Supported byNationalNatural ScienceFoundation ofChina(30670361);
Nalural Science Foundation of Shanxi Province(2007011078)]
作者简介:庞雅文(1988一),女,山西晋城市人,硕士研究生,主要从事系统分类研究,(E-mail)yawen570@yahoo.corn.an。
通讯作者(Author for c0rrespondence,E-mail;zmren@SXU.edu.cn)
1期 庞雅文等 :盐肤木基因组 DNA提取方法改进及 AFLP体系的建立 37
术,具有 RAPD和 RFLP技术 的双重优点 (郑先云
等,2003;朱成 伟等,2006;Wang等 ,2007),是迄 今
为止最有效 的 DNA分子标 记 (Vos等 ,1995;王 婷
等,2008)。AFLP作为一种高效的分子标记技术,
对基因组 DNA的质量要求较高,获取高质量的基
因组 DNA成为 AFLP成功分析的关键 。本研究材
料盐肤木叶片中含有多糖、单 宁等物质 ,采取常规方
法得到的基 因组 DNA杂质较 多,抑制 了相关酶 的
活性;再者部分材料保存时间较长 ,常规方法提取的
DNA降解较严 重,已不 能满足 AFLP分子标记 的
要求。因此 ,本研究通过不断试验 ,采用改 良的 4×
CTAB法提取到高质量的盐肤木基因组 DNA,建立
了盐肤木 AFLP分子标 记体 系,为盐肤木遗传多样
性及遗传结构的研究奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1材料
盐肤木叶片于 2004~2008年 8~ 1O月问采 自
贵州丹寨 、四川I安县、湖北五峰和云南金平 ,经硅胶
干燥保存。
2 3 4 5 6 M
图 1 丹寨盐肤木样 品基因组 DNA
提取琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA
of R.chinensis from Danzhai,Guizhou,China
1-3:常规 2×CTAB法 ;4-6:改 良的 4×CTAB法 。
1-3:Common 2×CTAB method;4—6:Innovated 4×
CTAB method;M: DNA(EcoR I+HindⅢ).
1.2方法
1.2.1基 因组 DNA 提 取及检 测 盐肤木 基 因组
DNA的提取分别采 用 2×CTAB法和改 良的 4×
CTAB法进行摸索筛选。改 良的4×CTAB法改进
之处主要是在常规 4 x CTAB法的基 础上 ,将 Tris
和 EDTA的浓度都增加一倍,而盐离子(NaC1)浓度
不变 。基因组 DNA提取参照 Doyle JJ& Doyle JL
(1987)和唐绍清等(2004)的方法进行。
1.2.2 AFLP数据 分析 AFLP分 析参照 Vos等
(1995)和唐绍清等(2004)的方法 。采用 EcoR I和
Mse I两种限制性 内切酶对基 因组 DNA进行双酶
切,酶切和连接采用两步法进行。
1.2.3选择性引物 筛选 本实验采用“E+3/M+3”
(64对)和“E+2/M+3”(32对)两种 引物筛选策略
共 96对引物组合进行 AFLP选择性扩增,其中“E
+3/M+3”引物组合为核心引物组(周延清,2005)。
2 结果与分析
2.1盐肤木基因组 DNA的提取
基因组 DNA 电泳检测结果见 图 1,可见 ,对于
存放时间较长的盐肤木标本,常规 2xCTAB法提
取的DNA主带模糊,存在降解现象,而改良的 4×
CTAB法提取的基因组 DNA主带清晰,无降解 。
2.2引物筛选
通过观察比较不同引物组合扩增位点的多态性
和清晰度,从 96对引物组合中筛选出8对条带分辨
率高、多态性好的引物组合,分别是:E-AAG/M—
CAA、E—AAG/M—CAC、E—ACA/M—CAA、E_AT/
M—CAA、E—AT/M—CAT、E—AT/M—CAC、E—AT/M—
CTC、E—AT/M—CTT。
2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
引物组合 E—AT/M-CAT扩增产物聚丙烯酰胺
凝胶电泳银染检测结果见 图 2,带型较清晰,多态性
较好。
3 讨论
3.1基因组 DNA的提取
DNA提取过 程 中,需防止 DNA 的降解,避免
RNA的污染和抑制物 的存在,被污染或降解 的
DNA不能扩增出条带或条带可重复性差(郑先云
等,2007)。本研究采用常规 CTAB法提取盐肤木
基因组 DNA,发现部分样品提取的 DNA存在严重
降解、主带模糊不清、拖尾等现象,不能满足 AFLP
实验的要求。分析认为主要是由于部分标本存放时
间较长 ,叶片内环境不稳定 ,且盐肤木叶片中多糖、
单宁等物质含量较高引起。基因组 DNA提取的效
果与提取液成分及其含量关系密切,比如 EDTA能
抑制 DNA酶活性,保护 DNA不被内源核酸酶降
解,对 DNA的存在具稳定作用(陶爱丽等,2004);
38 广 西 植 物 31卷
Tris—HC1作为缓冲液可稳定体系 的 pH 环境;在裂
解细胞膜的过程 中,提取液 中高浓度的盐不能完全
除去果胶类多糖对 DNA 的影 响,使得在离心沉淀
过程中,DNA与果胶类多糖形成很难溶解的胶状物
质(黄捷等 ,2008);CTAB可与多糖 、蛋 白质结合形
成复合物(孟淑春等,2008),并有效地沉淀部分次生
代谢物(李春霞等,2009);高浓度 的 CTAB可使细
胞裂解更充分 ,核内 DNA 释放更完全。所 以本研
究在常规 4×CTAB法的基础上,反复试验,将提取
液中的 Tris—HC1和 EDTA量同时加倍后进行盐肤
木 DNA的提取,获得了高质量的基因组 DNA。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9lO11213la15161718192。21丑 232425262728 2930
图 2 选择性引物组合 E—AT/M—CAT扩增
产物聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果
Fig.2 PAGE results of selective amplification of
R.chinensis using primers E—AT/M-CAT
3.2引物组合筛选
引物组合 的筛 选 是进 行 AFLP分 析 的关 键。
本研究首先采用 64对 “E+3/M+3”的引物组合,
筛选 出 3对符合要求的引物组合 (Katsiotis等,
2003;赵喜萍等,2007)。为了更充分说明盐肤木种
群的多态性,为后续实验提供充足的依据,本研究又
通过减少选择性碱基的数 目来降低扩增片段的选择
性,增加扩增产物条带的数 目,从 32对“E+2/M+
3”的引物组合 中筛选 出 5对 引物组合 (李凤云等,
2007;赵冰等,2007)。两种引物组合筛选策略共筛
选出的8对引物组合,获得 372条带,其中多态性条
带 333条,多态位点 比例为 89.52 。扩增图谱条
带分辨率高,多态性好、稳定性和重复性较理想。
综上所述,本研究采用改 良的 4×CTAB法提
取的盐肤木基因组 DNA主带清晰、无降解、质量较
好,可以满足 AFLP分子标记实验的要求;通过盐
肤木AFLP相关条件的摸索及引物组合的筛选,建
立了盐肤木 AFLP反应体系,为盐肤木指纹图谱分
析奠定了基础 。
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