全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(1)：36— 38 2O11年 1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．O1．008
盐肤木基因组 DNA提取方法改进
及 AFLP体系的建立
庞雅文1，段立柱1，宋德应2，任竹梅
(1．山西大学 生命科学学院，太原 030006；2．湖北五峰土家族 自治县林业局 ，湖北 五峰 443400)
摘 要：经过反复试验，摸索出一种提取高质量植物基因组 DNA的方法：改 良的 4×CTAB法。以盐肤木叶
片为实验材料 ，提取到高质量的基因组 DNA，建立了酶切、连接 、预扩增 、选择性扩增的 AFLP反应体系。通
过两种引物组合“E+3／M+3”和“E+2／M+3”策略筛选出 8对条带分辨率高、多态性好的引物组合，优化了
盐肤木的 AFLP银染反应体系，得到了清晰的 AFLP指纹图谱，为盐肤木种群遗传多样性研究奠定了基础。
关键词：盐肤木；DNA提取 ；4×CTAB法 ；AFLP技术
中图分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)01—0036—03
A modified method of
establishment of舰
genomic DNA extraction and
P systems in Rhus chinensis
PANG Ya—W en1，DUAN Li-Zhu1，SONG De-Ying2，REN Zhu-Mei1
(1．School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2．Bureau
ofForestry of Wufeng County，Wufeng 443400，China)
Abstract：A modified method(4×CTAB)was used tO extract the effective genomic DNA from the leaves of Rhus
chinensis，and the systems of DNA restriction reaction，ligase reaction，pre-amplification and selective amplification re—
action were established in this study．Using the two kinds of primer-combined methods(E+3／M+3 and E+2／M+
3)，8 pairs of primers were finally selected to amplify the genomic DNA of R．chinensis，and clear bands with high ge—
netic polymorphism and difference were obtained．The present results provided a strong foundation for the further ex—
amination of population genetic diversity and structure of R．chinensis using AFLP method．
Key words：Rhus chinensis；DNA extraction；4×CTAB method；AFLP technology
高质量基因组DNA的提取是进行分子生物学
研究的基础和关键。各种植物所含的物质成分及含
量不 同，其 DNA 提 取 的 方 法 也 不 同 (李 荣 等，
2006)，目前 主 要采 用 CTAB法 和 SDS法 ，其 中
CTAB法多用 于木本植物 DNA 的提取 (王军等，
2006；黄绍辉等，2007)。盐肤木(Rhus chinensis)属
漆树科(Anacardiaceae)盐肤木属 (Rhus)，又名五倍子
树、五倍柴、盐肤子等，具有较高的药用价值和经济价
值(郑勉等，1980)。近年来 ，国内外对漆树科植物做
了大量的研究，但主要集中于漆树、丰亡果等经济价值
较大的植物(Kuo等，1999；Rayne&Mazza，2007；Vir—
uel等，2005)，对盐肤木的研究 主要集 中在形态结构
特点、种苗繁育、生理生化等方面(Fujimoto等，2000；
Tangpu＆Yadav，2004；赵军等，2006；王琼等，2008)，
其分子遗传多态性方面的研究仅有少量报道(Yi
等，2004；Ren等，2008；李继变等，2009)。
扩增片断长度多态性(AFLP)是一种十分理想
的、有效的、先进的检测 DNA多态性的分子标记技
收稿日期：2010—04—25 修回日期：2010—11-03
基金项 目：国家自然科学基金(30670361)；山西省自然科学基金(2007011078)[Supported byNationalNatural ScienceFoundation ofChina(30670361)；
Nalural Science Foundation of Shanxi Province(2007011078)]
作者简介：庞雅文(1988一)，女，山西晋城市人，硕士研究生，主要从事系统分类研究，(E-mail)yawen570@yahoo．corn．an。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E-mail；zmren@SXU．edu．cn)
1期 庞雅文等 ：盐肤木基因组 DNA提取方法改进及 AFLP体系的建立 37
术，具有 RAPD和 RFLP技术 的双重优点 (郑先云
等，2003；朱成 伟等，2006；Wang等 ，2007)，是迄 今
为止最有效 的 DNA分子标 记 (Vos等 ，1995；王 婷
等，2008)。AFLP作为一种高效的分子标记技术，
对基因组 DNA的质量要求较高，获取高质量的基
因组 DNA成为 AFLP成功分析的关键 。本研究材
料盐肤木叶片中含有多糖、单 宁等物质 ，采取常规方
法得到的基 因组 DNA杂质较 多，抑制 了相关酶 的
活性；再者部分材料保存时间较长 ，常规方法提取的
DNA降解较严 重，已不 能满足 AFLP分子标记 的
要求。因此 ，本研究通过不断试验 ，采用改 良的 4×
CTAB法提取到高质量的盐肤木基因组 DNA，建立
了盐肤木 AFLP分子标 记体 系，为盐肤木遗传多样
性及遗传结构的研究奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1．1材料
盐肤木叶片于 2004～2008年 8～ 1O月问采 自
贵州丹寨 、四川I安县、湖北五峰和云南金平 ，经硅胶
干燥保存。
2 3 4 5 6 M
图 1 丹寨盐肤木样 品基因组 DNA
提取琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig．1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA
of R．chinensis from Danzhai，Guizhou，China
1-3：常规 2×CTAB法 ；4-6：改 良的 4×CTAB法 。
1-3：Common 2×CTAB method；4—6：Innovated 4×
CTAB method；M： DNA(EcoR I+HindⅢ)．
1．2方法
1．2．1基 因组 DNA 提 取及检 测 盐肤木 基 因组
DNA的提取分别采 用 2×CTAB法和改 良的 4×
CTAB法进行摸索筛选。改 良的4×CTAB法改进
之处主要是在常规 4 x CTAB法的基 础上 ，将 Tris
和 EDTA的浓度都增加一倍，而盐离子(NaC1)浓度
不变 。基因组 DNA提取参照 Doyle JJ& Doyle JL
(1987)和唐绍清等(2004)的方法进行。
1．2．2 AFLP数据 分析 AFLP分 析参照 Vos等
(1995)和唐绍清等(2004)的方法 。采用 EcoR I和
Mse I两种限制性 内切酶对基 因组 DNA进行双酶
切，酶切和连接采用两步法进行。
1．2．3选择性引物 筛选 本实验采用“E+3／M+3”
(64对)和“E+2／M+3”(32对)两种 引物筛选策略
共 96对引物组合进行 AFLP选择性扩增，其中“E
+3／M+3”引物组合为核心引物组(周延清，2005)。
2 结果与分析
2．1盐肤木基因组 DNA的提取
基因组 DNA 电泳检测结果见 图 1，可见 ，对于
存放时间较长的盐肤木标本，常规 2xCTAB法提
取的DNA主带模糊，存在降解现象，而改良的 4×
CTAB法提取的基因组 DNA主带清晰，无降解 。
2．2引物筛选
通过观察比较不同引物组合扩增位点的多态性
和清晰度，从 96对引物组合中筛选出8对条带分辨
率高、多态性好的引物组合，分别是：E-AAG／M—
CAA、E—AAG／M—CAC、E—ACA／M—CAA、E_AT／
M—CAA、E—AT／M—CAT、E—AT／M—CAC、E—AT／M—
CTC、E—AT／M—CTT。
2．3聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
引物组合 E—AT／M-CAT扩增产物聚丙烯酰胺
凝胶电泳银染检测结果见 图 2，带型较清晰，多态性
较好。
3 讨论
3．1基因组 DNA的提取
DNA提取过 程 中，需防止 DNA 的降解，避免
RNA的污染和抑制物 的存在，被污染或降解 的
DNA不能扩增出条带或条带可重复性差(郑先云
等，2007)。本研究采用常规 CTAB法提取盐肤木
基因组 DNA，发现部分样品提取的 DNA存在严重
降解、主带模糊不清、拖尾等现象，不能满足 AFLP
实验的要求。分析认为主要是由于部分标本存放时
间较长 ，叶片内环境不稳定 ，且盐肤木叶片中多糖、
单宁等物质含量较高引起。基因组 DNA提取的效
果与提取液成分及其含量关系密切，比如 EDTA能
抑制 DNA酶活性，保护 DNA不被内源核酸酶降
解，对 DNA的存在具稳定作用(陶爱丽等，2004)；
38 广 西 植 物 31卷
Tris—HC1作为缓冲液可稳定体系 的 pH 环境；在裂
解细胞膜的过程 中，提取液 中高浓度的盐不能完全
除去果胶类多糖对 DNA 的影 响，使得在离心沉淀
过程中，DNA与果胶类多糖形成很难溶解的胶状物
质(黄捷等 ，2008)；CTAB可与多糖 、蛋 白质结合形
成复合物(孟淑春等，2008)，并有效地沉淀部分次生
代谢物(李春霞等，2009)；高浓度 的 CTAB可使细
胞裂解更充分 ，核内 DNA 释放更完全。所 以本研
究在常规 4×CTAB法的基础上，反复试验，将提取
液中的 Tris—HC1和 EDTA量同时加倍后进行盐肤
木 DNA的提取，获得了高质量的基因组 DNA。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9lO11213la15161718192。21丑 232425262728 2930
图 2 选择性引物组合 E—AT／M—CAT扩增
产物聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果
Fig．2 PAGE results of selective amplification of
R．chinensis using primers E—AT／M-CAT
3．2引物组合筛选
引物组合 的筛 选 是进 行 AFLP分 析 的关 键。
本研究首先采用 64对 “E+3／M+3”的引物组合，
筛选 出 3对符合要求的引物组合 (Katsiotis等，
2003；赵喜萍等，2007)。为了更充分说明盐肤木种
群的多态性，为后续实验提供充足的依据，本研究又
通过减少选择性碱基的数 目来降低扩增片段的选择
性，增加扩增产物条带的数 目，从 32对“E+2／M+
3”的引物组合 中筛选 出 5对 引物组合 (李凤云等，
2007；赵冰等，2007)。两种引物组合筛选策略共筛
选出的8对引物组合，获得 372条带，其中多态性条
带 333条，多态位点 比例为 89．52 。扩增图谱条
带分辨率高，多态性好、稳定性和重复性较理想。
综上所述，本研究采用改 良的 4×CTAB法提
取的盐肤木基因组 DNA主带清晰、无降解、质量较
好，可以满足 AFLP分子标记实验的要求；通过盐
肤木AFLP相关条件的摸索及引物组合的筛选，建
立了盐肤木 AFLP反应体系，为盐肤木指纹图谱分
析奠定了基础 。
参考文献：
周延清．2005．DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]．
北京 ：化学工业出版社
郑勉，闵天禄．1980．中国植物志 (第 45卷第 1分册)[M]．北
京：科学出版社 ：100—101
Doyle JJ，Do yle JL．1987．A rapid DNA isolation procedure for smal
quantities of fresh leaf tissuei-J~．PhytochemBull，19：11-15
Fujimoto T，Kanetoshi A，Aopyagi M，eta1．2000．Studies on utili—
zation of plant resources in Hokkaido．isolation of 67pentadecyl—
salicylie acid from Rhus javanica leaves as an active component
on histamine-release inhibitory effectrJ]．Ho艘aidorist “Eisei
Kenkyushoho，50：89
Huang J(黄捷 )，Chen XB(陈 晓斌 )，Ye HL(叶花 兰)，et a1．
2008．The extraction and identification of genomic DNA from
Okra(黄秋葵基 因组 DNA提取及鉴定)[J]．ChinAgric Sci
Bull(中国农学通报)，24(4)：99—103
Huang SH(黄绍辉)，Fang YM(方炎明)．2007．DNA Extraction
of the endangered tree species Cercidiphyllum japonicum based
on the modified method of SD CW出(改进 的SDS_CTAB法提
取濒危植物连香树总 DNA)[J]．J Wuhan Bot Res(武汉植物
学研究)，25(1)：98—101
Katsiotis A，Hagidimitriou M ，Drossou A，eta1．2003．Genetic re—
lationships among species and cultivars of Pistacia using RAPDs
and AFLPs[J]．Euphytica，132：279—286
Kuo YC，Sun CM，Tsai WJ，eta1．1999．Blocking of cel prolifera—
tion，cytokines production and genes expression folowing admin—
istration of Chinese herbs in the human mesangial cels[J]．Li f￡
Sci，64(23)：2 089
Lj CX(李春霞)，Li HF(李宏飞)．2009．Study on efficient extrae—
tion for genomie DNA from Malus leaves by CTAB method
(CTAB法高效 提取苹 果 叶片 DNA 的研 究)[J]．Northern
Hort(北方园艺)，2：49—52
Li FY(李风云)，Sheng WM(盛 万 民)，Liu ZJ(刘 昭军)，et a1．
2007．Genetic diversity analysis of potato cultivars by AFLP
markers(马铃薯 品种遗传多样 性的 AFLP分析)[J]．Chin
Agric Sci Bull(中国农学通报)，23(8)：58—61
Li JB(李继变)，Ren ZM(任竹梅)，Ma EB(马恩波)．2009．COm—
parative genetic diversity of St’hlechtendalia chinensis and their
hosts Rhus chinensis population(角倍蚜与其唯一夏 寄主植物
盐肤木种群遗传多样性比较)I-J]．J Shamri Univ(山西大学
学报)，32(2)：298—303
Li R(李荣)，Niu JX(牛建新)，Wang L(王林)，et a1．2006．DNA
extraction method for AFLP analysis in Walnut(适 合 核 桃
AFLP分析用的DNA提取方法研究)[J]．ActaAgHc Boreal—
OccidentSin(西北农业学报)，15(3)：175—178
Meng SC(孟淑春)，Zhang HY(张海英)，Zheng XY(~g晓鹰)，et
a1．2008．Extraction of DNA and establishment of AFLP tech—
niques in leaves of Chinese cabbage(大白菜基因组 DNA的提取
及AFLP反应体系的建立)[J]．Mol Plant Breed(分子植物
育种)，6(2)：370—376
Rayne S。Mazza G．2007．Biological activities of extracts from Sumac
(Rhus spp．)：a review[J]．Plant Foods Hum Nut，62：165—175
Ren ZM，Zhu B，Wang DJ，et a1． 2008． Comparative population
structure of Chinese surnac aphid Schlechtendalia chinensis an d its
primary host-plant Rhus chinensis[J]．Genetica，132：1o3—112
(下转第 42页 Continue on page 42)
珊枷季}垂} ls 仍 协 巧
42 广 西 植 物 3l卷
References：
Balloux F，Lehmann L，De Meefis T 2003 The population ge—
netics of clonal and partially clonal diploids[J]．Genetics，
164：1 635～ 1 644
Doyle JJ．1991．DNA protocols for plants—CTAB total DNA iso—
lation．Hewitt GM，Johnston A(eds)Molecular Techniques in
Taxonomy~M]．Berlin：Springer-Verlag 283—293
Goudet J．1995．FSTAT (version 1．2)：a computer program to
calculate F-statistics[J]．J of Hered，86：485—486
Hooftman DAP，van Kleunen M ，Diemer M ． 2003． Effects of
habitat fragmentation on the fitness of two common wetland
species，Carex c，“t儿z z Ⅱ珂“antl Succisa pratensis[J]．Oeco—
logia，134：350— 359
Halkett F，Simon JC，F Baloux F．2005．Tackling the population
genetics of clonal and partialy clonal organisms[J]．Trends Ecol
Evo￡，20，194—201
Jump AS，Pefiuelas J． 2006． Genetic effects of chronic habitat
fragmentation in a win&polinated tree[J]．Proc Natl Acad＆
USA ，103：8 096— 8 100
Lewis P0，Zaykin D．2001．Genetic data analysis：Computer pro-
gram for the analysis of allelic data．Version 1．0(dl6c)EJ]．Free
program distributed by the authors over the internet from ht—
tp：／／lewis，eeb．uconrL edu／lewishome／software．html
Lunt DH，Hutchinson W_F，Carvalho GR． 1999． An eficient
method for PCR-based isolation of microsatelite arrays(PIMA)
[J]．MolEcol，8：891-894
Peng SL．1996．Southern Subtropical Forest Community Dynamics
[M3．Bering：Science Press
Wang ZF，Ye W H。Fu SL，et a1． 2008． Microsatelites reveal un-
expected clonal growth and geneticaly distinct groups in Cryp—
tocarya chinensis in fragmented lower subtropical forest．China
EJ]．Silvae Genetica，57(6)：324—332
Wang ZF，Li G，Fu SL，el a1． 2007． Isolation and characterization
of microsatellite loci in Cryptocarya chinensis in lower subtropi-
cal China[J]．ConserGenet，8：1 235—1 237
Wang ZF，Peng SL，Liu SZ，el a1． 2003．Spatial patern of Cryp—
tocarya chinensis life stages in lower subtropical forest，China
EJ]．BotBull Acad Sin，44：159～166
Wang ZF。Zhu P，Ye W H．2009．Development and characterization
of 13 microsatelite markers for Cryptocarya concinna in Iower
subtropical China[J]．Conser Genet，10(6)：1 841—1 843
Weir BS．Cockerham Ce 1984．Kstimating F-statistics for the analy—
sis of population structure[J]．Evolution，38：1 358—1 370
(上接第 38页 Continue from page 38)
o AL(陶爱丽)，Wen ZZ(文祯 中)，Han YC(阚云超)，et a1．
2004．Extraction of genomic DNA from Actinidia deliciosa(美
味猕猴桃基因组 DNA的提取条件优化)[J]．J Nanyang
丁 c r ’Co (南阳师范院学报)，3(9)：56—58
Tangpu V ．Yadav AK． 2004． Antidiarrhoeal activity of Rhus
javanica ripen fruit extract in albino mice[J]．Fitothera—
pia，75(1)：39～ 44
Fang SQ(唐 绍清 )，Du LF(杜林 方)，Wang Y(王 燕)．2004．
AFI f analysis of ser．Chrysantha Chang(Camellia。sect．Chry—
santha)(山茶属金花茶组金花茶系的 AFLP分析)[J]．J Wu—
ban Bot Res(武汉植物学研究)，22(1)：44—48
Virucl MA，Escribano P，Barbieri M ，et a1．2005． Fingerprint—
ing，embryo type and geographic differentiation in mango
(Mangi ra indica，Anacardiaceae)with microsatelites[J]．
M ol Breed，15：383— 393
Vos P，Hogers R，Bleeker M，eta1．1995．AFLP：a new technique for
DNA fingerprinting[J]．Nucleic Acid Res，23(21)：4 4O7—4 414
Wang J(王军)，Yang CP(杨川平)，Liu GF(刘桂 丰)．2006．Ex—
traction of genomic DNA from woody plants andits identification
(木本植物基因组 DNA提取及鉴定)[J]．Bull Bot Res(植物
研究)，26(5)：589—594
Wang Q(王琼)，Song GL(宋桂龙)．2008．Study on hardseed and
gernfinating characteristic of Rhus chinensis Mil1．(盐肤 木种子
硬实与萌发特性研究)[j]．Seed(种子)，27(4)：59-61
Wang T(王婷)．I i AX(李爱贤)，lu JF(鞠建峰)，eta1．2008．AFLP
molecuktr marker techn ique and its application in the medicinal
plant research(AFLP分子标记技术及其在药用植物研究中的应
用)_J]．Qilu Pharvn Af~dirs(齐鲁药事)，27(1)：32—34
Wang W．Chen LQ．Yang P，et a1．2007．Assessing genetic diversity
of populations of topmouth cuher(Culteraltmrnus)in China using
AFLP markersVJ]．Bi~hon Systevnatics E ol，35：662—669
Yi TS，Miler AJ，Wen J．2004．Phylogenetic and biogeographic
diversification of Rhus(Anacardiaceae)in the Northern Henri-
sphereCJ]．Mol Phylogenet Evol，33(3)：861—879
Zhao B(赵冰)，Zhang QX(张启翔 )．2007．Genetic diversity of
germplasm resources of Chimonanthus praecox(L )link based on
AFLP,narker(~lJ用 AFLP分子标记探讨蜡梅种质资源的遗传
多样性)[J]．Acta Ecol Sin(生态学报)，27(11)：4 452—4 459
Zhao j(赵军)，Cui cB(崔承彬)，Cai B(蔡宾)，et a1．2006．Research
overview on Rhus spp．plant(国产盐肤木属植物 的研究进展)
LJ]．P m J Chin PLA(解放军药学报)，22(1)：48—51
Zhao XP(赵喜萍)，Wei SN(魏朔南)．2007．Genetic evaluation of
Toxicodendron vernicz}tuum cultivars using amplified fragment
length polymorphism markers(漆树品种的 AFLP分析及评价)
[J]．J Mol Cell Biol(分子细胞生物学报)，40(4)：262—266
Zheng XY(郑先云)，Guo YP(郭亚平)，Ma EB(马恩波)．2003．
The development of AFLP technology(AFLP分子标记技术的
发展)[J3．Chem (生命的化学)，23(1)：65—67
Zheng XY(郑先云)，Xuan T(宣涛)，Long WM(龙文敏)，et a1．
2007．Establishment and optimization of the AFLP technological
system for Oxya chinensis(中华稻蝗AFLP反应体系的建立与
优化)[J1．Acta Zootax Sin(动物分类学报)，32(4)：856-860
Zhu CW(朱成伟)，Zhang QW(张青 文)，Ye ZH(叶志华)，et a1．
2006．Analysis of genetic diversity in different geographic popula—
tions of the beet armyworm Spodoptera exigua(Lepidoptera：Noc—
tuidae)with AFLP technique(不同地区甜菜夜蛾种群的遗传多
样性分析)l-J]．Acta Entomol Sin(昆虫学报)，49(5)：867—873