全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(1)：1l1— 116 2011年 1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．O1．023
大豆 fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究
田苗苗，刘艳菊，李 敏，周延清 ，姚换灵，邢延豪
(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)
摘 要：使用 PCR方法从大豆基因组 DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2—1，连接到 pMD18一T载体
中，转化大肠杆菌JM109菌株。测序后，用 DNAstar软件进行同源性比对。然后将正确的序列反向克隆到表
达载体 pBt，并转化农杆菌菌株 LBA4404，经双酶切鉴定和 PCR扩增检测，获得具有该基 因反向序列的农杆
菌工程菌 ，转化烟草无菌苗叶片外植体 ，经过组织培养和卡那霉素抗性筛选 ，获得抗性烟草转化植株共 75株，
PCR扩增出npt—II基因，RT—PCR检测到大豆反义油酸脱饱和酶基因转录产物和 GC-MS测定其油酸含量增
加而亚油酸含量降低。结果表明，克隆的 fadZ一1基 因为 l196bp，基因序列与 NCBI中已发表 的基因 d2—1
序列蛋 白质相似性达到 96．7 ，反义大豆 fad2—1基因在烟草基 因组中整合表达 。
关键词：大豆；反义油酸脱饱和酶基因；根癌农杆菌；烟草；遗传
中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号 ：1000-3142(2011)01一O111—06
Stu Iy 0n the construction of antisense expression
‘ n 1 T ● 一 ‘ ⋯
vector 0f ycm e x oleic acid desatUraSe gene
and its transfer t0 Nicotiana tabacum
TIAN Miao—Miao，LIU Yan-Ju，LI Min，ZHOU Yan-Qing ，
YAO Huan-Ling．XING Yan_Hao
(Colege of Li Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China)
A~tmct：The Glycine 1Tta37 oleic acid desaturase gene fad2—1 was cloned from its genomic DNA by PCR．The ampli—
con was linked to pMD18-T vector and transformed into E．coli JM109．Alter sequencing，the correct gene was re—
versely inserted in pBt expression vector in order to construct plant antisense expression vector，which was trans—
formed into Agrobacterium tumefacien strains LBA4404 by freeze-thawing method．The modified strain LBA4404
was confirmed by double e~yme digestion and PCR detection．The antisense fad2—1 was introduced into tobacco by
Agrobacterium tumefaciens—mediated leaf disc transformation，and 75 kanamycin-resistant tobacco plantplets were re—
generated．PCR，RT-PCR methods and GC-MS analysis were used tO detect the npt-II gene，the transcript of anti—
sense fad2—1 and oleic acid content to get the positive transgenetic plants．The results indicated that the size of the i—
solated gene was l196bp，bearing 96．7 identity with the published data in NCBI database．The antisense fad2-1
expression vector was successfuly constructed and transformed into Agrobacterium tumefaci~ strains LBA4404 and
tobacco cells，and antisense fad-1 gene was successfuly integrated into the genomes of tobacco cels and expressed in
transgenic tobacco plantlets．
Key words：Glycine nz；antisense oleic acid aesaturase gene；Agrobacterium tumefaciens；tobacco(Nicotiana taba—
cum)；genetic transformation
收稿日期：2010—04—26 修回日期 ：2010—08—24
基金项目：国家“863”项目(2006AA100104—15)；河南省自然科学基础研究项目(2008A208018)[Supported by Hi—tech Research and Development
Program of China(2006AA100104—15)；Natural Science Basic Reserch Program of Education Department of Henan，c na(2O08A208O18)]
作者简介：田苗苗(1981-)，女，河南临颍人 ，博士研究生，研究方 向为植物遗传学 ，(E-mai|)miaomiao912@126．corn。
通讯作者(Author for corresp0ndence，E-mail：yqzhou@htu．cn)
112 广 西 植 物 31卷
大豆(Glycine wtax)是世界上重要的油料、食用
和饲料作物。其主要营养成分是蛋白质和脂肪(油)
等。大豆中含脂肪大约 15 ～2O ，不饱和脂肪酸
含量高 ，占85 ，其中多不饱 和脂肪酸亚油酸含量
最高达 5O 以上，油酸达 3O 以上。大豆油用量占
全世界食用油的 31％(Kim & Krishnan，2004)，主
要由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等 5种
脂肪酸组成；其中棕榈酸、硬脂酸为饱和脂肪酸，油
酸、亚油酸以及 亚麻酸为不饱和脂肪酸。其脂肪酸
的组成和配 比种类决定种子油的品质(Gunstone&
Polard，2001；Thelen Ohlrogge，2002)。大豆油
在贮存过程中极易氧化，严重影响了油的味道和稳
定性。因此 ，大豆油的油酸含量需要提高 ，而亚油酸
和亚麻酸等的含量需要降低。迄今为止，提高大豆
油酸含量的育种技术有杂交育种、诱变育种和基因
工程育种等技术。其中，采用基因修饰即抑制或降
低催化油酸转化成亚油酸的关键酶——大豆油酸脱
饱和酶的基因表达技术是提高大豆种子油中的油酸
含量的有效的技术之一(李海燕，2007)。我们 2004
年从大豆基因组 DNA克隆了大豆油酸脱饱和酶基
因fad2一I，并构建了它的反义植物表达载体和根癌
农杆菌工程菌(周延清，2005)，以期通过反义基因技
术改良大豆脂肪酸品质。目前，大豆转基因研究主
要采用农杆菌介导法、基因枪法和种质系统法，各有
优缺点。其中最有效的、最成熟的、最有成果的方法
是农杆菌介导法。但是，它也受 到大豆基 因型和转
化受体、农杆菌菌株、筛选剂、酚类化合物、筛选策略
和诱导条件等诸多因素的影响(陈喜风等，2008)。
因此，把反义大豆 fad导人大豆改良其脂肪酸成分
是比较难的，有必要在开展此研究工作之前，将该反
义基因转入模式植物烟草，探索其转基因技术，鉴定
其表达和功能。本研究克隆了大豆油酸脱饱和酶基
因(fad2—1)，构建了其反义表达载体，并且将其转
入根癌农杆菌，获得了工程菌。并将该基因导人模
式植物烟草中，鉴定其表达和功能。
1 材料和方法
1．1材料
烟草(Nicotiana tobacum‘Xanthi’)种子 由西北
大学王美娟博士提供，大豆品种周豆 12(Olycine
“z‘Zhoudou No．12’)种子由河南省周口市农业
科学研究院苑保军研究员鉴定与提供，植物表达载
体 pBt、大肠杆菌 (Escherichia coli)JM109菌株和
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404
由西 北大 学步怀 宇博 士后 馈赠 ，pMD18一T 载体、
PCR产物克隆试剂盒 、BamH I、Sal I、T4连接酶等
购自大连宝生物公司，质粒提取试剂盒和 PCR产物
纯化试剂盒、氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素和利福
平购 自上海 基康 生物 公 司，TaqDNA 聚合酶、
RNaseA 购 白 天 为 时 代 公 司，XDNA(Ec0RI+
HindIII)Marker和 2000D marker购 自IBM 公司，
10Obp Ladder和 200bp Ladder购 自华美生物工程
公司。植物组织培养基感染培养基 T1(MS+100
／~mol／L AS)、共培养培养基 T2(MS+1．0 tool／
Lmol／L 6-BA+0．05 mol／L IBA)、抑菌筛选培养基
T3(附加 5O～80 mol／L Kan和 500 mol／L Cef的
T2和生根培养基 T4(附加 5O～80 mol／L Kan和
500 mol／L Cef的 MS)。
1．2方法
1．2．1大豆基 因组 DNA的提取及大豆 fad2—1基因
扩增 大豆基因组 DNA的提取参见文献(田苗苗
等 ，2005)。基于 NCBI发表的大豆 fad2—1基因(登
录号为 L48320)序列和植物表达载体 pBt的酶切位
点，利用 DNAMAN软件设计引物，其中上游引物
含有 Sal I位点，下游引物含有 BamH I位点(下划
线表示酶切位点)：上游引物：5 r_TTT TTG TCG
ACA CTA GGC ATG GGT CTA GC-3 ；下游 引
物 ：5-TTT TTG GAT CCC CAT CAA TAC TTG
TTC一3 。PCR反 应 体 系 30 L，包含 1 L模 板
(O．3 tLg)，3 L的 10X PCR缓冲液 ，1．8 L的 2．5
mmol／L MgC12，3 L的 10 mmol／L dNTP，1．0 L
7．5 UTaq酶 ，300 pmol／／~L的上 、下引物 各 1．0
L，1．0 L 9．ug／ L DNA模 板。94℃ 预变性 5
min，94℃变性 1 min，59℃退火 1．5 min，72℃延
伸 3 min，35个循环 ，最后 72℃延伸 10 min。PCR
扩增产物经 1 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相记
录，观察并切下扩增的条带。
1．2．2 PCR产物的纯化与连接和 转化大肠杆 菌
使用上海基康生物公司的 PCR产物纯化回收试剂
盒对 PCR产物进行回收和纯化。然后，使用大连宝
生物公司T一载体 PCR产物克隆试剂盒把纯化 PCR
产物连接到 pMD18一T Vector上，16℃连接过夜 。
按照王关林等(2001)的方法制备 E．coli JM109感
受态细胞，使用上述连接产物转化感受态 E．coli
JM109细胞，用碱解法提取白色菌落的质粒 DNA，
1期 田苗苗等：大豆 fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究 113
并对质 粒 进 行 BamH I和 Sal I双 酶 切 和 PCR
鉴定。
1．2．3基 因序列分析和同源性 比较 将上述鉴定好
的重组 子 编号 送 上海 基 康 生 物 公 司测 序。采用
DNA star软件 对所 测序 列 编码 的氨基 酸序 列 与
NCBI中公布 的 fad2—1基 因编码 的氨基酸进行 同
源性 比对。
1．2．4反义表达载体的构建 用 BamH I和 Sal 1
分别双酶切质粒 DNA 和植物表达载体 pBt，回收目
的基因片段后者的大片段 。用 T4连接酶将二者在
16℃连接过夜，获得重组质粒命名为 pBt—FFAD。
1．2．5根癌 农杆 菌 的转化 和鉴 定 用 上述 pBt—
FFAD质粒和冻融法转化根癌农杆 菌 LBA4404感
受态 细 胞 ，筛 选 抗 卡 那 霉 素 根 癌 农 杆 菌 L-Bt—
FFAD。然后 ，提取其 质粒 ，进 行 BamH I和 Sal I
双酶切检测及 PCR检测。
1．2．6烟草无菌苗的培养 将烟草种子放到培养
皿中，用 10 NaC10溶液浸泡 20 min，无菌水冲洗4
次，用无菌滤纸吸去多余水份，接种在 1／2MS培养基
上，放于暗处培养。3 d后种子萌发，待芽长至两幼小
叶片时，让其光照生长。
1．2．7根癌农杆 菌浸染液 的制备 从平板 上挑取
单菌落转接于 YEB液体培养基(含 Kan 50 mg／L，
Str 100 rag／L)，于 28℃ ，240 r／rain振荡培养 ，活化
菌体。取 1 mL菌液接种于 50 mLYEB液体培养
基，振荡培养至A 。为 1．0左右，5 000 r／min离心6
min，收集菌体，重悬于 T1液体培养基，使其 A㈣为
0．8，备用。
1．2．8烟草转化及转基因植株的培养 采用叶盘
共培养法进行烟草的遗传转化(Horsch等，1985)。
将切割的烟草叶片预培养 2 d后，置于含有重组质
粒的根癌农杆菌浸染 液 T1中浸泡 30 min，期间不
断轻轻摇晃，使叶盘切面充分接触菌液。取出叶盘，
用无菌滤纸吸去多余菌液，将叶盘置于 T2培养基
上，(26±2)℃，黑暗培养 2～3 d。然后将上述共培
养叶片转移至选择培养基 T3上 ，每 日光照 16 h，光
照强度 40／~mol·m ·s～，25℃培养。10 d左右愈
伤组织长出丛生芽，每两周换一次新鲜的培养基，待
小芽长至 4 cm左右时，切下并转入含卡那霉素(70
mg·L- )及头孢霉素(500 mg·L- )的T4培养基。
每隔两周左右换 1次培养基，筛选出生根苗。待根
系生长完整后(约 3O d)，将再生植株转栽至花盆中，
于温室培养。
1．2．9抗卡那霉素烟草植株的 PCR鉴定 取抗性
烟草植株和未转化烟草植株的叶片，用 CTAB方法
(Doyle JJ＆ Doyle JL，l987)提取 植物 的基 因组
DNA。用 PCR方法检测 fad2—1基因。其循环参
数为 ：94℃预变性 5 min后 ，94℃变性 1 min，69．3
℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，循环 35次 ，最后 72
℃延伸 10 min，终止反应 ，4℃保温。取 15 L PCR
扩增产物 ，经 1．0 琼脂糖凝胶在 TAE缓冲液 中电
泳 ，电压 5 V／cm，紫外检测并用凝胶成相系统照相。
1．2．1O抗卡那霉素烟草植株的 RT-PCR鉴定 利用
BIOZOL试剂提取转基因烟草叶片 RNA，反转录为
cDNA后，进行 PCR扩增。PCR反应体系：正反向引
物均为 0．3／~mol·L- (1 uL)，dNTP10 mmol·L
(O．4 uL)，10×buf~r(2．0uL)，DNA模板 20 ng(1．0
uL)，Taq酶 1U(0．2 uL)，ddH2O补齐 20 L。RT_
PCR扩增程序为：94℃下预变性 2 min，94℃变性 45
S，58．0℃，退火 6O S，72℃，延伸 90 S，35个循环，72
℃延伸 10 min。扩增反应完成后，取样 lO L，用琼
脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察结果并照相。
1．2．1l转基因烟草植株叶油酸含量测定 烟草幼
叶样品在 45℃下烘 1 h，粉碎，过 100目筛，置于干燥
广口瓶密封保存 。称取 100 mg粉末烟叶样品，放人
20 mL带旋塞的试管中，加入适量己二酸内标溶液，
加入 2 mL 1O (V／V)硫酸 甲酯溶液 ，振荡 5 min，室
温下放置过夜，进行甲酯化反应，然后再加入去离子
水和氯仿各 5 mL进行萃取。萃取液经 2 000 r／min
离心，取下层清液进样。油酸甲酯和亚油酸为标准
图 1 重组质粒 pMTFFAD中基因fad2一l的
PCR和双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig．1 Agarose gel electroDh0resis of PCR and
double RE digestion product of d2—1 in
recombinant plasmid PMTFFAD
M1；~DNA／EcoR I+Hind III；M2：200bp Ladder；1；被克隆基
因 d2—1的pMD18-T载体；2：克隆基因 知d2—1的pMD18一T
载体的 BamH I和Sal I酶切产物；3：克隆于pMD18一T载体的
基因fad2-1的PCR产物。

1期 田苗苗等 ：大豆 fad基 因反义表达载体构建及转化烟草研究 115
和烟草 d基 因(登 录号 AY660024)的碱基 序列，
用 DNAMAN软件 比对知其相似性为 68．77 。
2．3反义表达载体的构 建
用 BamH I和 Sal I限制性 内切酶分别双酶切
重组质粒 pMTFFAD和表达载体 pBt，分别回收和
纯化 fad2-1 gene与表达 载体 pBt的大酶切片段 。
然后，将前者反向克隆入后者，获得反向表达载体
pBt—FFAD(图 3)，用 冻 融 法 转 化 根 癌 农 杆 菌
LBA4404菌株 ，对所获得的阳性克隆随机挑取几个
菌落，分别提取质粒 DNA，用 BamH I和 Sal I进行双
酶切鉴定和 PCR扩增检测，均能够获得 目的基因片
段。同时，也获得转 fad基因的根癌农杆菌工程菌。
2．4农杆菌转化与转化植株再生
本试验共接种 150块外植体，在含有 50 mg／L
卡那霉素的分化培养基上筛选，得到 100个左右的
不定芽，而后将其转移至含 70 mg／L卡那霉素的生
根培养基上，诱导根的形成，最终获得 75棵具有良
好根系的烟草植株。转化各个时期如图 4。
图3 植物反义表达载体 pBt—FFAD的构建
Fig．3 Construction of plant expression
vector pBt—FFAD
2．5转化烟草的分子鉴定
2．5．1抗卡那霉素烟草的 PCR鉴定 以转化烟草
基因组 DNA为模板，采用 PCR技术快速检测外源
基因的整合情况 。经 PCR检测 ，发现 75株抗卡那
霉素植株中，有 67株基 因组 DNA扩增出约 1 200
bp的目的基 因片段 (fad—l基 因)，为阳性转化植
株。8株卡那霉素抗性植株 的基 因组 DNA和阴性
对照的基因组 DNA一样没有扩增出约 l 200 bp的
目的基因片段 ，为假阳性转化植株。
2．5．2抗卡那霉素烟草 的 RT—PCR鉴定 对 PCR
检测为阳性的转化烟草植株进行 RT—PCR分析，进
一 步检测外源基 因在转化植株的表达情况。从 67
株 PCR阳性植株 中，随机选择 2株，进行 RT—PCR
分析。从图 5可以看出，转基因植株和阳性对照的
RNA均扩增 出约 1 196 bp的 目的基 因片段，而阴
性对照RNA没有扩增出该大小的条带。说明目的
基 因在转基因烟草中成功地表达。
2．5．3转基因烟草植株叶油酸与亚油酸含量 用标
准品绘制的标准曲线可得到：油酸，相关系数 r=：
0．99991，回归方程为 AR一1．95CR一0．0931；亚油
酸，相 关系数 r一0．99998，回归 方程为 AR一
1．49CR-0．0589。测出下列三种样品的峰面积，代
入上述公式，计算出 1株对照(未转化)烟草幼叶和
2株转基 因烟 草幼 苗幼 叶 的油酸 含量分 别为
0．087 、0．090 和 0．091 ，亚 油酸含 量分别 为
0．211 、0．198 和 0．192 。因此 ，转基因烟草幼
叶油酸含量 比对照增加 3．41 ～4．6 ，而亚油酸
含量却比对照减少 6．16 ～9 。
3 讨论
反义基因在调控果实成熟 、改良作物品质、获得
作物雄性不育系、改变植物花色、增强植物抗病性和
研究未知基因的功能等方面具有重要的作用(刘俊
杰等，2008)。利用反义基因技术进行植物高油育种
是当前国际上植物基因工程研究的热点之一。烟草
生长快，离体培养再生能力强，遗传转化效率高，因
此，很多克隆基因的功能鉴定都在转基因烟草中进
行(王全伟等，2008)。本研究结果表明，反义 2一
l基因转入且整合到烟草的基因组中，而且一定程
度上抑制了烟草 fad2-1基因的表达。但转基因表
达的水平受空间和时间的限制以及转基因组织特异
性表达及亚细胞定位限制了转基因在油料种子作物
中改变脂肪酸成分的操作。因此，选择合适的植物
启动子和改进其活性是增强外源基因表达首要考虑
的问题。本研究使用的植物载体中所含 CaMV35S